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檾檾檾檾檾檾檾檾殧殧殧殧进展评述
光学探针技术在分析化学中的若干研究进展陈娟1郭磊2唐吉军2徐华2谢剑炜2*（1喀什师范学院化学与环境科学系喀什844000；2军事医学科学院毒物药物研究所北京100850）陈娟女，30岁，硕士，从事药物分析及光学探针技术研究。*联系人，谢剑炜男，博士，研究员，博士生导师，
E-mail ：xiejw@bmi．ac．cn．国家自然科学基金项目（21175152）和国家科技重大专项“重大新药创制”项目（2012ZX09301003-
knowledge is power001-010）资助2013-04-25收稿，2013-09-06接受
摘要光学探针技术一直是分析化学研究中普遍使用的有效手段之一。其原理是通过光学物质与待测组分发生物理或化学作用，使其光学性质发生改变，并经光学方法检测，从而获得被测组分定性或定量的信息。本文概述了光学探针技术概况并对其在分析化学领域中应用的相关进展进行了综述，重点介绍了针对金属离子和生物大分子—蛋白质的光学探针技术的进展。关键词光学探针技术荧光磷光金属离子检测蛋白质检测Advances of Luminescent Probing Technique in Analytical Chemistry Chen Juan 1，Guo Lei 2，Tang Jijun 2，Xu Hua 2，Xie Jianwei 2*（1Department of Chemistry and Environmental Scienc学化妆怎么样
es ，Kashi Teaches College ，Kashi 844000；2Laboratory of Toxicant Analysis ，Academy of Military Medical Sciences ，Beijing 100850）Abstract Luminescent labeling or probing technique is one of the most efficient approaches in analytical chemistry and life science．Its principle is that the qualitative and quantitative information can be obtained from optical methods by measuring the alternation of some certain luminescent features ，which is bad on the physical or chemical reaction between luminescent matters and analytes．In this article ，we summarize recent progress of the applications of luminescent probing technique in the field of analytical chemistry ，and highlight the advances in the applications on the detectiong and analys of metal ions and proteins．Keywords Luminescent probing technique ，Fluorescence ，Phosphorescence ，Metal ion ，Protein 探针定义为一种只和某特异分子产生明显相互作用从而加以检测的分子。光学探针技术是利用光学探针与待测组分发生物理或化学相互作用，再经过光学方法检测该作用而获得被测组分定性或定量的信息，具有无放射性污染、分析物易于修饰标记、稳定性好、背景信号低、操作简单快速等优点，可用于离子、环境污染物、药物、核酸、蛋白质等多种物质的测定，是分析化学、生命科学、药学中的研究与应用热点之一。
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光学探针技术概述1.1
比色探针技术
比色探针技术是以生成有色化合物的显色反应为基础，通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法。选择适当的显色反应和控制好适宜的反应条件，是比色分析的关键。一般需要借助合适的显色试剂与靶分子发生颜色反应，再利用目视法或紫外分光光度法等检测手段进行分析测定。显色剂可以是一种或两种不同的试剂。比色探针技术的优点在于操作简便、快速，
适用于现场实时快速监测。例如，Miao 等［1］基于银纳米粒子（AgNPs ）与Cu 2+间的还原反应，发现当
Cu2+存在时，AgNPs粒径减小，而使溶液产生明显的颜色反应，且其他金属离子均不产生干扰，检测限（LOD）达到3.2ˑ10－5g/L。Li等［2］利用循环酶法信号扩增技术，基于金纳米粒子（AuNPs）与酶切前后DNA连接的颜色变化，实现了对凝血酶和腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）的测定，LOD分别为1.7ˑ10－5g/L和5.1ˑ10－5g/L。
Jiang等［3］基于烯丙氧基羰基遇钯后发生裂解反应而产生的颜色变化，通过比色法快速检测钯，其他金属元素均不产生干扰。Zhang等［4］利用G四聚体核酶作为分子标记物，设计了一种双功能寡核苷酸比色探针，其两端为凝血酶适配体和目标DNA互补链发夹结构，中间为G四聚体核酶和高铁血红素，当凝血酶或目标DNA存在时，适配体与凝血酶结合、或互补链与目标DNA结合，探针分子结构改
变，而使G四聚体核酶失去催化功能，颜色发生变化，由此可实现对DNA和蛋白质的特异性检测，DNA 和凝血酶的LOD分别为1.1ˑ10－3g/L和6.9ˑ10－3g/L。
1.2荧光探针技术
荧光探针指的是一类在紫外-可见-近红外区有特征荧光，并且其荧光性质（激发和发射波长、强度、寿命、偏振等）可随所处环境的性质，如极性、折射率、粘度等的改变而灵敏地改变的荧光性分子，其优点为较高的灵敏度和选择性、可无损检测等。
一般而言，无机化合物的荧光分析主要依赖于待测元素与有机试剂所形成的配合物的荧光进行测定。大多数药物及生物分子本身无荧光或荧光较弱、或荧光无明显选择性，检测灵敏度及特异性较差，将之以强荧光的标记试剂或荧光生成试剂进行标记或衍生，生成具有高荧光强度的共价或非共价结合的物质，则可使灵敏度或特异性大大提高。目前用于标记或衍生的荧光探针主要包括染料探针、稀土或配体荧光探针、过渡金属络合物、分子信标、荧光纳米粒子等，其中常用的荧光染料有邻苯二甲醛类、香豆素类、荧光素类、菁类、氟硼二吡咯类等化合物。例如，荧光胺试剂与伯胺类药物反应产生荧光，已成为药典中所载的分析检测方法。
20世纪末诞生的纳米材料———量子点（Quantum dots，QDs），是一类新型光学探针。三维受限的QDs是由半导体材料（通常由IIB-ⅥB或ⅢB-ⅤB族元素组成）制成的纳米粒子，其粒径小于或接近于
激子玻尔半径且稳定直径为2 20nm。它具有粒子尺寸小、比表面积大等结构特性，导致了量子尺寸效应和介电限域效应的产生，并由此派生出独特的热、磁、光、敏等特性和表面稳定性［5］。由于其电子和空穴被量子限域，连续能带变成具有分子特性的分立能级结构，因此QDs的光学行为与一些分子如多环芳烃类很相似，可以发射荧光。与传统有机荧光探针相比，QDs表现出独特而优良的发光特性，通过改变QDs的大小和组成，可使荧光颜色在近紫外到近红外之间变化。
Willard等［6］以具有核壳结构的CdSe-ZnS QDs与四甲基若丹明组成荧光共振能量转移（FＲET）对，成功应用于生物素化牛血清白蛋白与标记四甲基若丹明的链亲和素的相互作用研究；Yildiz等［7］以QDs为荧光探针，将上述原理应用于受体-底物相互作用的研究。汪海林等［8］使用QDs标记DNA加合物，实现了超高灵敏度的DNA加合物分析。2010年，Tan等［9］结合使用分子信标和QDs，发展了金属增强FEＲT技术，成功将FＲET这一“分子尺”的测量距离由原来1 10nm延伸到1 100nm尺度。
1.3磷光探针技术
磷光探针技术是一种利用磷光探针试剂的光物理和光化学特性，在分子水平上研究某些体系的物理、化学过程和检测某种环境材料的结构及物理性质的技术。与荧光发射相比，磷光处于长波长范围，其寿命较长，易于消除荧光背景及散射。用磷光探针分子标记生物体系或生物分子，测量其磷光发射特
性，如光谱位移、强度、寿命、量子产率等，即可得到微环境的相关信息。磷光探针分子对特定类型微环境较为敏锐［10］，如溶解氧的浓度、重原子、温度和样品溶液不纯都会直接影响室温磷光；利用此性质可以研究具有微弱自身荧光或不具有自身荧光的体系，如与生命现象有关的蛋白质、核酸、肿瘤、线粒体等［11］。
传统的磷光传感均以磷光有机分子作为探针，但条件一般较为严苛，如固体磷光法的检测体系需要固体基质，流体磷光法的检测体系需要加入除氧剂和诱导剂等。因此，发展新型的磷光探针分子具有重要价值。2007年，Snee等［12］首次发现了ZnSe/ZnMnS/ZnS QDs在水溶液中能发出磷光，预言这种非毒
性的QDs应可在化学/生物分析领域获得广泛应用。2008年起，南开大学严秀平课题组［13 19］合成、设计构建了一系列水溶性的Mn掺杂ZnS QDs和纳米复合材料，并应用于化学药物、DNA的检测，显示了该类QDs的应用潜力。
2光学探针技术在金属离子检测方面的应用
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金属离子的种类、浓度以及价态等性质直接决定了它们的功能以及对环境和生物体的作用。例如，钾盐、钠盐等是维持生物体电解质平衡和基本生理功能的必需离子；一些过渡金属等微量元素（如硒、锌、铁等）是维持生物体健康所必需的生命元素；重金属对环境造成的污染，继而造成的对人类健康
的危害已引起世界范围内的高度重视。因此金属离子的定性定量检测方法的发展十分迫切。与目前所主要采用的检测方法如原子光谱法、无机质谱法相比，光学探针技术具有快速、实时、灵敏度高的特点，其操作不需昂贵的仪器，为现场检测提供了现实可能性。近年来，基于一些纳米材料、功能分子等构建的各种检测传感体系受到重视。
2.1基于有机染料的金属离子光学传感
才德金属离子一般需借助于衍生化试剂（如，偶氮类试剂）来进行测定，还可与色谱法等联用以达到多种离子的分离。例如，司云森等［20］合成了新试剂2-（2-喹啉偶氮）-间苯二酚，实现了对铁、钴、镍、铜、锌、锰的有效衍生化检测。Mitra等［21］将葡萄糖胺与石脑油反应，合成了新化学探针1-（D-吡喃葡糖基-2'-脱氧-2'-亚氨基甲基）-2-羟基萘（L1），其在甲醇中可与Fe2+、Fe3+、Cu2+发生颜色反应，而在缓冲溶液体系中仅对Fe3+产生明显的颜色反应，其他金属离子不产生干扰，LOD达到2.8ˑ10－4g/L，通过电喷雾质谱还确证了L1与Fe3+反应生成复合物的结构。Tan等［22］利用两条多T寡核苷酸单链可与Hg2+形成T-Hg-T结构的特征，实现了缓冲液中Hg2+的检测，LOD达到1.0ˑ10－6g/L。
一般情况下，金属离子荧光传感器由离子载体和荧光基团两部分组成［23］。其中，离子载体可以选择性地识别底物，而荧光基团则定位于其附近来识别并传导引起的化学信号变化。申进波等［24］合
成了非对称、2-（6-氧代-6-氢-二苯基（c，e）＜1，2＞氧杂磷酰基）-1，4-二羟基苯的苯乙烯衍生物，它具有聚集诱导发光增强特性，并对不同类型的金属离子存在灵敏度差异，为构建新型金属离子荧光传感器提供了良好依据。另外，利用杯芳烃自身的三维立体结构和灵活多变的可以预组织化的衍生位点，可以设计和实现荧光受体单元的构筑。该类传感器对碱金属和碱土金属离子具有显著的识别能力，同时也被应用于识别过渡金属离子和重金属离子。
与荧光相比，磷光处于长波，寿命较长，易于消除荧光背景及散射。但目前将磷光探针技术应用于金属离子的检测分析仍较少，发展相对缓慢。李彬等［25］使1-溴-2-（3-丁烯基）萘和甲基丙烯酸发生共聚，得到粒径为（40ʃ10）nm的聚合物分子探针。该探针尺寸分布较均匀，在水溶液中可以产生较强的磷光信号，并且铜离子对磷光信号具有较好的选择性猝灭作用。除此以外，钯卟啉室温磷光探针也可用于重金属离子的检测。
2.2基于QDs的金属离子光学传感
金属离子猝灭QDs的发光机制主要分为4种，即内滤效应、非辐射结合通道、电子传输和离子绑定反应。Chen等［26］首次合成了水溶性的多磷酸盐、L-半胱氨酸以及巯基乙醇修饰QDs，可在水溶液中选择性检测Zn2+和Cu2+，LOD分别为5.2ˑ10－5和6.4ˑ10－5g/L。Zn2+可以使QDs的发射增强，主要归因于Zn2+激活了QDs的表面态；而Cu2+还原为Cu+是QDs发射强度减弱的原因。Fe3+的干扰则主要由于内滤效应所导致，可通过加入F－生成FeF63－来消除。
bichLeblanc等［27］合成了多肽修饰的CdS QDs，用于测定Cu2+和Ag+。Isarov等［28］在异丙醇中，通过加入高氯酸铜将Cu2+绑定到CdS QDs的表面，使得QDs产生较多的非辐射电子空穴，因而猝灭其荧光，据此制作了测定有机溶液中Cu2+的化学传感器。其他研究组也分别用巯基乙烷磺酸、BSA、巯基乙酸修饰的QDs，建立了测定Cu2+的高选择性和高灵敏度荧光淬灭新方法［29 31］。
基于QDs的磷光探针在金属离子检测方面，谢剑炜课题组［32］利用水溶性Mn掺杂ZnS QDs建立了室温磷光体系选择性检测Pb2+的高通量方法，Pb2+的LOD为8.3ˑ10－6g/L，还适用于血铅测定。吕诗
言等［33］基于CdTe包覆的Mn掺杂ZnS QDs建立了检测水体中超痕量Hg2+的磷光方法。
dairy是什么意思2.3基于功能核酸的金属离子光学传感
脱氧核酶是经过指数富集配基的系统进化（Systematic Evolution of Ligand by EXponential enrichment，SELEX）筛选出来的一种具有催化功能的单链DNA片段［34］，具有高效的催化活性和结构识别能力。分为具有切割活性、金属螯合、过氧化物酶活性等几类。大多数脱氧核酶具有金属离子依赖性，只有在特定金属离子存在时才表现出催化活性。
脱氧核酶的出现，为金属离子检测提供了更多的识别模式，Zhou等［35］设计的基于G-四聚体的过氧化物酶活性脱氧核酶，利用Ag+可稳定C-C间错配的碱基而形成C-Ag+-C结构的特点，Ag+存在时该脱
氧核酶分子内双链解开，形成的G四聚体高级结构结合血红素激活该脱氧核酶，催化相应的显色反应，实现Ag+的高选择性定量测定，其LOD达到6.8ˑ10－7g/L。Zuo等［36］将Cu2+或Pb2+依赖的脱氧核酶及其对应的DNA结合后，固定于乙醛包覆的载体上，当Cu2+或Pb2+加入此体系中，相应的脱氧核酶就被激活而促使DNA自剪切反应的发生，从而荧光强度明显改变，Cu2+和Pb2+的LOD分别为6.0ˑ10－7g/L和2.0ˑ10－6g/L，其他金属离子不干扰此传感体系的测定。
3光学探针技术在蛋白质检测方面的应用
蛋白质是生命的物质基础。蛋白质的高灵敏度检测、识别与相互作用技术的发展，一直是蛋白质研究领域的重点之一。由于蛋白质种类和数量众多，结构和性能各异，针对不同的蛋白质，需根据蛋白质自身的特征，利用其具有的配体-受体、酶-底物、抗原-抗体、糖基-凝集素等一种或多种特异性识别作用，设计高灵敏度高选择性的光学探针传感体系。其中，基于纳米材料和功能化核酸分子—适配体型荧光探针的蛋白质光学传感体系以其灵敏度高、选择性强、设计方式多样化等特点，成为目前的发展热点。
3.1基于有机染料的蛋白质光学传感
Li等［37］在一条可被成纤维激活蛋白α裂解的短肽链首末端构建FＲET对，仅有成纤维激活蛋白α存在时，肽链裂解而暴露Cy5.5染料，产生明显的荧光信号，从而用于成纤维激活蛋白α体内和体外成像
研究。Jutta等［38］在蛋白质分子成像研究中，比较了不同菁类染料连接IgG的荧光特性，发现染料亲水性、聚集作用及FＲET特性等均为主要的影响因素。汪海林等［39］以荧光标记损伤DNA，发现针对一种DNA修复酶，DNA缠绕可引起相关的非分子量依赖的高荧光偏振响应，揭示了DNA修复机器可识别多种不同化学结构DNA损伤的机制。另外，聚合物类有机染料可与蛋白质结合形成荧光共轭聚合物，可以用于生物大分子作用机制及体内外光学成像等领域的研究。
3.2基于纳米材料的蛋白质光学传感体系
纳米材料制备技术、表面修饰技术的发展大大推动了蛋白质识别及传感技术的发展，新型光学探针如AuNPs、QDs等在免疫传感方面已逐渐得到应用。例如，AuNPs表面功能化的光学探针，基于AuNPs 之间的聚集/解聚所表现的不同颜色，可通过比色法实现蛋白质的快速检测［40，41］。Vidya等［42］用苯乙胺对AuNPs表面进行修饰后，表现出对C-激活蛋白的高度亲和性，当C-激活蛋白连接到AuNPs表面上时，其溶液颜色发生明显变化，荧光强度随着蛋白浓度的增加逐渐降低并发生相应吸收波长的红移，当蛋白浓度增至4.3ˑ10－4g/L时，AuNPs产生团聚，该法已成功地应用于人血浆中C-激活蛋白的检测，白蛋白不干扰其检测，LOD为5.0ˑ10－5g/L，这与基于免疫反应的浊度法测定结果相当。Nie等［43］、Goldman等［44，45］将QDs与IgG偶联后，用于蛋白质、小分子化合物的荧光免疫分析、配体与受体相互作用及细胞成像的研究。结合新型技术如免疫聚合酶链扩增（PCＲ）、免疫滚环扩增、基于纳米粒子的生物条形码分析等，还可有效提高方法的灵敏度。
利用QDs控制其粒径使其在长波（650 900nm）方向发射荧光，可避免复杂基质的内源性荧光干扰的性质，可将此类型的QDs修饰功能配基，进行蛋白质细胞原位成像，对蛋白质进行原位检测及进行体内真实环境功能研究等。Jaiswal等［46］将QDs与抗体连接后再与活细胞在37ħ共同培养，QDs通过内吞作用进入细胞，并且交联抗生物素蛋白的QDs能够进入生物素化的细胞。进入细胞的QDs不影响细胞的形态和生长，培养12d后还可观察到细胞内的QDs荧光。这些结果为研究活细胞的信号传递及其
summary怎么写分子机制开辟了新途径。
3.3基于功能核酸的蛋白质光学传感体系
核酸适配体是通过SELEX［47］筛选得到的寡核苷酸分子，通常为ＲNA或单链DNA（ssDNA），理论上，对于特定的目标分子，总能找到一种或多种与之特异性结合的适配体，因此大大拓宽了应用领域，被认为是生物传感器最理想的识别元件之一。对于很多蛋白质，可以针对蛋白质的不同功能位点筛选和设计出特异的适配体，其与靶分子的识别机制与抗体极为相似，但适配体具有核酸自身稳定性强、变性复性快速可逆、易功能化修饰与标记及作为优良的纳米器件等诸多优点。因此，基于适配体构建化学或生物探针有望在一定范围内代替抗体，在蛋白质检测、细胞成像及分子识别研究等诸多生物分析领域发挥重要作用。构建适配体光学探针检测蛋白质，即将适配体-蛋白质间的特异性识别信号
转化为光学信号。Tang等［48］利用生物素标记适配体与靶蛋白结合后，用连接有cDNA模板的互补引物链与其结合，通过滚环扩增反应，发展出来的血小板生长因子B的比色检测方法具有快速、专属性强、灵敏度高的特点。Wu等［49］利用适配体和适配体-靶蛋白复合物与AuNPs结合产生不同结构的复合物而颜色发生变化的原理，为IgE等蛋白质的快速检测提供技术支撑。记叙文的顺序
适配体荧光探针主要包括单荧光共价修饰型、双荧光共价修饰型和非共价修饰型。单与双荧光修饰型探针的主要区别在于，前者是将适配体共价修饰单个荧光基团后直接作为示踪分子，用于靶分子的直接（间接）检测或阐述其相互间作用方式；而后者则主要基于双荧光基团共价修饰后，形成FＲET、静态猝灭模式和二聚体，从而使荧光强度、荧光寿命、荧光各向异性值等发生变化，用于靶蛋白的定量测定或功能研究，如进行蛋白质相互作用研究及酶活性测定等［50］。谢剑炜课题组［51，52］先后发展了基于AuNPs的适配体荧光“增敏型”传感新体系及基于QDs-AuNPs的FＲET的适配体荧光“增敏型”传感新体系，对于重组人促红细胞生成素-α的LOD可达到10－8g/L水平。
基于荧光修饰型适配体构建的传感体系，大多需利用适配体功能化修饰传感器基底材料或对适配体进行共价修饰荧光基团或纳米材料，其中存在的最主要问题是不可避免地造成了适配体探针与蛋白质间亲和力的损失或下降。2003年开始发展的嵌入式荧光染料的非共价标记模式，为非标记型适配体荧光探针构建提供了更为新型、简便的可选策略［53 56］。虽然适配体是单链DNA或ＲNA，但适配体对靶蛋白进行特异性识别时，通常会通过部分碱基配对后，折叠形成一定的三维结构，从而使非共价嵌
入荧光染料并导致发光行为的显著变化而实现传感成为可能。此类非共价式荧光染料包括溴化乙锭（EB）、联吡啶钌、噻唑橙（TO）、噁唑黄（YO）系列的菁染料等，它们在游离态（未与核酸结合）时不发荧光，但与核酸结合后荧光显著增强，从而避免了染料自身的荧光干扰，有效提高了检测灵敏度，减少了标记过程中除去染料的复杂步骤。与现有的其他荧光标记试剂如若丹明、荧光素等相比，它们更具优越性［57］。其中菁类染料的应用有扩大趋势。
Li等［55］利用EB非共价修饰构建适配体分子开关，对凝血酶定量检测，LOD达9.4ˑ10－4g/L。谢剑炜课题组［54］也基于钌（II）多吡啶类配合物（［Ｒu（phen）2（dppz）］2+）及相思子毒素适配体，实现了相思子毒素的定量检测，LOD达6.1ˑ10－5g/L，并成功应用于稀释血清样品的测定；还利用核酸嵌入式菁类染料BOBO-3考察并构建了基于ssDNA适配体的凝血酶非共价荧光传感体系［58］。Zhou等［59］利用菁类染料TOTO构建的适配体荧光探针，对PDGF-BB的灵敏度均优于［Ｒu（phen）2（dppz）］2+。Volkova 等［60］通过研究各种菁类染料与蛋白质的结合，发现菁类染料T-49和SH-516对于β-乳球蛋白有高的选择性和灵敏度。
Chen等［61］利用核酸非共价结合型染料SYBＲGreen构建了一种连接蛋白的DNA荧光探针，其原理基于DNA5’末端设计含有蛋白质连接位点，而3’末端有5个突起碱基用于保护DNA不受核酸外切酶III的降解，当靶蛋白存在时，其与此荧光染料探针结合从而避免了DNA降解，并使DNA结构发生改变而荧光增强，从而对靶蛋白如细胞转移因子NF-κB等进行测定，及进行其与DNA相互作用的亲和力研究，高一期中考试
外语培训班对疾病诊断、药物发现等研究具有潜在的应用参考价值。
此外，若巧妙结合PCＲ、滚环扩增过程，还可对荧光信号变化实现级数扩增，进一步提高蛋白质检测的灵敏度。谢剑炜课题组［62 63］结合实时定量PCＲ过程，利用磁纳米粒子构建了基于ssDNA适配体
