网络出版时间：2017-05-22 10:58:40
网络出版地址：knski/kcms/detail/45.1369.Q.20170522.1058.002.html
研究报告
Rearch Report
十字花科黑腐病菌一个编码FhrR蛋白的基因功能分析
王凛1,2李光华1杨丽超1姜伯乐1,3*
1广西大学生命科学与技术学院，南宁,530004;2桂林医学院生物技术学院，桂林,541004;3亚热带农业生物
资源保护与利用国家重点实验室，南宁,530004
*通讯作者,jbl1971@gxu.edu
摘要十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)的RpfC/RpfG双组
分系统感应DSF(diffusible signal factor)因子并通过二级信使环二鸟苷酸(c-di-GMP)调控下
游Clp、Zur和FhrR等全局性转录因子。为进一步研究FhrR在Xcc中的调控作用，本研究
构建了编码FhrR蛋白的XC3027基因的整合突变体PK3027。植株试验表明PK3027突变对
致病力和过敏(HR)反应没有影响。将连有hrpG、hrpX、hrpB、hrcU和hrpF启动子的pL6GUS
报告质粒导入PK3027中，在XCM培养基中检测gus报告基因表达，结果表明XC3027对
这些hrp基因的表达没有影响。表达纯化FhrR蛋白后进行了凝胶阻滞实验，发现该转录调
控蛋白不能直接与hrpX启动子结合。在Xcc8004中FhrR不参与III型分泌系统相关基因的
调控并与病原菌致病无关。
关键词十字花科黑腐病菌,rpf/DSF系统,III型分泌系统,FhrR
Functional Analysis of the Gene Encoding FhrR Protein in
Xanthomonas campestris pv.Campestris
Wang Lin1,2Li Guanghua1Yang Lichao1Jiang Bole1,3*
1College of Life Sciences,Guangxi University,Nanning,530004;2College of Biotechnology,Guilin Medical
University,Guilin,541004;3State Key Laboratory for Conrvation and Utilization of Subtropical
Agro-bioresources,Nanning,530004
*Corresponding author,jbl1971@gxu.edu
Abstract In Xanthomonas campestris pv.campestris(Xcc),the two-component signal
transduction system rpf/DSF percepts DSF(diffusible signal factor)signal and modulates the
downstream DSF regulon such as Clp,Zur and FhrR by changing the cond mesnger cyclic
di-GMP(c-di-GMP).For further characterization of FhrR function,we constructed the integration
mutant of XC3027which encodes FhrR protein in Xcc8004,generated PK3027.The mutant
PK3027didn’t affect virulence and hypernsitive reaction(HR)significantly by plant assay.
The reporter plasmid pL6GUS carrying the promoter of hrpG,hrpX,hrpB,hrcU,and hrpF were
transferred into PK3027,respectively.The GUS enzyme activities were measured in the XCM
medium.The results indicated that XC3027did not affect the expression of the hrp genes.In
addition,the electrophoresis mobility shift assay(EMSA)indicated that FhrR protein didn’t bindspa什么意思
to the promoter of hrpX gene directly.In conclusion,the FhrR did not regulate the hrp genes and
not contribute to the virulence in Xcc8004.
Keywords Xcc,rpf/DSF system,T3SS,FhrR
十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)作为研究微生物与植物相互作用分子机理的模式细菌，能在全世界范围内引起所有十字花科植物的黑腐病。
基金项目：本研究由广西自然科学基金项目(2014GXNSFFA118005,2013GXNSFBA019088)和国家自然科学
基金项目(31260443)共同资助
(Williams,1980;Chan and Goodwin,1999)。hrp基因编码的III型分泌系统将大量效应蛋白分泌进入宿主
细胞，与寄主植物发生分子互作，从而引起植物致病或过敏反应，是大多数植物病原细菌侵染寄主植物的主要机制之一(He,1998)。hrp基因受诱导表达，在丰富培养基上hrp基因表达水平极低，而在植物细胞内或基础培养基上则被激活表达。III型分泌系统的调控机制一直是植物病原菌致病分子机理研究的重要内容，有助于我们深入理解细菌致病机理并进行生物防治(Alfano et al.,2000;Jiang et al.,2008)。
群体感应(quorum nsing)是微生物群体细胞间通过信号传递来控制生理行为的调控机制(Visick et al.,2000)，细菌通过感应群体信号分子的阈值感知自身群体的密度并通过调节特定的生物学功能来应对群体密度的变化(Miller and Bassler,2001)。黄单胞菌属病原菌感应的信号是一种被称为可扩散信号因子(diffusible signal factor,DSF)的顺-11-甲基-2-十二烯酸(cis-△2-11-methyl-dodecenoic acid)的脂肪酸衍生物(Wang et al.,2004)。Rpf(regulation of pathogenicity factors)基因簇参与合成并感应胞间信号DSF(diffusible signal factor)，其中rpfF 负责通过脂肪酸代谢合成信号因子DSF，rpfC/rpfG分则分别编码感受蛋白和调节蛋白组成双组份调控系统(Ryan et al.,2006)。DSF的信号传导是通过RpfG的介导与第二信使c-di-GMP相偶联，进而启动下游转录调控因子调控更大范围内基因的转录。He等(2007)通过全基因组寡核苷酸芯片分析，鉴定了299个受Xcc XC1Clp调控的基因。这些基因的功能包括胞外酶和胞外多糖的产生、病原菌抗药性和解毒功能、铁吸收和三羧酸循环，以及鞭毛合成等。还发现Clp调控2个游转录因子FhrR和Zur的转录，Clp通过FhrR和Zur间接调控更多基因的表达。转录组学数据初步显
示FhrR可能参与调控鞭毛合成、超敏反应等作用并负调控hrpB5、hrpD5、hrcR、hrpW、hpaP、hrpB2和hrpB7等hrp基因，这些数据还有待进一步实验数据的支持(He et al.,2007)。
为确定Xcc8004中的FhrR蛋白是否真实调控hrp基因表达并与致病性相关，本研究利用自杀质粒pK18mob对Xcc8004菌株中编码FhrR蛋白的XC3027基因进行了突变。通过植株实验的方法检测突变体的致病性和过敏反应(HR)；通过构建gus报告系统检测XC3027基因突变对hrp基因的表达调控。表达纯化FhrR蛋白与hrpX的启动子区DNA序列进行了凝胶阻滞实验。研究进一步鉴定了FhrR蛋白对hrp基因的调控作用，对十字花科黑腐病菌的致病机理进行了进一步的探索。
1结果与分析
1.1XC3027的生物信息学分析
XC3027基因全长627bp，编码产物是注释为转录调控因子的FhrR蛋白。XC3027的基因序列在Xca(Xanthomonas campestris pv.campestris B100)和Xcc(Xanthomonas campestris pv.campestris ATCC33913)中都有同源基因，在豆科植物根瘤菌弗兰克氏菌(Frankia sp. EAN1pec)以及环境微生物红球菌(Rhodococcus sp.RHA1)中也有同源序列。XC3027基因在全基因组上的位置如图1所示。
图1XC3027在基因组上的位置
Figure1The position of XC3027in genome
在蛋白质序列分析上，用蛋白质信息分析网站bl-heidelberg.de以及NCBI 资源库的Blastp系统对XC3027基因所编码的蛋白FhrR进行了结构域分析(图2)，在au.expasy/tools/pi_tool.html上进行了FhrR蛋白的PI值和MW值的预测。发现FhrR 蛋白中包含了一个TetR-N蛋白结构域，该结构域的拓扑结构是螺旋-转角-螺旋，其功能被注释为DNA结合域，在转录调控中起关键作用(图2)。信息学分析FhrR蛋白的等电点pI=5.48，蛋白分子质量Mw=22352.21。
图2利用Blastp分析FhrR蛋白结构域
Figure2Analysis the domain of FhrR protein in Blastp
1.2XC3027整合突变体与互补菌株的构建
本实验室已经构建了中间体质粒PK3027，测序结果表明质粒中克隆的XC3027基因内侧DNA序列完全正确。以三亲接合方式导入到Xcc8004中，通过在含Rif和Km抗性的平板上筛选出发生同源单交换的突变体。三亲接合子经PCR验证后，得到整合突变体为PK3027。
提取Xcc8004总DNA作为模板，以CPK3027-F/CPK3027-R为引物进行PCR反应扩增XC3027基因全长片段。纯化的PCR产物经Eco R I/Bam H I双酶切后克隆到穿梭质粒pLAFR3上，获得重组质粒pLJ3027。通过三亲接合将重组质粒pLJ3027导入整合突变体PK3027，用Rif+Km+Tc3种抗生素在丰富培养基上筛选三亲接合子。提取质粒用Eco R I/Bam H I双酶切验证(结果未显示)接合子，得到PK3027的互补菌株CPK3027。
1.3致病性与HR
采用剪叶接种法对野生型菌株Xcc8004、突变体PK3027和互补菌株CPK3027进行致
病性检测。测量病斑长度并进行统计分析，结果显示野生型、突变体和互补菌株之间致病
力无显著差异(图3)，表明XC3027突变不影响Xcc8004菌株的致病力。
certain的用法图3PK3027的致病性检测
Figure3Virulence analysis of PK3027
以Xcc8004野生型为正对照，以8004∆hrcV突变体为负对照，对PK3027和CPK3027进行过敏反应检测，浓度接种OD600=0.01。压渗接种后12h后发现野生型、突变体和互补菌株同时出现HR反应的枯斑。表明XC3027突变不影响Xcc8004菌株的致病力在辣椒ECW-10R上的过敏反应(图4)。
1.4GUS酶活检测
将连有hrpG、hrpX、hrpB、hrpF和hrcU基因启动子的GUS报告质粒通过三亲接合，分别导入到整合突变体PK3027和野生型菌株Xcc8004中。在hrp诱导培养基XCM中，检测GUS表达量。结果发现XC3027基因对hrpG、hrpX、hrpB、hrpF和hrcU基因无明显调控作用(图5)。
1.5FhrR蛋白的诱导与纯化
扩增XC3027基因的全长片段克隆至pET30a载体，获得重组质粒pET3027，将重组质粒导入宿主BL21(DE3)中得到蛋白表达菌株BL21(DE3)/pET3027。经IPTG诱导后FhrR蛋白大量存在于菌体裂解后的上清液中，经镍柱纯化后得到蛋白FhrR(图6)。
图4PK3027过敏性检测
Figure 4HR test of PK3027
注:1:Xcc
8004;2:PK3027;3:CPK3027;4:8004∆hrcV
Note:1:Xcc 8004;2:PK3027;3:CPK3027;4:8004∆hrcV
图5Xcc 8004和PK3027中的GUS 检测
Figure 5GUS analysis in Xcc 8004and PK3027
脚本是什么意思
图6FhrR 蛋白的诱导与纯化
注:M：蛋白Marker;1：纯化后的FhrR 蛋白;2,3:BL21(DE3)/pET30a 细胞破碎液;4:BL21(DE3)/pET3027细胞破碎液
Figure 6The induction and purification of FhrR
Note:M:Protein Marker;1:Purified FhrR protein;2,3:BL21(DE3)/pET30a lysate;4:BL21(DE3)/pET3027lysate
14.4kD
14.4kD
45.0kD
35.0kD
25.0kD
18.4kD
116.0kD
1.6FhrR蛋白与hrpX基因启动子的结合鉴定
PCR扩增hrpX基因ATG前347bp的启动子区片段并用生物素标记，再与纯化的FhrR 蛋白进行凝胶阻滞实验(EMSA)，以本实验室表达的HpaR蛋白为正对照。EMSA实验结果表明，FhrR蛋白注释有一个Tet
R的DNA结合域，但EMSA实验未检测到与FhrR蛋白hrpX 基因启动子区DNA直接结合，而作为正对照的HpaR蛋白则能与hrpX基因启动子区相结合(图7)。
图7EMSA分析FhrR蛋白与hrpX基因启动子区结合
注：各泳道都加入了1μL生物素标记后的hrpX启动子DNA.M：不含FhrR蛋白的对照;1：含230ng FhrR 蛋白;2：含346ng FhrR蛋白;3：含588ng FhrR蛋白;4：含778ng FhrR蛋白;5：含1167ng FhrR蛋白;6：含1750ng FhrR蛋白;7：含112ng HpaR蛋白;8：含224ng HpaR蛋白;9：含448ng HpaR蛋白
Figure7EMSA analysis of FhrR binding to hrpX promoter
Note:1μL biotin-hrpX promoter DNA was added to each lane.M:Control free with protein;1:With230ng
FhrR protein;2:With346ng FhrR protein;3:With588ng FhrR protein;4:With778ng FhrR protein;5:With1167ng FhrR protein;6:With1750ng FhrR protein;7:With112ng HpaR protein;8:With224ng HpaR protein;9:With 448ng HpaR protein
2讨论
在Xcc关于rpfF、rpfC、rpfG和clp的报道中表明这4个基因正调控胞外多糖、胞外蛋白酶和胞外纤维素酶这几种致病因子的表达(Tang et al.,1991)。我们的研究发现，在rpfC和clp的缺失突变体中，hrpB基因的表达都出现了下降的情况。因此，可以表明rpfC和clp正调控hrpB 基因的表达(数据未发表)。而He等(2007)发现在十字花科黑腐病菌中，rpfC和rpfG所编码的双组份系统下游有Clp、Zur和FhrR3个转录调控因子。clp编码与环腺苷酸(cAMP)受体蛋白同源的受体蛋白，该受体蛋白为第二信使c-di-GMP的受体，Clp蛋白活性受c-di-GMP浓度调节。
生物信息学分析发现编码FhrR蛋白的XC3027上下游基因都与该基因的转录方向相反且都有间隔区，因此该基因的整合突变不会引起下游基因的极性效应。构建XC3027整合突变体可用于该基因功能的初步研究。在本研究中，利用构建的XC3027基因的整合突变体进行了相关检测，以鉴定FhrR蛋白是否对hrp基因有调控作用。GUS报告质粒酶活测定和RT-PCR检测结果未能发现FhrR对hrp基因的表达有影响。而在致病性和HR检测中，发现突变体、野生型和互补菌的表型没有差别。用纯化后的FhrR
蛋白与hrpX基因的启动子区进行了EMSA实验，也未发现直接结合现象。He等(2007)在黄单胞菌属菌株XC1的报道中，转录组结果显示FhrR负调控部分hrp基因，而且被推测为Clp转录调控因子激活的下游转录调控子。而在本研究中，多种实验方法均未能发现FhrR对编码III型分泌系统的hrp基因具有调控作用。
我们因此可以推测在Xcc8004中，Clp转录调控子可能直接调控hrp基因或通过其他途径间接调控hrp基因表达。FhrR对hrp基因没有调控作用，与病原菌致病性无关。
3材料与方法
3.1菌株、质粒及培养条件
本研究使用的菌株和质粒见表1。Xcc8004在丰富NYG培养基和基本培养基XCM中28℃培养(Daniels et al.,1984)。大肠杆菌(Escherichia coli)在LB培养基中，温度37℃下培养
(Miller,1972)。抗生素Ampicillin(Amp)、Chloramphenicol(Cm)、Kanamycin(Km)、Rifampicin (Rif)、Spectinomycin(Spc)和Tetracycline(Tc)的使用参见文献(岑卫健,2015)。
表1本研究所用的菌株和质粒
day by day什么意思Table1Bacterial strains and plasmids in the study
菌株和质粒Strains or plasmids 特征
Relevant characteristics
来源或参考文献
Source reference
菌株
Strains
大肠杆菌Escherichia coli
BL21(DE3)原核蛋白表达菌株
Prokaryotic expression strain，Cm r 本实验室Laboratory collection
ED8676/pRK2073包含pRK2073质粒的三亲结合帮助菌株
Helper strain containing pRK2073,recA met,Spc r 本实验室Laboratory collection
青及
BL21(DE3)/pET3027BL21(DE3)含有pET3027表达载体
BL21(DE3)containing pET3027,Kan r 本研究This work
dance怎么读黄单胞菌Xanthomonas campestris pv.campestris
8004Xcc8004野生型菌株
Wild type,Rif r
本实验室
Laboratory
collection
PK30278004XC3027整合突变体
XC3027pK18mob integration mutant of8004,Rif r,Kan r 本研究This work
CPK3027PK3027的互补菌株
Complementary strain of PK3027,Rif r,Kan r,Tc r 本研究This work
8004∆hrcV 8004hrcV缺失突变体
hrcV deletion mutant of8004,Rif r,Kan r
本实验室
Laboratory
collection
8004/pLGUShrpB 8004含有pLGUShrpB
8004harboring pLGUShrpB,Rif r,Kan r,Tc r
施工现场管理制度
本研究
This work
8004/pLGUShrpG 8004带有pLGUShrpG质粒
8004harboring pLGUShrpG,Rif r,Kan r,Tc r
本研究
This work
only hope8004/pLGUShrpX8004带有pLGUShrpX质粒
8004harboring pLGUShrpX,Rif r,Kan r,Tc r 本研究This work
8004/pLGUShrcU8004带有pLGUShrcU质粒
8004harboring pLGUShrcU,Rif r,Kan r,Tc r 本研究This work
8004/pLGUShrpF8004带有pLGUShrpF质粒
8004harboring pLGUShrpF,Rif r,Kan r,Tc r 本研究This work
PK3027/pLGUShrpB PK3027含有pLGUShrpB
PK3027harboring pLGUShrpB,Rif r,Kan r,Tc r 本研究This work
PK3027/pLGUShrpG PK3027含有pLGUShrpG
PK3027harboring pLGUShrpG,Rif r,Kan r,Tc r 本研究This work
PK3027/pLGUShrpX PK3027含有pLGUShrpX
限制英语
PK3027harboring pLGUShrpX,Rif r,Kan r,Tc r 本研究This work
PK3027/pLGUShrcU PK3027含有pLGUShrcU
PK3027harboring pLGUShrcU,Rif r,Kan r,Tc r
本研究
This work
PK3027/pLGUShrpF PK3027含有pLGUShrpFcretary是什么意思
PK3027harboring pLGUShrpF,Rifr,Kanr,Tcr 本研究This work
质粒Plasmids
pK18mob Xcc自杀质粒
Suicide plasmid in Xcc,Tra-,Mob+,Kan r
本实验室
Laboratory
collection
pK3027pK18mob带有XC3027内侧序列
pK18mob harboring internal fragment of XC3027,Kan r
本实验室
Laboratory
collection
