甘南尕海草原毛虫肠道细菌群落结构分析
王金昌;曾小琴;占智高;关丽梅;靳亮
【摘 要】为探讨了甘南尕海自然保护区草原毛虫(Gynaephora aureate Ghou et Ying)肠道细菌群落结构组成,采集甘南尕海高寒草地3个不同地点的4龄草原毛虫幼虫,通过Illumina HiSeq高通量测序平台对甘南尕海自然保护区草原毛虫肠道细菌群落结构组成进行分析,总共获得了206098条序列.甘南尕海草原毛虫中肠的细菌由Proteobacteria(变形菌门)、Bacteroidetes(拟杆菌门)、Firmicutes(厚壁菌门)、Actinobacteria(放线菌门)、Tenericutes(软壁菌门)、Verrucomicrobia(疣微菌门)、Fusobacteria(梭杆菌门)、Acidobacteria(酸杆菌)、Deino-coccus-Thermus(异常球菌-栖热菌门)和Planctomycetes(浮霉菌门)等10个门组成,优势菌群为Proteobacteria和Bacteroidetes.在属的水平上,Providencia(普罗威登斯菌)含量最丰富,其次是Brevundimonas(单胞菌属)、Bacteroides(拟杆菌属)和Methylotenera(甲基柔膜菌属).阐明了甘南尕海草原毛虫肠道细菌群落的组成,为研究草原毛虫肠道微生物和草原毛虫对人畜的危害提供理论基础.
【期刊名称】《江西科学》angella
【年(卷),期】2017(035)001
【总页数】单词翻译7页(P5-11)
【关键词】英语在线翻译网站甘南尕海;草原毛虫;肠道微生物;高通量测序
【作 者】王金昌;曾小琴;占智高;关丽梅;靳亮
【作者单位】江西省科学院微生物研究所,330096,南昌;抚州洋洲中心小学,344000,江西,抚州;江西省科学院微生物研究所,330096,南昌;江西省科学院微生物研究所,330096,南昌;江西省科学院微生物研究所,330096,南昌
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【正文语种】中 文
【中图分类】S567.35
justonelastdance中文歌词>parting草原毛虫为我国高原牧区的重要害虫，别名红头黑毛虫、草原毒蛾，属于鳞翅目、毒蛾科[1]。全球共有15种草原毛虫，主要分布在极地和高寒地带[2-3]。其中，青藏高原地区有8种草原毛虫，是青藏高原上主要的牧草害虫，该虫与草原鼠害和牛羊寄生虫害并列为草原
三大害[4-5]。草原毛虫不仅分布范围广(超过200万/hm2)、发生密度高(通常200～500头/m2，最高虫口密度达3 000头/m2)[6]，草原毛虫主要为害莎草科、禾本科、豆科、蓼科、蔷薇科等各类牧草，草原毛虫爆发时危害严重，将牧草的大部分茎叶吃光，只剩下枯枝残叶，影响牧草生长，造成草原缺草，从而严重地影响妨碍畜牧业的发展[7]。草原毛虫不仅危害牧草，而且对人畜也有一定的影响，其体毛和茧毛有剧毒，牛羊采食了带虫或茧的牧草，会引起口腔粘膜红肿，发生小泡，齿根或舌头糜烂等[8-9]。
本文以甘南尕海草原毛虫(Gynaephora aureate Ghou et Ying)中肠样品为材料，采用了Illumina HiSeq高通量测序技术，利用分析软件Microbial-JL对甘南尕海草原毛虫中肠的细菌多样性进行了初步分析和比较，为研究草原毛虫的对高原环境的适应性，开发生防菌对草原毛虫进行生物防治提供基础资料。
1.1 采样地点
甘肃尕海(海拔高度3 500 m；地理坐标为北纬N33°58′12″～34°32′16″，东经E102°05′00″～102°47′39″)。
1.2 供试草原毛虫幼虫
尕海高寒草地采集的4龄草原毛虫幼虫。
1.3 引物序列
本实验使用的上、下游引物为细菌通用引物[10]，由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列如下：338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′；806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。通过上述引物扩增获得细菌16S rRNA基因的V3+V4区域。
1.4 试剂和仪器
T100PCR仪(BIO-RAD公司)；DNA提取试剂盒和DNA胶回收试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)。
2.1 解剖草原毛虫取其中肠
将采集的草原毛虫放入75%的酒精中浸泡1 min，用无菌水洗涤3遍，沥干，用镊子取其中肠后研磨，收集研磨液用以肠道微生物多样性的鉴定。
2.2 DNA抽提
草原毛虫取其中肠DNA的提取采用DNA提取试剂盒提取，操作见说明书；完成基因组DNA抽提后，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA。
2.3 16s rRNA基因的PCR扩增
按16SV4测序区域，采用通用引物338F和806R扩增土壤细菌16S rRNA基因。20 μL的PCR反应体系：5×PCR buffer (with Mg2+)，2 μL；2.5 mM dNTP，1 μL；5 μM P1(338F)，0.5 μL；5 μM
P2(806R)，0.5 μL；5 U/μL Taq酶，0.5 μL；DNA模板，1 μL；ddH2O，14.5 μL；PCR反应程序如下：95 °C 3 min；95 °C 30 s，55 °C 30 s，72 °C 45 s，30个循环；72 °C 10 min；10 °C 10 min；割胶回收PCR电泳产物。
2.4 Illumina Miq PE250/PE300上机测序
使用TBS-380荧光计对PCR产物进行定量并均一化混匀，构建MiSeq文库，然后用Illumina MiSeq PE250/PE300上机测序。该测序工作是由上海美吉生物医药科技有限公司完成。
2.5 分析软件Microbial-JL
利用分析软件Microbial-JL对测序结果进行分析。
3.1 16s rRNA基因的PCR扩增
s cute16S rRNA基因的PCR扩增结果见图1，PCR产物目的条带大小正确，总量满足2次或者2次以上建库需要，可进行后续建库。英语六级分数分配
3.2 草原毛虫3个中肠样品测序结果及取样深度验证
表1为3个样品的统计数据，样品GaCeY的有效序列为37 640条，检测总碱基数为16 455 496
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第4bp，序列平均长度为437.18 bp。样品GS1的有效序列为38 603条，检测总碱基数为16 768 723 bp，序列平均长度为434.39 bp。样品GS2的有效序列为31 853条，检测总碱基数为13 801 021 bp，序列平均长度为433.27 bp。从3个中肠样品的Coverage来看，3个样品的覆盖率分别达到99.8%，99.6%和99.6%，能够反映样品菌群的整体情况。
3.3 物种多样性曲线
稀释曲线(Rarefaction Curve)和等级聚类曲线(Rank Abundance)是常见的描述组内样品多样性的曲线。稀释曲线，是从样品中随机抽取一定测序量的数据，统计它们所代表物种数目，即OTUs(Operational Taxonomic Units)数目，以抽取的测序数据量与对应的物种数来构建曲线。稀释曲线可直接反映测序数据量的合理性，并间接反映样品中物种的丰富程度，当曲线趋向平坦时，说明测序数据量渐进合理，更多的数据量只会产生少量新的物种OTUs。从图2稀释曲线中可见草原毛虫3个中肠样品细菌稀释曲线均基本趋于平缓，说明取样基本合理。3个样品文库中克隆的随机取样量足以覆盖绝大多数细菌的多样性。
等级聚类曲线是将样品中的OTUs按相对丰度(或者包含的序列数目)由大到小排序得到对应的排序编号，再以OTUs的排序编号为横坐标，OTUs中的相对丰度(也可用该等级OTU中序列数的相对百分含量)为纵坐标,将这些点用折线连接，即绘制得到Rank Abundance曲线，它可直观的反映样品中物种的丰富度和均匀度。在水平方向上，物种的丰富度由曲线的宽度来反映，物种横坐标为从某个样品中随机抽取的测序条数，纵坐标为基于该测序条数能构建的OTUs数量，用来反映测序深度情况，不同的样品使用不同颜色的曲线表示的
丰富度越高，曲线在横轴上的跨度越大；在垂直方向上，曲线的平滑程度，反映了样品中物种的均匀程度，曲线越平缓，物种分布越均匀[11]。从图3可见草原毛虫3个中肠样品中物种的丰富度和均匀度都较好。
3.4 草原毛虫3个中肠样品细菌类群分析
对草原毛虫3个中肠样品进行细菌类群分析(OUT分析)，如图4所示。其中GaCeY号样品共得到了307个OTU，GS1号样品共得到了203个OTU，GS2号样品共得到了580个OTU。3个样品横坐标为按OTUs丰度排序的序号，纵坐标为对应的OTUs的相对丰度，不同的样品使用不同的颜色的折线表示的相互之间共有菌群37个OUT，共有菌群所占GaCeY号样品菌群比例为12.3%，占GS1号样品菌群比例为18.2%，占GS2号样品菌群比例为6.4%，这表明3个样品的整体细菌类群相差比较大。但是，各个样品之间也有共有菌群：其中GaCeY号样品与GS1号样品之间共有39个共有OTU；GS1号样品与GS2号样品共有132个共有OTU；GaCeY号样品与GS2号样品之间共有154个共有OTU。
3.5 草原毛虫3个中肠样品细菌物种相对丰度展示
根据物种注释结果，选取每个样品在各分类水平(Phylum、Class、Order、Family、Genus)上最大丰度排名前10的物种，生成物种相对丰度柱形累加图，以便直观查看各样品在不同分类水平上，相对丰度较高的物种及其比例。以门水平物种相对丰度柱形图见图5，从图5可见甘南尕海草原毛虫中肠的细菌由Proteobacteria(变形菌门)、Bacteroidetes(拟杆菌门)、Firmicutes(厚壁菌门)、Actinobacteria(放线菌门)、Tenericutes(软壁菌门)、Verrucomicrobia(疣微菌门)、Fusobacteria(梭杆菌门)、Acidobacteria(酸杆菌)、Deinococcus-Thermus(异常球菌-栖热菌门)和Planctomycetes(浮霉菌门)等10个门组成，优势菌群为Proteobacteria和Bacteroidetes。GaCeY样品中Proteobacteria含量最丰富；GS1样品中Bacteroidetes含量最丰富，其次是Proteobacteria含量较丰富；GS2样品中Proteobacteria含量最丰富，其次是Bacteroidetes含量较丰富。
