青岛中港全浸初期不锈钢表面生物膜的细菌
多样性分析
陈永伟1,2栾鑫1,2 段继周2 池振明1
(1. 中国海洋大学海洋生命学院青岛266003, 2. 中国科学院海洋研究所青岛266071)
提要为了研究全浸15天不锈钢表面生物膜的形成情况, 首先采用SEM及荧光显微镜进行观察, 显示全浸15天不锈钢表面已有大量微生物及其腐蚀产物附着, 表明其表面生物膜已经形成; 进一步通过EDS对不锈钢表面进行元素分析, 发现实海全浸15天的316L不锈钢表面出现了大量的组成生物体的C、P等基本元素, 并且还出现了不锈钢基体中所不存在而存在于生物膜及其代谢产物中O等元素, 进一步证明了不锈钢表面生物膜的形成。采用16S rRNA基因结合PCR-RFLP技术分析手段对实海全浸15天的316L不锈钢表面生物膜细菌群落的多样性进行了研究, 发现316L不锈钢表面附着细菌的OTU数为24, 分别属于变形菌门和拟杆菌门, 其中α-变形菌的OTU数是18, 占总克隆数的72.3%, 为绝对优势种群。
关键词生物膜; 316L不锈钢; 细菌多样性; PCR-RFLP; 生物腐蚀
中图分类号:
316L不锈钢具有极强的耐腐蚀性和良好的机械加工性, 常被应用在海洋设施中的关键部件。在海水中不锈钢会形成一层由微生物及其代谢产物所组成的生物膜, 该生物膜包含多种腐蚀微生物, 如铁氧化菌, 硫酸盐还原菌和锰氧化菌等(Newman et al., 1986;Xu et al., 2008)，从而会对不锈钢产生微生物腐蚀, 结果也导致了巨大的经济损失(Beech et al., 1999)。
有大量研究发现316L不锈钢在淡水和天然海水中都有开路电位正向移动现象发生
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钙盐1*项目来源：中国科学院重要方向性项目（No. KZCX2-EW-205）；国家自然科学基金(40976046)。陈永伟，硕士研究生, E-mail：
自君别去
rude通讯作者：段继周, 硕士生导师, 研究员, E-mail：duanjz@ms.qdio.ac
我要去纽约收稿日期：, 收修改稿日期：
(Motoda et al., 1990; Dickinson et al., 1996), 但是在灭菌海水以及某些已培养出的单一株菌或两株菌的混合菌液中却出现开路电位负向移动的现象(Xu et al,2007; Xu et al,2008)。目前比较普遍的观点是, 上述开路电位变正现象是由微生物在不锈钢表面的生长繁殖造成的, 但具体是哪种微生物, 其机理是什么尚不清楚。因此, 研究天然海水中的316L不锈钢表面的微生物菌落结构具有重要意义, 这对进一步研
究微生物腐蚀机理和寻找具有腐蚀性能的微生物提供参考依据。
有研究表明, 在一般情况下, 生物膜的形成与发展会在14-20天内达到成熟阶段(黄宗国, 2008)。Jones等(2007)对暴露于天然海水中的316L不锈钢表面所形成生物膜的细菌群落结构进行了研究, 表明主要的细菌群体在2-20天内的相对丰度基本没有发生变化。国内有关学者对引水系统中的不锈钢表面生物膜进行了研究, 结果表明, 不锈钢表面细菌种类明显多于PVC材料, 不锈钢的腐蚀导致不锈钢表面粗糙度增加, 有利于生物膜的再生。因此, 他们认为导致这种现象发生的原因之一是不锈钢腐蚀造成的。(Lin et al,2012)。然而, 国内缺乏对海水中316L不锈钢表面生物膜的细菌多样性方面的研究。为了了解青岛近海316L不锈钢表面微生物膜的细菌群落组成, 本实验选择夏季在青岛海域实海全浸316L不锈钢来分析研究其表面的生物膜中的细菌多样性。
1材料和方法
1.1挂片与取样
本实验所选用的材料为购自山东信阳晟鑫科技有限公司的316L不锈钢, 首先, 按照国标金属材料在表面海水中常规暴露腐蚀试验方法(GB5776-1986)进行处理, 然后用SiC水相砂将试样逐级打磨至2000#, 然后放入无水乙醇中超声10 min, 最后放入干燥器内, 备用。将处理好的试样实海全浸于青岛中港实验场（东经119°58’，北纬35°52’）内。取样时将不锈钢片放入灭菌的50mL离心管中, 然后放入冰盒中带回
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实验室-20°C保存备用。
1.2生物膜表面观察与分析
1.2.1扫面电子显微镜观察(SEM)
为了观察不锈钢表面附着微生物随时间的变化规律, 分别在第1天、3天、5天、7天、10天和15天取回不锈钢片, 先用灭菌磷酸盐缓冲液(PBS) 溶液冲洗掉不锈钢表面吸附的悬浊液, 然后用5%戊二醛(用灭菌PBS稀释)固定2h。后用50%, 75%, 90%和100%的乙醇梯度脱水各30min, 真空临界点干燥, 喷金后放置到扫描电镜(KYKY-2800扫描电子显微镜, 北京中科科仪技术发展有限责任公司)上进行观察。加速电压为20kV。
为了观察不锈钢全浸15天以后的腐蚀形貌变化, 分别用扫描电镜观察不锈钢片第0天的初始形貌和15天后去除表面腐蚀产物后的表面形貌。腐蚀产物的去除方法参考国标金属和合金的腐蚀腐蚀试样上腐蚀产物的清除(GB/T 16545一1996)。
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1.2.2 X射线能谱分析(EDS)
对SEM观察后的第15天的不锈钢片不做任何处理, 直接进行EDS分析, 来研究不锈钢表面组成元素的变化。
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1.2.3荧光显微镜观察
4＇,6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）溶液是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，其穿过生物膜后与双链DNA结合，在紫外线(365nm)照射下会显示蓝色荧光，因此，可以用DAPI溶液对全浸15天的不锈钢进行染色以观察其表面细菌附着情况。将15天取回的不锈钢片先用灭菌PBS溶液冲洗掉其表面, 后用0.01mg/mL的DAPI染色30分钟, 然后荧光观察其表面附着微生物的数量。
1.3 PCR-RFLP技术表面附着微生物多样性分析
1.3.1 总DNA的提取以及16S rRNA基因的扩增:
利用PowerSoil DNA Isolation Kit(Mobio, USA)试剂盒来提取锈层中微生物的总DNA, 从-20°C冰箱中取出全浸15天的不锈钢片，用数片灭菌纱布擦拭其表面后，将擦拭后的纱布放入试剂盒中的Power Bread Tubes中, 然后按试剂盒说明进行DNA提取。以总DNA为模板, 采用细菌16S rRNA基因保守引物Bac8F: 5′-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3′和Bac1492R: 5′-CGGCTACCTTGTTACGACTT-3′进行PCR扩增。50μL反应体系为: DNA模版
2μL, 正反引物(2mM)各5μL, 10xBuffer 5μL, dNTP(2.5mM)4μL, dH2O补充至50μL。反应条件为:94°C预变性5 min; 94°C变性30s, 55°C退火30 s, 72°C延伸90 s, 进行30个循环; 最后72°C延伸10 min。
1.3.2 16S rRNA基因文库构建及测序
利用琼脂糖凝胶回收试剂盒(华舜W5211，上海)纯化回收PCR产物, 将纯化的16S rRNA 基因连接到载体pMD19-T(Takara, 大连)上, 转化到感受态细胞E. coli DH5α中, 涂布在含有x-gal、IPTG和氨苄青霉素的LB培养基上, 于37°C培养约12h, 选择具有氨苄抗性的白色转化子96株进行划线培养。然后用水煮法快速提取细胞中的基因组DNA, 采用T载体通用引物RV-M: 5′-GAGCGGA TAACAA TTTCACACAGG-3′和M13-D: 5′-AGGGTTTTCCCAGTCACGACG-3′(Dang et al)进行PCR验证。再先后用Msp I (NEB R0106, 北京)与Hha I(NEB R0139, 北京)限制性内切酶进行酶切。根据酶切所得的RFLP带型对克隆子进行初步划分, 相同带型归为同一个RFLP带型, 每个带型挑选出一株代表性菌株送测序(上海鼎安生物技术有限公司)。
1.3.3系统进化分析
测得的序列用DOTUR软件进行处理, 相似性在97%以上的被归为同一个操作分类单元(OTU)。将所得结果分别与NCBI GenBank数据库进行比对, 确定最相似的核酸序列, 用Clustal X软件比齐, 然后用MEGA4.0程序通过邻接法(Neighbor-Joining)构建系统进化树。1.3.4 统计学分析
以覆盖率C来评价所构建的16S rRNA基因文库对环境微生物多样性的体现, 公式为: C=[1－(n/N)]×100%, 其中n指文库中只包含一个克隆的OTU 数, N指文库的克隆总数。并计算其香浓-威纳（S
hannon-Wiener）指数（H）、辛普森（Simpson）指数(D)和均匀度（J）等多样性指数(栾鑫等,2013)。
2 实验结果与分析
2.1 不锈钢表面观察分析结果
2.1.1扫描电镜观察
经过扫面电镜的观察，得到全浸海水1天, 3天, 5天, 7天, 10天, 15天的SEM照片(图1), 结果显示: 不锈钢片在海水中浸泡1天后就发现其表面出现细菌附着及圆形腐蚀产物生成; 在第三天表面的微生物明显增多, 且有絮状腐蚀产物形成; 在第五天附着的微生物和絮状腐蚀产物继续增多, 但第七天和第五天比较变化不太明显; 到了第十五天腐蚀产物厚度进一步增加形成块状突起。
图1实海全浸1天、3天、5天、7天、10天和15天的不锈钢挂片SEM观察结果, 放大倍数均为2500倍Fig.1 SEM micrograph of reprentative morphologies of the 316L stainless steel immerd in the a for小学英语论文
franchi1d,3d,5d,7d,10d and 15 d.
2.1.2 荧光显微镜分析结果
为了观察实海全浸15天的316L不锈钢表面微生物附着情况, 我们对其进行了荧光显微镜观察, 结果如图3所示, 在不锈钢的表面发现有大量的蓝点(图2a), 部分位置蓝点极度聚集形成一片蓝色光区(图2b)。
chine medicine图2 实海全浸15天的不锈钢钢片表面附着微生物的荧光照片
Fig.2 Fluorescence microscopy of 316L stainless steel immerd in the a for 15 days
图a、图b分别为不锈钢表面生物膜放大200、400倍荧光照片
2.1.3 X射线能谱分析结果
为了进一步分析不锈钢表面形成的生物膜, 分别对全浸海水之前和全浸海水之后的316L不锈钢片进行了X射线能谱分析(EDS), 结果如图3所示。将全浸海水前、后EDS结果进行对比, 结果如表1所示。结果发现, 构成生物体的基本元素C、O元素含量明显增高，并且发现了不锈钢中不存在的P元素。另外，在生物膜中未发现不锈钢中存在的Mn元素和Mo元素。
图谱1 图谱2
图3全浸海水前，后的316L不锈钢的局部能谱分析图谱
