Bcr／abl融合基因在慢性粒细胞白血病中的检测方法及意义
wall streetbcr/abl 融合基因是慢性粒细胞白血病（CML）发病的分子生物学基础，通过灵敏的检验方法检测此基因对CML的诊断、治疗和预测疾病复发等具有重要临床意义。
标签： bcr/abl 融合基因；慢性粒细胞白血病
慢性粒细胞白血病（CML）是一种发生在造血干细胞的以粒系细胞慢性增殖为主要特征的恶性克隆性疾病，分子学水平上形成bcr/abl融合基因。bcr/abl融合基因的表达水平反映了患者体内白血病细胞的负荷量。因此，精确检测bcr/abl融合基因的表达水平，对白血病的临床分型诊断、个体化治疗方案的制定、治疗效果监测、缓解后复发风险的估计和预防、干细胞移植后残留细胞的检测和早期干预治疗等方面具有重要的指导作用。本文对bcr/abl融合基因的检测方法及意义进行综述。
1 Bcr/abl融合基因的检测方法
1.1 Southern Blot和Western Blot
Southern 印迹即DNA印迹，可以对bcr/abl融合基因DNA重排进行分子生物学检测。Southern Blot可使用从外周血或骨髓细胞提取的DNA对bcr/abl融合基因进行检测，不需要保持细胞的活力和所处周期，灵敏度约1～5%，多适用于科研而不是临床诊断[1]。
Western 印迹的原理类似Southern印迹，它是从混合蛋白质中区分并定量分析某种特殊蛋白质的重要手段[2-3]。但由于不同蛋白质的电转移效率以及单抗的结合能力不同，Western印迹的敏感性和可重复性较差，其敏感性为0.5%～1%[4]。另外该法操作繁琐、检测时间长，限制了其在临床上的应用。
1.2 常规RT-PCR
1988年RT-PCR被首次应用于CML的bcr/abl基因的检测[5]。在RT-PCR中，应用随机引物或abl特异引物，mRNA被反转录为cDNA，随后应用针对M-bcr的bl或b2和abl的a2或a3的引物进行扩增，扩增产物在琼脂糖或聚内烯酰胺凝胶电泳中出现特异的条带，在典型的CML病例中，b3a2和b2a2扩增产物条带相差75bp。常规RT-PCR的灵敏度为10-3～10-6。巢式PCR（Nested PCR）通过对第一轮的扩增产物进一步扩增，产生片段更短的PCR产物，敏感度提高到10-5～10-7。定性PCR技术己经普遍用于造血干细胞移植后MRD检测。
铁甲战警但定性PCR中不可避免地存在着假阳性或假阴性，所以，有必要应用定量PCR的方法对移植后患者进行微小残留病变的动态监测。
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1.3 实时定量PCR
所谓RQ- PCR技术是在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。目前国内外已发展了数种 RQ-PCR 技术，其中 TaqMan 法简单易行、特异性好、假阳性低、线性关系好，整个过程采用全封闭反应管及光电传导系统，无须顾及污染，亦无须对样品进行稀释和电泳，已被应用于病原体测定、肿瘤基因检测、基因表达、突变和多态性研究等多个领域[6]。其工作原理是利用Taq 酶的5′→3′核酸外切酶活性。在PCR 反应系统中加入一个荧光标记探针，该探针的5′端和3′端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光团。当探针保持完整时，淬灭基团抑制荧光基团的荧光发射。荧光基团一旦与淬灭基团发生分离，抑制作用被解除，荧光基团被荧光探测系统检测到。上述方法利用荧光产生原理，在PCR 过程中可以连续不断地检测反应体系中荧光信号的变化。所以RQ-PCR实现了从定性到定量的飞跃，其优点分别为：①人与人是怎么交流配灵敏度高，可达10-5，能区分转录本2～3倍变化[7]。②可靠、可重复：利用管家基
因可以对结果标准化，结果的可重复性好、可靠。③操作简便、快速、污染小、安全：可以通过外周血标本检测，减少了骨髓穿刺创伤且可以处理批量标本。整个PCR和检测过程由电脑控制，完整的RQ-PCR分析耗时不超过60分钟。扩增产物及产物分析在同一个反应体系中完成，不需PCR后处理，杜绝了扩增产物污染造成的假阳性。④定量监测：可以动态观察转录水平的变化，对疾病状态进一步分层，有利于早期疗效分析和指导个体化治疗。因此可作为CML治疗后监测MRD的有效手段。
2RQ-PCR检测bcr/abl融合基因的临床意义
2.1 CML临床分型与分期
might依据Ph染色体和bcr/abl融合基因，90%以上慢粒同时表现为Ph阳性和bcr/abl阳性，在Ph阴性患者中，又有5%左右患者 bcr/abl阳性，称为Ph阴性和bcr/abl阳性慢粒，其临床表现、治疗反应及预后与Ph和bcr/abl双阳性慢粒相同。结合临床表现、外周血象、骨髓形态、骨髓病理、染色体、融合基因等检查，慢粒分为慢性期（CP）、加速期（AP）、急变期（BP）。
2.2 監测分子靶向治疗疗效
近十年来，随着以伊马替尼（IM）为代表的分子靶向药物酪氨酸激酶抑制剂在CML治疗中的应用，使干扰素及异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）在成人中的传统地位受到了挑战。IRIS研究是迄今为止最大宗报道IM一线治疗CML-CP患者的研究，IRIS 5 年的随访结果表明 OS、EFS 分别为89%、83%[8]，随访6 年 OS 及 EFS 分别为 88%、83%[9]，随访8 年 OS 及 EFS 分别为 85%、81%[10]。IRIS 试验 7 年的随访结果显示，治疗 12 个月时 bcr-abl 转录本水平仍>1%较0.02%；或 B：连续两次检测bcr-abl/abl>0.05%；或 C：bcr-abl/abl 比值在连续 3 次检测中上升，并且在后两次检测中比>0.002% [19]。Olavarria 等[20]用定量 RQ-PCR 研究 138 例 CML 患者 Allo-SCT 后早期的 bcr-abl mRNA 水平，并据此把患者分为阴性（未检出）、低水平阳性（bcr-abl 转录本少于 100/μg RNA 或 bcr-abl/abl 小于 0.02%）和高水平阳性（转录本水平超过前述标准）三组。结果移植后 3 年这三组的累积复发率分别为 16.7%、42.9%和 86.4%（p=0.0001），而且转录本水平与复发可能性之间的关系不受供者类别、T细胞去除与否的影响。Elmaagacli 等[21]应用RQ-PCR对65例CML患者移植后的bcr-abl mRNA进行检测，结果发现，经过中位标准化以后，bcr-abl mRNA 水平在不同病期有显著性差异；其中，bcr-abl mRNA 水平在 17 例分子学复发为 0.004%；7 例细胞细胞遗传学复发为 0.04%；36 例一直处于稳定期为 2.6%；5 例血液
学复发为 36%。同时认为，RQ-PCR 法能对移植后早期复发进行检测，能对分子学复发与细胞遗传学复发进行鉴别（p＜0.001 ），并进行早期干预治疗，如：供者淋巴细胞输注（DLI）、停止使用免疫抑制剂、使用干扰素等，可重新获得分子学缓解。许兰平等[22]分析64例行造血干细胞移植的CML患者，根据bcr-abl监测结果，在移植后早期进行了干预治疗，方案为免疫调节、伊马替尼单独及与免疫调节联合。结果伊马替尼治疗组、免疫调节治疗组、联合治疗组患者bcr-abl融合基因转阴率分别为86.0%、90.O%和83.9%（p=0.126）；4年累计白血病血液学复发率分别为32.3%、0和16.1%（p=0.130），单独应用伊马替尼组比免疫调节治疗组复发率有增高的趋势（P=0.052）；三组患者4年存活率分别为90.O%、89.7和83.O%（P=0.696）。三种治疗方案可以达到相似的疗效，但不良反应不同，应权衡并进行个性化选择。
3结语
swallowing
实时定量PCR是一种快速、准确、敏感和可靠的实验方法。使用RQ-PCR的方法能定量动态观察CML患者bcr/abl基因的转录水平变化，明显优于RT-PCR等定性的检查手段。应用RQ-PCR方法对CML异基因造血干细胞移植后微小残留病进行监测，能在分子生物学水平
高中英语常用词组
上比细胞遗传学更早地预测疾病的复发，使得在白血病负荷尚低时进行干预治疗，并且能评价干预的疗效，对疾病获得良好的结果有重要的临床意义。八年级上册英语教案
参考文献
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