无抗生素选择系统的发展现状
摘 要
在我国，滥用抗生素的现象十分普遍，导致抗生素耐受基因基因的泛滥。其实，不止抗生素的滥用，在一些食品菌的生产、质粒DNA的生产、DNA疫苗的生产等多方面都会使用含抗生素的选择系统，这些都会导致抗生素耐受基因的传播。尤其是在生物药品领域，一种含有抗生素耐受基因载体的重组生物药物是完全不可取的，因此，无抗生素选择系统的发展是势在必行的。本文简介了无抗生素选择系统的发展现状。
关键词：无抗生素选择；耐受基因；DNA疫苗；质粒DNA；重组
The development of Antibiotic-free lection system
Abstract
In China, the widespread abu of antibiotics leads to the spread of antibiotic resistance genes. In fact,not only the abu of antibiotics, some bacteria in food production, the produ
ction of plasmid DNA and DNA vaccine,all of them will u the antibiotic lection system which can lead to the spread of antibiotic resistance genes. Especially, in the field of bio-medicine, an recombinant biological drug containing antibiotic resistance gene vector is unacceptable totally, and therefore, the development of antibiotic-free lection system is imperative. This article introduced the development of the antibiotic-free lection systems.
Keywords：antibiotic-free lection;Tolerance gene; DNA Vaccine; Plasmid DNA; Restructuring
前言
细菌的每一种耐药机制都由不同的耐药基因所控制，这些耐药基因可由突变产生，也可以通过增殖过程垂直传播，或者通过质粒、噬菌体、转座子等可移动的遗传物质在相同或不同种属细菌间水平传播。环境中细菌耐药基因的存在和抗菌药物的使用是影响细菌耐药性形成和发展的两个主要因素。抗生素耐药性基因的完全缺失是确保在环境中抗生素抗性基因不传播或转化到致病菌株中产生抗性的唯一方法hearttoheart[1]。目前已经试验成功的无抗生素选择
系统主要在DNA疫苗和基因药物、食品菌和转基因植物的生产研究等方面。
技术方法
1.DNA疫苗和基因药物
DNA疫苗和基因药物正在成为一种重要的药品类，然而，这种从细菌质粒衍生出来的药物在质粒DNA的分离纯化方面一直是工业化生产的难题，而且由于各种理论安全问题，监管机构一直不建议使用抗生素抗性标记的DNA疫苗。因此，新的无抗生素选择系统的研发已经势在必行。stan
1.1自溶系统分离质粒DNA
为了解决DNA疫苗在下游纯化方面的难题，Aaron E. Carnes等人研发了一种新颖的宿主菌株在细胞质中表达噬菌体內溶素的自溶大肠杆菌系统。这种系统在发酵过程中通过热诱导启动子诱导表达內溶素。內溶素保留在细胞质中，在细胞壁中肽聚糖基板上分离；因此细胞保持完好，可用通常的方法收获。然后回收的质粒DNA在微酸性环境下自溶提取，低盐缓冲液条件下用低浓度的无离子型去垢剂处理。在这些条件下，大肠杆菌的基因组DNA与
不溶性的细胞碎片仍连在一起，然后由固液分离法分理出质粒DNA[2]。
1.2 利用RNA-OUT的系统
password什么意思为了解决DNA疫苗的抗生素安全问题，Luke等人[3]提出了一种新方法，此方法设计并合成抗原基因克隆到RNA-OUT上编码无抗生素DNA疫苗载体，同时优化提高蛋白的表达和免疫原性，以替代其他卡那霉素抗性的载体。其简要过程为，首先在抗原免疫反应背景下考虑抗原靶向问题，其方法为通过主要组织相容性复合体（MHC）I类或II类基因指导抗原表达；例如ntc868系列RNA-OUT载体系统允许同时克隆到多个载体细胞内的不同的转基因目的地上。然后设计密码子优化和基因合成的详细流程图。最后就是克隆转基因到NTC868系列RNA-OUT载体系统上。最后得到的无抗生素DNA疫苗载体是更有效的卡那霉素抗性标记编码载体的安全替代品。
1.3基于营养缺陷型的新型无抗生素选择系统
1.3.1NAD合成缺陷系统
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针对抗生素选择系统的安全问题，不同类型的无抗生素选择系统被不断突出，其中，Dong, WR等人[4]提出了一种新型营养缺陷型互补系统,可以在无抗生素使用的情况下有效地选择宿主细胞和质粒。其基本流程为，在一个大肠杆菌菌株中的染色体上移除喹啉酸尿嘧啶磷酸核糖转移酶(QAPRTa)基因，这样大肠杆菌就携带了NAD合成缺陷基因。质粒中的抗性基因被大肠杆菌的QAPRTa基因取代。结果,只有表达了QAPRTa基因的大肠杆菌宿主细胞可以在基本培养基上生长繁殖。这是第一次一个脊椎动物基因被用于构造无抗生素选择系统,并且它可以广泛应用于DNA疫苗和基因治疗。QAPRTa基因广泛存在于从细菌到哺乳动物的不同物种当中，因此基因的水平转移引起的潜在的环境生物安全问题可以被消除。
1.3.2甘氨酸营养缺陷型互补选择系统
Vidal, L 等人[5]在2008年提出了一种基于甘氨酸营养缺陷型互补原理在大肠杆菌中构建重组质粒来替代抗生素选择标记的方法。利用PCR方法构建一个大肠杆菌M15衍化物的甘氨酸营养缺陷型菌株。这个菌株包含了一个缺失的甘氨酸基因，该基因编码丝氨酸羟甲基转移酶，这是一种在大肠杆菌甘氨酸主生物合成途径中的酶。同时构建一个在弱启动子P3
控制下的含有甘氨酸同源基因的pQEαβrham质粒，这样就成功构建了一个互补系统，该系统允许转话体生长在基本培养基中而不需要补充甘氨酸，成功的替代了抗生素选择标记系统。
2.食品菌
在目前形形色色的食品菌当中，乳酸菌是一类生产应用非常广泛的食品菌。作为一种安全型(GRAS)微生物，乳酸菌已经被应用于大量表达一些有价值的酶、抑菌素、次级代谢产物。但是应用于乳酸菌的质粒载体常带有一些氯霉素、红霉素等抗生素抗性基因，带来较大的生物安全隐患，美国FDA等权威机构禁止对GRASidiocracy微生物使用抗生素类抗性标记，因此，乳酸菌非抗生素抗性选择标记已成为该领域研究的热点。目前已经研究出了多种不同类型的无抗生素选择系统，根据筛选时质粒和受体菌之间的表型关系及特征，可分为显性选择标记、互补性选择标记、显性/互补型选择标记和双质粒选择标记[6]。
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显性选择标记是通过转入带有选择标记基因的质粒，赋予受体菌新的特性，使其能够在相应的选择压力下生长繁殖，从而达到筛选转化子的目的。在乳酸菌分子技术的非抗生素抗性标记的相关研究中主要涉及了细菌素类、重金属抗性、热激蛋白三大类显性选择标记
[7]。互补型非抗生素抗性质粒选择标记的受体菌株通常带有代谢途径相关基因的突变，导致突变株在基本培养基上不能生长，只有补充相应的外源营养物质或是转入含有特定选择标记基因的质粒，菌株才能生存。研发成功的主要有糖类营养缺陷互补型选择标记、胸甘酸营养缺陷互补型选择标记和嘌呤、嘧啶营养缺陷互补型选择标记[8]。显性/互补型选择标记，就是既可以作为显性也可以作为互补型的选择标记.，主要有α-半乳糖苷酶选择标记和destiny爱情公寓D-丙氨酸消旋酶选择标记[9]。双质粒选择标记系统含有两种质粒，一种是带有所要表达基因的独立复制型质粒，另一种是带有抗生素选择标记的非独立复制型质粒，它必须在抗生素选择压力下才能复制并稳定存在。因此，先在抗生素选择压力下筛选出转化子，再去掉抗生素选择压力，使带有抗生素抗性标记基因的质粒从菌株中消失，保证了菌株中所有的基因元件无抗生素抗性基因[10]。
3..转基因植物的生产和研究
3.1甘露糖选择系统
转基因植物在遗传转化的时候转化率比较低，所以必须使用选择标记来确保转化细胞的存
活并防止非转化细胞的再生。现在的选择方法大都含有卡那霉素、新霉素等抗生素，但由于这些抗生素对人类和环境的影响还未知，所以这些抗生素的使用备受关注。而无抗生素选择系统的一般方法大都为:将植物组织培养在含营养元素复合物、维生素和生长激素的丰富培养基上，以维持供试外植体的生长，使非转化组织在缺乏选择剂的情况下与转化组织一样生长;在使用选择试剂时，转化组织能正常生长，非转化组织则不能生长。根据这种思路研究出了甘露糖选择系统：露糖不能维持各种外植体的生长。当培养植物细胞添加甘露糖时，它只被转化为6-磷酸甘露糖，不能进一步参与代谢而积累至毒性水平，克隆编码6-磷酸甘露糖异构酶的基因作为选择基因构建表达载体，用甘露糖作选择剂，选择基因编码的6-磷酸甘露糖异构酶则可将6-磷酸甘露糖转化为易于糖酵解的6-磷酸果糖2014世界杯解说员[11]。这种甘露糖选择系统在甜菜、玉米中得到成功。而马铃薯、番茄和烟草可以用木糖作为选择剂。
3.2烟草根部的外源基因表达系统
抗生素抗性标记的需要、转基因识别困难及其高水平表达是植物快速生产重组蛋白的主要障碍。一种替代的方法生产无抗生素抗性选择标记的转基因植物是依靠农杆菌的根增值基因(rol 基因)的表型选择的。用农杆菌携带着连接了rol蓝调基因集群的pRYG转化载体，侵染宿
主，最后用毛状根作为选择标记的表型。用此种方法可以解决抗生素抗性标记的需要和转基因的高水平表达问题[12]。
总结展望
抗生素选择系统由于其生物安全隐患问题，正在逐渐被其他无抗生素选择系统取代，无抗生素选择系统的研发正在蓬勃发展，各种新颖巧妙的的新方法途径在不断被提出来，改变了现在使用抗生素进行选择的格局，是今后生物制药及生物制品的一大趋势。
参考文献
[1] Peubez I, Chaudet N, Mignon C, et al.Antibiotic-free lection in E. coli: new considerations for optimal design and improved production[J]. Microbial Cell Factories，2010,9:65-74
[2] Carnes AE, Hodgson CP, Luke JM,et al.Plasmid DNA Production Combining Antibiotic-Free Selection, Inducible High Yield Fermentation, and Novel Autolytic Purification[J]. Biotechnology and Bioengineering豌豆的英文，2009,3:505-515
[3] Luke JM,Carnes AE, Williams JA, et al. Development of Antibiotic-Free Selection System for Safer DNA Vaccination[J]. DNA Vaccines Methods in Molecular Biology Volume，2014,1143:91-111
