稳定表达流感病毒PR8株NS1蛋白MDCK细胞系的建立
黑衣人3格里芬四六级口语报名张 旭1,2，滕巧泱1，闫丽萍1，周洁文 1，徐大伟1,颜丕熙1，姬希文1，戴晓光1，王洪斌2，高 利2，李泽君1
【摘 要】根据流感病毒A/ Puerto Rico/ 8/ 34株NS1基因的核苷酸序列设计引物，PCR扩增后，将NS1完整开放阅读框分别克隆于pMX 载体和PET30a载体，成功构建了pMX-PR8-NS1和PET-PR8-NS1重组质粒。将PET-PR8-NS1重组质粒转化Jm109感受态大肠杆菌，诱导表达获得重组NS1蛋白免疫小鼠制备多抗血清。同时，将逆转录病毒载体系统 pMX-PR8-NS1、pCI-NF-KB、PMDSV和MDSV共转染293T细胞，制备逆转录病毒样粒子。将逆转录病毒样粒子感染MDCK细胞，利用嘌呤霉素进行抗性筛选。然后经过PCR、RT-PCR、间接免疫荧光鉴定，获得稳定表达PR8病毒NS1蛋白的细胞系，将之命名为MDCK-PR8-NS1细胞系。该细胞系的建立有望为深入开展流感病毒NS蛋白生物学功能的研究以及为扩增NS1基因删除的流感病毒提供了有利的工具。
【期刊名称】中国动物传染病学报
【年(卷),期】2011(019)002
英文翻译在线转换器【总页数】5
【关键词】流感病毒；NS1基因；MDCK
流感病毒（Influenza virus）属正黏病毒科流感病毒属，是一种带囊膜，基因组为单股，负链、分节段的RNA病毒。流感病毒的基因组分为8个片段，编码11个蛋白。NS基因是流感病毒基因组中最小的基因节段。NS基因编码NS1和NS2两种蛋白，研究表明，NS1为流感病毒唯一的非结构蛋白（nonstructural protein, NS）[1]。NS1蛋白含有两个核定位区，分别为第34～38位氨基酸残基和第203～230位氨基酸残基处。在这两个核定位信号的作用下，NS1蛋白在细胞质中合成后很快向核内转移，并积聚在病毒感染早期的细胞核内，在感染后期NS1则聚积于核仁中[2]。NS1除了在核内聚集之外，在多核糖体上也有发现。在NS1表达的情况下，与病毒mRNA结合的多核糖体明显增多，增加了病毒mRNA的翻译起始率，说明NS1蛋白在病毒基因表达或病毒mRNA复制方面起到很重要的作用[3]。除此以外，另有学者发现流感病毒的NS1蛋白在病毒逃离宿主免疫反应的过程中起着重要的作用。NS2蛋白的主要功能是介导组装好的vRNPs从细胞核输出到细胞质中，该功能通过M1蛋白与vRNPs发生联系，也有研究表明NS2在病毒RNA合成过程中具有调节作用[4]。
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为了将外源基因片段插入到流感病毒不同基因片段的包装信号之间，研究人员尝试拯救含外源基因的流感病毒。本研究中，为扩增在NS1基因的包装信号之间插入外源基因的流感病毒，我们用逆转录病毒系统，成功的将流感病毒PR8株的NS1基因整合进入MDCK细胞基因组中，建立了稳定表达NS1蛋白的MDCK-PR8-NS1细胞系。该细胞系的建立为更好地开展流感病毒NS1基因功能研究以及为扩增含有外源基因流感病毒提供有利的工具。
1 材料和方法
1.1 材料
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1.1.1 菌种和质粒 E.coli DH5感受态、E. coli BL21(DE3)感受态、PET30a载体、pMX载体、pMDSV、pCI-VSVG、pCI-MDSV(gag/pol)，pCINF-KB质粒均由本实验室保存。加拿大滑铁卢大学
1.1.2 病毒株与细胞 流感病毒A/ Puerto Rico/8/ 34株，293T细胞和MDCK细胞由上海兽医研究所水禽流感实验室提供。
1.1.3 主要试剂与材料 rTaq DNA 聚合酶、Pyrobest DNA聚合酶、T4 DNA 连接酶、Xho I、Not I、提取基因组试剂盒和Rever Transcripta M-MLV试剂盒购自宝生物工程（大
连）有限公司；DMEM 培养基、小牛血清（NCS）和转染试剂 LipofectamineTM2000购 自Invitrogen公 司；Puromycin购自Amresco公司；去内毒素质粒提取试剂盒购自 Omega 公司。
1.2 方法outcast
1.2.1 pMX载体重组流感病毒A/ Puerto Rico/ 8/34株NS1基因质粒构建 根据NCBI登录的流感病毒PR8株NS1基因（Genbank登录号：J02150.1）序列设计引物（表1），采用TRIzol法提取本实验室保存的流感病毒PR8株的总RNA，利用流感病毒通用引物进行反转录后，用引物PR8-NS-NotI-F和PR8-NS-XhoI-R扩增NS1基因的的完整开放阅读框。PCR产物经割胶纯化后用Not I和Xho I酶切，连接于同样酶切的 pMX 载体中，构建的重组质粒经酶切鉴定无误后测序。
1.2.2 重组质粒共转染 293T 细胞 按照OMEGA Endo-free Plasmid Mini Kit I说明书操作，提取高纯度的pCI-NF-KB、PMDSV（VSVG）、MDSV（gag/pol）和pMX -PR8 M四个质粒，测定质粒浓度后，用Lipofectamine 2000转染试剂将4种质粒共转染于293T细胞中，转染6 h后换培养液，用含5% NCS的DMEM培养液替换原先的OPTI-MEM 培养液。
1.2.3 表达NS基因MDCK细胞系的制备与阳性细胞株的筛选 待转染293T细胞72 h后，将含逆转录病毒样颗粒的293T细胞培养上清液转移至 MDCK细胞上，感染24 h后用含嘌呤霉素 (5 g/mL)培养基进行抗性筛选，每隔3 d弃去细胞培养上清液，换含嘌呤霉素的新培养液。15 d后将阳性细胞株在含嘌呤霉素的条件下连续传代，取第5代细胞进行鉴定。
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1.2.4 PR8-NS多抗的制备
1.2.4.1 PET30a重组流感病毒PR8株NS基因质粒构建 提取本实验室保存的流感病毒PR8株总RNA并进行反转录后，用下述引物PR8-NSEcoRI-U和PR8-NS-XhoI-L扩增NS1基因的完整开放阅读框。PCR产物经割胶纯化后用EcoR I和Xho I酶切，连接于同样酶切的 PET30a原核表达载体中。构建的重组质粒经酶切鉴定无误后测序，测序正确命名为PET-PR8NS1.
1.2.4.2 NS1蛋白的原核表达 将构建好的PET-PR8NS1重组质粒转化E.coliBL21，挑选酶切鉴定阳性的菌落接种LB培养基，37 ℃振荡培养至对数生长期，加入终浓度1.0 mmoL/L的IPTG进行诱导表达。
1.2.4.3 小鼠免疫 将表达后的NS蛋白进行粗纯化，取50 μg粗纯后蛋白与等体积的弗氏完全
2021年英语四六级报名入口官网佐剂混合，充分乳化后选择体重 18～20 g、6～8周龄的 BALB /c雌性小鼠，进行肌肉注射免疫, 每只0.2 mL。2周后，进行2次免疫。二免3周后，进行第3次免疫，免疫剂量同前2次免疫。第3次免疫后10 d，取血清分装后，保存于－70 ℃冰箱保存。
1.2.5 表达NS基因 MDCK细胞系的鉴定
1.2.5.1 NS基因 mRNA 表达水平和基因组插入水平检测 提取细胞的总基因组DNA和总mRNA，mRNA用OligodT引物进行反转录获得cDNA，以cDNA和细胞的基因组DNA为模板，用引物PR8-NS-EcoRI-U和PR8-NS-XhoI-L进行PCR扩增。PCR反应程序: 95℃预变性5 min；94℃变性 45 s，53 ℃退火 30 min，72 ℃延伸 1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.5.2 NS1蛋白检测 将培养的细胞用PBST反复清洗3次后，用4%的甲醛渗透固定5 min。PBST清洗5次，用1% BSA 37 ℃封闭45 min。PBST清洗5次，加入1:100稀释的NS多抗血清，室温下孵育1 h。PBST清洗5次，加入1:500稀释的FITC标记羊抗鼠IgG二抗稀释液，室温下孵育1 h。PBST清洗5 次，最后置于倒置荧光显微镜下观察并记录结果。
2 结果
2.1 流感病毒NS基因的克隆 从流感病毒PR8株提取的总RNA，通过反转录并用表1和表2中的NS的特异性引物进行PCR，产物经1%琼脂糖凝胶电泳后可见大小约838 bp的特异性条带。
2.2 重组质粒鉴定 pMX-PR8-NS重组载体经Not I和Xho I酶切鉴定后，在1%琼脂糖电泳中可见7037 bp的目的载体条带和约838 bp的片段条带（图1），与目的片段预期大小相符。将PET-PR8-NS重组载体用EcoR I和Xho I进行酶切鉴定，从1%琼脂糖电泳结果可见838 bp 的目的基因条带和约5421 bp的载体条带（图2），与预期相符。将重组质粒送测序分析，结果证实序列正确。
常用英语口语2.3 稳定转染细胞系的鉴定
2.3.1 稳定表达细胞系的RT-PCR及细胞基因组PCR鉴定 提取细胞基因组DNA，然后进行PCR鉴定，结果出现预期大小的条带（图3），表明PR8-NS基因已经整合到MDCK细胞系的基因组上。提取PR8-NS稳定转染细胞系mRNA，反转录做RT-PCR鉴定与预期结果相符(图4)，说明细胞基因组中插入的PR8-NS基因在特定的条件下能成功转录成NS的RNA。
