拆解艾博和耶鲁两款OmicronmRNA疫苗
周末愉快，⼤家快点起来，我们⼀起拆解两款针对Omicron突变株的mRNA疫苗，⼀款是国内艾博研发，⼀款是处于预印本的耶鲁⼤学医学院研发。
i knew you were trouble2022年2⽉14号，艾博和军事科学院联合在Cell Rearch上发表⽂章：Rapid development of an updated mRNA vaccine against the SARS-CoV-2 Omicron variant，该⽂章成功构建编码Omicron RBD 的mRNA疫苗，从序列设计到拿到第⼀⼿的动物模型数据只花费了32天时间，再次彰显mRNA技术在疫苗研发⽅⾯风驰电掣般的速度，这也是在正式公开发表⽂章中全球⾸款在动物模型中得到验证的Omicron mRNA疫苗。
有意思的是，隔了⼀天时间， 2022年2⽉15号，耶鲁⼤学医学院Sidi Chen上传预印本：SARS-CoV-2 Omicron-specific mRNA vaccine induces potent and broad antibody respons in vivo，该⽂章也构建了Omicron-specific LNP-mRNA 疫苗，不同的是，此款mRNA疫苗编码的是Omicron Spike全长蛋⽩。
Omicron席卷全球，逃脱现有疫苗抗体效果
2021年11⽉中旬在南⾮收集到的样本中⾸次检测到B.1.1.529，WHO在当⽉26号将该突变株列为⾼关注突变株（VoC），命名为Omicron。⾃11⽉中旬以后，⼏周之内，Omicron突变株凭借极⾼的传染速度和
免疫逃脱能⼒成为南⾮主要的感染株，开始在全世界范围内掀起第四波新冠感染浪潮，⽬前已经成为多个国家和地区的新冠主要感染株。
令⼈们感到担忧的是，许多实验室和临床的数据发现已有的疫苗和治疗性抗体对Omicron突变株的效果出现了急剧的减弱，这表明Omicron突变株有着极强的免疫逃脱能⼒。
与新冠原始株Wuhan-1相⽐，Omicron突变株基因组序列突变多达60个，其中50个是⾮同义突变，8个是同义突变，2个⾮编码区域的突变。就Spike蛋⽩⽽⾔，总共发⽣了32个突变，其中30个位点存在碱基突变造成的氨基酸替换，3个位点存在碱基删除，1个位点存在碱基插⼊。在Spike蛋⽩结构中负责和ACE2受体发⽣相互作⽤的RBD区域，发⽣了15个位点的突变。如此⼴泛的位点突变，会严重消弱现有疫苗和治疗性抗体的效果，因为⽬前⼤多数疫苗和抗体都是以Spike蛋⽩作为靶点。
2021年12⽉23号，Xiaoliang Sunney Xie等⼈在Nature发表⽂章：Omicron escapes the majority of existing SARS-CoV-2 neutralizing antibodies，⽂章研究Omicron RBD区域各位不同的突变位点对抗体中和效果的影响，结果发现Omicron能够逃脱绝⼤多数测试抗体（85%）的中和作⽤。
同⼀天，Olivier Schwartz 在Nature发表⽂章：Considerable escape of SARS-CoV-2 Omicron to antibody neutralization，这篇⽂章发现，接种2剂辉瑞或者阿斯利康疫苗的个体，与原始株或者Delta突变株相⽐，五个⽉后的⾎清中⼏乎检测不到可以中和Omicron突变株的抗体。让⼈感到欣慰的是，
接种第三针加强针的个体，七个⽉后⾎清对三种突变株的中和效果得到提升，对于Omicron的中和效果还是⾮常显著的偏低（与原始株或者Delta突变株相⽐，分别相差18倍和16倍）。
由于mRNA疫苗研发的快速⾼效，因此可以肯定，针对Oimcron突变株的⾸款疫苗必然是mRNA疫苗。下⾯，就让我们⼀起来从来看看已经开发出来的两款mRNA疫苗是如何设计构建的。
Omicron-mRNA -序列设计
ARCoV-Omicron RBD mRNA
艾博设计的ARCoV-Omicron mRNA疫苗表达的病毒蛋⽩靶标选择的依然是Omicron RBD，⽤不同的UTR序列，不同的密码⼦优化，搭建了18个候选Omicron RBD mRNA序列，转染293T cells(5 µg/well)，转染15h后，⽤ELISA检测Omicron RBD表达情况，并从中筛选了两个表达效果最好的序列，将其命名为Omicron/1 and Omicron/2。⽂章中并没有展⽰具体的UTR，SP，密码⼦优化后的序列，⽬前⼀般情况使⽤的UTR都是⼈α-globin and β-globin genes的调控序列。
ARCoV-Omicron mRNA序列设计
18个候选Omicron RBD mRNA细胞内表达情况
耶鲁Omicron-Spike-mRNA
耶鲁⼤学医学院设计的这款mRNA疫苗选择编码的是Omicron突变株全长Spike 蛋⽩，并且引⼊了6个脯氨酸的突变位点，因为有研究曾报道该突变能够增强Spike蛋⽩的稳定性。另外，需要把Spike蛋⽩序列中furin切割位点RRAR替换成GSAS，从⽽保持S1和S2亚基的完整性，避免细胞内的furin在S1和S2交界处切断Sipke蛋⽩。这篇⽂章同样没有提供具体的UTR序列。
投诉信Omicron-mRNA合成纯化
合成⼯艺
艾博⽂章中没有列举Omicron-mRNA合成的详细原料清单。从坊间流传开来的信息看，mRNA合成有两种常⽤的⽅式：酶法加帽和共转录加帽。酶法加帽，步骤⽐较繁琐，但是好在价格有优势。共转录加帽，⼀步到位，但缺点是，三核苷酸帽⼦类似物价格昂贵，极⼤增加mRNA合成成本。⽬前mRNA合成原料⼚家主要有：APExBIO，TriLink，NEB，兆维，近岸，申基，翌圣等。耶鲁的mRNA合成⽤的是NEB的酶，把序列中50%的尿嘧啶⽤N1-methyl-pudouridine替换掉。
此外，在mRNA合成原料中，模板制备也是极其重要的⼀个成分。由于⽬前的质粒发酵纯化⼯艺已经相当成熟，因此拿到⾼质量质粒不是⼀件难事。两篇⽂章并没有说明模板是如何制备的，酶切位点是如何选择的。从坊间流传开来的信息看，质粒要经过线性化，⼀般在质粒上会引⼊⼀个酶切位点，实现质粒线性化，然后便可以实现⼤规模纯化回收。
karl wolf纯化⼯艺
实验室级别的mRNA纯化，⽤RNA纯化试剂盒便可以做到。如果是GMP级别的，必须要开发mRNA纯化⼯艺。两篇⽂章均没有透露具体的纯化⽅法。⽬前主流的mRNA纯化使⽤的是OligodT柱⼦，柱⼦⼚家主要有BIA，Sepax，纳微等，纯化仪可以选择经典的AKTA或者国产仪器。总体来说，mRNA纯化⼯艺的开发要⽐蛋⽩纯化⼯艺开发简单，但是要拿的⾼纯度的mRNA，也是有⼀定难度的。take care of>device是什么意思
纯化质量分析
纯化拿到的mRNA需要进⾏⼀系列的质量分析，这⾥⾯有许多指标的检测⽅法，已经相当成熟，例如宿主蛋⽩残留，宿主DNA残留等。⽐较有难度的有两个指标，⼀个是加帽率的检测，需要⽤到LC-MS。⼀个是dsRNA的检测，需要⽤到专门的试剂盒。
LNP包封Omicron-mRNA
艾博⽂章中简述了⽤LNP包裹mRNA的⽅法：溶解在⼄醇中的脂质MIX由可电离脂质， DSPC，胆固醇，聚⼄⼆醇脂质，按照摩尔⽐ 48：10：40.5：1.5混合形成脂质MIX，然后脂质MIX和溶解有mRNA PH4.0，20mM柠檬酸Buffer，按照 1：2⽐例通过微流控T-mixer完成包封。接着，⽤TFF换液到PBS中。最后，⽤DLS和电镜进⾏粒径和分散度分析。
耶鲁⽂章中LNP包封mRNA的⽅法和质量分析⼿段同艾博是⼀样的，但是LNP的成分有差异。⾸先，耶鲁是把 mRNA溶解在PH5.3 25mM ⼄酸钠中。第⼆， mRNA和LNP的⽐例是1:6。
Omicron LNP-mRNA 体内的免疫原性
ARCoV-Omicron RBD mRNA疫苗
把LNP-Omicron RBD mRNA(1 mg/kg)通过静脉注射打⼊⼩⿏体内，注射6h后收集⾎清，利⽤ELISA检测⾎清中Omicron RBD浓度，数据显⽰尽管在⾎清当中检测到RBD的浓度在100-120ng/ml左右，证实Omicron RBD mRNA能够在体内翻译合成出较⾼的Omicron RBD 产物，但是同艾博⾸款针表达原始株RBD的mRNA疫苗相⽐，Omicron RBD mRNA在体内产⽣RBD的表达效率下降了3.5倍左右。
mRNA在体内产⽣RBD的表达效率下降了3.5倍左右。
在第14天收集间隔7天注射10ugOmicron RBD mRNA的⼩⿏⾎清，⽤ELISA 检测⾎清中的IgG抗体浓度；把⾎
清，Omicron假病毒，Huh7细胞混合孵育，检测荧光信号，以此来间接测定⾎清中中和抗体的含量。结果显
⽰，Omicron RBD mRNA在⼩⿏体内触发的抗体滴度和艾博⾸款原始株mRNA疫苗所触发的程度相同。
openworld耶鲁Omicron-Spike-mRNA疫苗
耶鲁Omicron-Spike-mRNA 同样在⼩⿏⾝上分两次注射，第⼀次是第0天的初始针，第⼆次是第14天的加强针。任何收集⾎清，⽤ELISA 检测⾎清中抗体滴度，可以发现Omicron-Spike-mRNA可以强烈地刺激⼩⿏产⽣针对Omicron的抗体反应。
mRNA疫苗加强针显著提升机体⾎清抗体
ARCoV-Omicron RBD mRNA疫苗
艾博收集原始株ARCov-mRNA（15ug）疫苗两剂接种者在第14天的⾎清样本，然后检测其对Omicron突变株的中和活性，结果发现与原始株相⽐，⼤多数⾎清样本对Omincron突变株的中和活性降低了47倍，表明Omincron突变株具有很强的免疫逃脱能⼒。
为了验证原始株ARCov-mRNA疫苗增强针的效果，艾博在第300天的时候收集接种两剂原始株ARCov-mRNA疫苗的⼩⿏⾎清，然后检测抗体滴度，发现不管是针对原始株，还是Omincron突变株，都已经下降到⼀个⾮常低的⽔平。然后在第300天的时候，给已经接种两剂原始株ARCov-mRNA
best song ever疫苗的⼩⿏再接种第三剂原始株ARCov-mRNA疫苗，14天后收集⾎清，检测抗体发现接种第三针的⼩⿏⾎清对于原始株和Omincron突变株的中和活性得到显著提升，⽽且两者之间只相差1.6倍。德语
以上试验数据说明mRNA疫苗增强针，不管是对原始株，还是突变株，均可以显著提升机体产⽣的抗体滴度。即便是接种了两剂mRNA疫苗增疫苗的⼩⿏，⼀年以后⾎清⾥中和抗体的滴度已经⾮常低了，但是，总不能隔段时间，就来⼀针，这⽅⾯的数据还需要进⼀步的证实。
耶鲁Omicron-Spike-mRNA疫苗
耶鲁分别在第127天和第141天在已经接种两剂⾃⼰设计的原始株WA-1-mRNA疫苗的⼩⿏⾝上再次接种Omicron-Spike-mRNA疫苗，然后在特定的时间，收集⾎清，利⽤Elisa和假病毒中和活性试验检测⾎清中的抗体中和活性。结果发现：
1.在第35天和第127天，已经接种两剂原始株WA-1-mRNA疫苗⼩⿏⾎清对于 Omicron RBD的中和活性要⽐对Delta RBD的活性低18倍（35天）和 10倍（127天），要⽐WA-1 RBD低20倍（35天）和 11倍（127天）。
2. 已经接种两剂原始株WA-1-mRNA疫苗⼩⿏⾎清在第35天的中和活性和第127天的中和活性，对三种类型的RBD来说，都发⽣了急剧的下降。尤其值得注意的是，对于Omicron RBD的中和活性已经降低了接近基线⽔平。维基百科 英文
3.当给已经接种两剂原始株WA-1-mRNA疫苗⼩⿏接种第1针Omicron-Spike-mRNA疫苗后，⼩⿏⾎清对Omicron RBD 的中和活性增加超过了2000倍，同时对于WA-1 RBD和Delta RBD 也出现了⼤幅增加。
4.当给已经接种两剂原始株WA-1-mRNA疫苗⼩⿏接种第2针Omicron-Spike-mRNA疫苗后，⼩⿏⾎清对三种类型的RBD的抗体滴度并没有出现增加。
以上试验数据说明，在⼩⿏模型上，耶鲁Omicron-Spike-mRNA疫苗加强针可以极⼤地诱发有原始株mRNA疫苗接种背景⼩⿏发⽣特异性的免疫反应，诱发的针对Omicron突变株的抗体对于其他类型的突变株也具备中和活性。这些试验数据和艾博的数据是吻合的。
据和艾博的数据是吻合的。
总结
从艾博和耶鲁⽂章的数据来看，接种Omicron疫苗加强针，诱发机体产⽣的抗体不仅对于Omicron突变株有中和活性，⽽且对于其他类型的突变株也有中和活性。更加重要的是，ARCoV-Omicron RBD mRNA疫苗从序列设计到动物试验只花费了⼀个⽉时间，充分展⽰了mRNA技术在疫苗研发⽅⾯的优越性。mRNA合成⼯艺，LNP包封⼯艺，质量分析⽅法，⼀旦打通，应对不同序列的mRNA，整个⼯various
艺流程基本上不会发⽣⼤的变动，可以快速推进到临床阶段。⼯艺⼀旦解决，对于特定的靶点，mRNA技术的难点就在于序列优化，如何选择最⾼效的UTR，如何优化编码序列，还有如何避免现有的序列优化和修饰核苷酸专利限制，这些都需要国内RNA药物新创企业去克服的。
请注明：姓名+研究⽅向！
版
权
声
明
本公众号所有转载⽂章系出于传递更多信息之⽬的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个⼈可与我们联系(**************)，我们将⽴即进⾏删除处理。所有⽂章仅代表作者观点，不代表本站⽴场。
