百日咳鲍特氏菌粘附素蛋白PRN的研究进展
柯兵兵 徐颖华 侯启明
中国食品药品检定研究院百白破疫苗和毒素室
卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室，北京 100050
【摘要】百日咳特氏菌粘附素蛋白PRN是百日咳杆菌膜表面一个非常重要的蛋白，研究人员对该蛋白的理化性质、空间结构、免疫原性、遗传特征进行了大量的实验研究，并取得很多重要的突破，本文就百日咳杆菌PRN蛋白的最新研究做一综述。
【关键词】：百日咳杆菌；百日咳粘附素
Progress in reach of PRN in Bordettalla pertussis
[Abstract] The Prn in Bordettalla pertussis is an important menbrane associated protein. Amounts of experiments have been conducted by the reachers,ranging from its characteristics,structure, immunogenicity to genetics,and they made a lot of breakthroughs. This paper aims to make a review about its rearching progress.
[Key word]:Bordetella pertussis;pertactin
百日咳鲍特氏菌(简称百日咳杆菌)的外膜表面存在众多功能蛋白，广泛参与到百日咳杆菌粘附于宿主呼吸道上皮细胞并持续存在于宿主细胞内，其中包括百日咳丝状血凝素（Fha）、百日咳粘附素（Prn）、菌毛蛋白（Fim）、气管定植因子（Tcf）。这些蛋白具有抵抗机体免疫力、粘附宿主细胞等生物学活性，与该菌的致病性密切相关；此外，这些蛋白具有很强的免疫原性，因此成为百日咳疫苗的重要的组分[1]。研究人员其中对百日咳粘附素Prn研究较多，现就该蛋白的一些研究进展做简要介绍。
1. 编码基因及其表达产物PRN是百日咳杆菌毒力株暴露于细菌表面的外膜蛋白（OMP），称为百日咳粘附素，是百日咳杆菌prn因编码的一个93KD前体多肽。该多肽水解后得到N端的大约69KD大小的成熟蛋白和30KD的C端
P30蛋白。[2]基因序列表明，百日咳杆菌PRN呈多态性，共有六个基因型（prn1，prn2，pm3，pm7，pm10和prn11），临床菌株中的prn基因型中以prn1基因型最为常见，为此，我国三株疫苗生产菌株均为prn1型。[3]
2.分子结构百日咳粘附素属于自转运蛋白家族，该蛋白家族包括许多蛋白酶、毒素、黏附因子、侵袭因子及脂肪酶。百日咳菌其他的毒力因子，如BrkA、Tcf也属于该蛋白家族成员。该家族蛋白是由一种
称为自转运分泌系统（Va）分泌到细胞外的。该家族蛋白包括三个主要的结构域：信号序列、承载结构域（α结构域）和转运单位（β结构域）。[4-5]X射线显示，百日咳粘附素承载结构域包含有16个右手平行的β螺旋结构，每一个β螺旋结构又包括由三个转角隔开的三个β折叠结构，使整个分子呈V型结构。[6-7]在每个转角部位定位着两个基本功能摸序。一个是Arg-Gly-Asp（RGD）三联肽，参与百日咳菌粘附到表达有纤维结合素、粘连蛋白等受体的呼吸道上皮细胞，另一个是富含脯氨酸区域，位于RGD模序附近以及C末端的一些区域，可能是百日咳菌粘附初始阶段快速但结合力相对较弱的结合位点[8]。β螺旋结构高度保守，推测可能参与到蛋白质转运到膜外后的折叠。承载结构域的C末端也包含有功能摸序，主要是由β螺旋折叠形成的β三明治结构。这种结构在自转运蛋白家族中高度保守，对蛋白的结构稳定及折叠起着重要作用。[9]上海美高学校
研究表明，百日咳粘附素转运结构域C末端有一段共有的氨基酸模序。这些氨基酸通常是芳香族疏水性氨基酸或者是带电的亲水性氨基酸，通常，最后一个残基是色氨酸或者苯丙氨酸。这种序列尤其是C末端三个残基对蛋白质的外膜定位及稳定起着重要作用。[10]百日咳粘附素转运结构域高度保守，并且由β折叠片形成β筒状结构。同时，成熟的百日咳粘附素的在膜外的折叠是由转运结构域C 末端β筒状折叠所引发的。
3.免疫原性PRN不仅是百日咳杆菌的毒力因子，而且能作为抗原诱导产生保护性抗体。研究表明，现行的无细胞百日咳疫苗相比于不含PRN的疫苗具有更强的保护性，因而PRN是新的无细胞百日咳疫苗
重要抗原成分之一。[11]研究者对全细胞百日咳疫苗效力进行测定时，发现免疫小鼠的血清中，PRN、FHA和菌毛抗体较高，其抗体类型主要是IgG如和IgM，表明了上述抗原在特异性体液免疫中的重要性。现已表明PRN分子中的免疫保护位点主要是GGXXP区域，利用单
克隆抗体所确定的其中一个免疫主导表位为(PQP)5重复序列。此外，有研究者用含PRN的百日咳杆菌免疫小鼠后，能够诱导Th细胞针对PRN发生应答，还可以刺激小鼠脾脏细胞分泌干扰素，因此PRN是百日咳疫苗中既能够诱导体液免疫，又能激发细胞免疫的中重要保护性抗原。[12-13]
4.黏附特性百口咳杆菌通过菌毛、丝状血凝素(FHA)、百日咳粘附素（PRN）等表面蛋白对宿主组织的粘附，侵入呼吸道黏膜纤毛上皮细胞和肺泡巨噬细胞。这些蛋白可能通过相互协同作用促进百日咳杆菌对宿主的粘附。尽管宿主细胞表面与百日咳杆菌结合的受体迄今尚未确定，但缺失表达PRN的百口咳杆菌变异株对宿主的粘附作用明显下降。[14]有研究表明，PRN的N端第225～227个氨基酸残基RGD三联肽在粘附过程中起着重要作用。然而Everest等人将RGD三联肽突变为RDE，发现突变前后百日咳杆菌对CHO和Hep-2细胞粘附力和侵袭力无明显差别，但RGD菌株在真核细胞蛋白抑制剂放线菌酮存在时粘附力显著下降，提示P69介导的粘附可能需要真核细胞某些蛋白活性物质的参与。[15]Berg 等证明PRN、FHA、PT的抗体能阻断百日咳杆菌粘附于人类气管上皮细胞，[16]这些抗体单独作用均能降低百日咳杆菌对细胞的粘附性．且粘附抑制能力接近，似乎表明这三个膜表面蛋白诱导宿主免疫反应的能力是相当的。
近年来，有越来越多的PRN临床缺陷株被分离出来，[17-20]这些菌株在致病力与传统的CS菌株无明显差别，也未发现PRN临床缺陷株侵袭宿主能力下降，提示百日咳杆菌在无PRN表达的情况下，可以通过其他的蛋白的互补作用发生粘附。到底是现今的无细胞百日咳疫苗的使用导致百日咳杆菌发生遗传漂变还是其他原因导致基因沉默，还有待验证。因此，可以认为PRN不是临床缺陷株不可或缺的侵袭因子。
5.遗传特征对百口咳临床菌株进行了PRN氨基酸序列分析，发现了P69A、P69B及P69C 3种不同序列的PRN分子， PRN多态性表现在GGXXP和PQP 两个区域。GGXXP区域靠近RGD序列，这些区域中的重复序列不同组合导致了PRN的高突变率，其中GGXXP区域变异机制主要是个别氨基酸的替换和序列重复次数的差异。[13]同时还有研究表明，GGXXP区域的氨基酸变异对宿主的免疫应答有很大的影响，帮助百日咳杆菌逃避宿主免疫系统的攻击。同时通过对GGXXP和PQP两个区域的对比分析，GGXXP重复序列个数较多时，PQP的重
复序列个数就少，反之亦然，也许是百日咳杆菌在保持基因长度不变的同时，增加变异的几率，以适应免疫选择。
Normak [21]等分析了英国19世纪20年代至90年代百日咳杆菌PT和PRN基因型的变化，发现PRN在20年代只有PRN1一个基因型，至90代末时，发现有PRN1、PRN2、PRN3三个基因型，PT有两个基因
型。并且PRN2和PRN3这两个亚型在80和90年代临床分离株分别占到了24%和53%，可能与当时英国的无细胞百日咳组分疫苗中只有PRN1有关，免疫的选择压力促使百日咳杆菌向其他亚型转变。因此，认为免疫选择作用是PRN突变的主要影响因素，百日咳发病率上升可能与PRN抗原漂移而引起的疫苗预防效果下降有关。另外的两个流行病学研究也获得了类似的结果[22-23]
国内外学者对百日咳杆菌的进行了大量的研究，获得了令人可喜的研究成果。新型的无细胞百日咳疫苗极大地减少了百日咳的发病率。然而对百日咳杆菌的致病机理尚未完全明了，研究该菌的外膜蛋白有助于阐明其发病机制，同时也为其他疾病的预防和治疗开辟了新的道路。
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