变形链球菌葡聚糖结合蛋白B基因克隆、表达及免疫防龋实验分析

更新时间:2023-06-26 09:21:42 阅读: 评论:0

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秉承学较严谨的学风与优良的科学道德,本人声明所呈交的论文是我个^在导师指导下进行的研究工作及取得的砩究成果。尽我所知,除了文中特别加以标注韧致谢的地方外,论文中不包含其他^已经发表或撰写过的研究戚果,
不包含本^或他人已申请学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确韵说明并表示了致谢。
申请学位论文与资料蔷有不宾之处,本人承担一切相关责任。
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第四军医大学博士学位论文
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克隆、表达及免疫防龋实验研究
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研究生导师
辅导教师卫克文
肖明振教授吴补领教授苏凌云副教授
摘要
龋病是一种多因素引起的细菌感染性疾病,变形链球菌是其主要致病菌。葡聚糖结合蛋白是变形链球菌的主要致龋毒力因子之一,在细菌的黏附和聚集,促进菌斑的形成中起着重要作用。免疫防龋是目前龋病预防研究的热点之一。基因疫苗是上世纪90年代发展起来的一种诱导免疫治疗的新方法,与减毒活疫苗、灭活疫苗、重组亚单位疫苗等疫苗相比,它具有长期稳定表达抗原蛋白,在宿主体内表达的蛋白与天然构象更为接近,抗原性更强等优点。目前,基因疫苗免疫防龋仅限于对变形链球菌表面蛋白、葡糖基转移酶、葡聚糖结合蛋白A的研究,关于利用葡聚糖结合蛋白B构建防龋基因疫苗的研究国内外还未见报道。已有的研究证实,葡聚糖结合蛋白B具有良好的免疫原性,但能否作为免疫防龋的候选基因疫苗,正是本研究所要解决的问题。
本研究从变形链球菌S.mutansIngbritt基因组DNh中克隆出gbpB的全长编码区基因片段,进行原核表达,获取大量纯化蛋白,同时制备抗GbpB的特异性抗体;构建GbpB的真核表达质粒作为基因疫苗,通过不同途径免疫动物,观察基因疫苗的免疫效果:通过建立定菌鼠实验模型,观察了重组纯化蛋白和基因疫苗的抑龋效果,充分说明了GbpB可作为免疫防龋的候选基因疫苗,为其在免疫防龋中的进一步研究及应用打下了实验基础。
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本研究共分为三个部分:
第一部分:变形链球菌gbpB的克隆和序列分析
常规厌氧培养S.mutansIngbritt,提取细菌基因组DNA作为模板;根据C_把nbank报道序列设计一对引物,采用PCR方法扩增gbpB的全长编码区基因片段;将获取的基因片段定向插入克隆载体pBluescriptKS中,转化感受态细胞E.eoliDH5a,挑取阳性克隆,鉴定后测序。测序结果经BLAST分析与文献报道基本一致。
第二部分:变形链球菌gbpB在原核和真核细胞中的表达美国之声中文版
将测序正确的gbpB定向插入原核表达载体pPROEXTMHTb,构建原核融合表达质粒pPRoExTMHTb.gbpB,转化感受态细胞E.co]iDH5ⅡBL21,IPTG诱导表达融合蛋白GbpB,SDS.PAGE检测表达产物,结果在SDS-PAGE凝胶上出现一条新生蛋白条带,其相对分子量约为50KD,与预计大小相符。
通过金属螯合亲和层析(Ni2+-NTA介质)纯化,大量获取了GbpB融合蛋自;并用纯化的融合蛋白常规免疫家兔制备抗血清,ELISA鉴定,结果表明成功获得GbpB的特异性抗血清,抗体滴度为1/64,效价为1:10,000。
将测序正确的gbpB定向插入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建真核表达质粒pcDNA3.1(+).gbpB,将其瞬时转染至哺乳动物细胞COS7中,并设对照组和空白组。结果发现pcDNA3.1(+).gbpB在COS7细胞的胞浆中呈阳性表达,胞核中未见表达,而对照组和空白组中胞浆和胞核均呈阴性表达。说明所构建的真核表达质粒转染哺乳动物细胞后能够在细胞内翻译、表达,表达的蛋白质位于胞浆中,可与抗GbpB抗体特异性结合,具有抗原性,可作为基因疫苗。
第三部分DNA防龋疫苗免疫动物及抑龋实验研究
大量制备重组质粒pcDNA3.1(+).gbpB,分鼻腔滴注组、-颌下腺区皮下注射组免疫sD大鼠,并设对照组和空白组,采用ELISA法检测血清及唾漆中
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抗体水平的变化情况。结果发现实验组血清IgG特异性抗体和唾液Igh抗体明显升高,且鼻腔滴注组和颌下腺区皮下注射组的血清IgG抗体水平无显著差异Q>0.05),颌下腺区皮下注射组产生的唾液Igh显著高于鼻腔滴注组Q<0.01)。说明基因疫苗通过腺周皮下注射免疫途径最能有效激发特异性抗体产生,是一种较为理想的防龋基因疫苗的免疫接种途径。
建立定菌鼠致龋实验模型,用纯化的GbpB蛋白和pcDNA3.1(+).gbpB基因疫苗通过颌下腺区皮下注射途径免疫定菌鼠,采用keyes龋齿计分法评价龋损程度。结果发现实验组龋
punto损范围和龋坏程度均明显低于对照组Q<0.01),但纯化的GbpB蛋白组和基因疫苗组间并无显著性差异0>O.05)。说明基因疫苗和纯化重组蛋白一样,均具有明显的免疫防龋效果。
关键词:变形链球菌
基因克隆葡聚糖结合蛋白B
基因疫苗动物免疫
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第四军医大学博士学位论文
-●●_--I__●____l●I_-I__I__ll,-________l__________I!_AnExperimentalStudyonCloningandExpressionofGlucanBindingProteinBGeneofStreptococcusMutansand
AnticariesImmunization
PhDCandidateWelKe-wen
SupervisorXiaoMing-zhenWuBu-lingSuLing-yun
drainage>韩语翻译器在线
Abstract
Dentalcariesisabacterialinfectiousdiseaseinvolvingmultiplesfactorsinwhichstreptococcusmutansplaysamajorrole.Glucanbindingproteins(Gbps)areconsideredtobeacariogepdcvirulentfactorduetotheirbindgincanability.
whichcontributestotheadherL日lCeandaccumulationoftheorg,aIliSlTISindentalplaque.Todayanticariousimmunizationbecomesoneofthefocusesincariespreventativestudy.Genevaccineisanovelimmunizationmethodformedicalpreventionthathasjustbegunsince1990s.Comparedwithliveattenuatedvaccine,inactivatedvaccineandrecombinantsubunitvaccine,genevaccinehasadvantagessuchasIong-tennandstableexpressionofantigen,theendogenously-producedproteinwi也closerconformation
tonaturalprotein,andstrongerantigenicity.SofarprotectionagainstdentalcariesbygbpBDNAvaccineinvivohasnotbeenreportedeitherathomeorabroad.
Inthisstudy,weclonedallthegeneencodingfragmentsofgbpBfrom&mutansIngbrittgenomicDNA,andafterbeingidentified,itWassubclonedintoaprokaryoticexpressionvector,andthenexpressedinE.coli.Thusmassrecombinantproteinswereobtained.MeanwhileweproducedtheantiseratoGbpB谢tllthefusionprotein,constructedeukaryoticexpressionplasmidpcDNA3.1(+)一gbpBasagenevaccine.andobserveditsimmunizatione饪bctthroughgenevaccineimmunizeSprague—Dawley(SD)ratsthroughvariousmethods.Gnotobioticratswerevaccinatedwimplasmidandfusionprotein.specificimmuneDepartment町Consermtl"m嘲砸憎FMMU
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