高效液相色谱法测定朝鲜蓟中的天冬酰胺
刘慧文
（中国林科院森林生态环境与保护研究所 国家林业局森林生态环境重点实验室 北京 １０００９１）摘 要 采用阳离子交换柱分离，荧光检测器检测，ｐＨ梯度洗脱，邻苯二甲醛－２巯基乙醇柱后衍生，成功分离、检测了朝鲜鲜蓟中的天冬酰胺。若以天冬酰胺的峰高Ｙ（μＶ）对进样质量Ｘ（μｇ）进行线性回归，则线性方程为Ｙ＝４５６６Ｘ＋１３９６，ｒ＝０．９９９８；平均回收率（ｎ＝３）为９７．３％，方法稳定、灵敏、准确。
关键词 高效液相色谱；天冬酰胺；朝鲜蓟；柱后衍生
中图分类号 Ｏ６５７
Determination of Asparagine in Artichoke by High Performance Liquid Chromatography
Liu Huiwen
(The rearch Insitute of Forestry Ecological, Environment and protection, Chine Academy of Forestry, Key Laboratory of Ministry of
Forestry, Beiging 100091, China)gerber
Ａｂｓｔｒａｃｔ Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｓｐａｒａｇｉｎｅ ｉｎ ａｒｔｉｃｈｏｋｅ ｂｙ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ （ＨＰＬＣ） ｗｉｔｈ ｐｏｓｔ－ｃｏｌｕｍｎ ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｓ ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ． Ｔｈｅ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉ－ｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｃａｔｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｒｅｓｉｎ ｃｏｌｕｍｎ（３０ ｃｍｘ０．４ｃｍ ｉ．ｄ．）ｗｉｔｈ ｇｒａｄｉｅｎｔｅｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｂｕｆｆｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ａ［１９．６ｇ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅｄｉｈｙｄｒａｔｅ ａｎｄ １．０ ｇ ｐｈｅｎｏｌ ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ ｉｎ １ Ｌｗａｔｅｒ， ＰＨ ３．１５］ ａｎｄ Ｂ［２１．０ｇ ｓｏｄｉｕｍ ｎｉｔｒａｔｅ ａｎｄ １．５ｇ ｂｏｒｉｃ ａｃｉｄ ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ ｉｎ １Ｌｗａｔｅｒ，ＰＨ ９．７０］ ａｓ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ ａｔ ａ ｆｌｏｗ ｒａｔｅ ｏｆ ０．５ｍＬ／ｍｉｎ， ａｎｄ ａ ｃｏｌｕｍｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｆ ６２℃， ｗｉｔｈ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈλｅｘ＝３３８ｎｍ，λｅｍ＝４２５ｎｍ． Ｔｈｅ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｆ Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ ｗａｓ １０．８３０ ｍｉｎｕｔｅｓ． Ｔｈｅ ａ
ｖｅｒａｇｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｗａｓ ９７．３％ ａｎｄ ｔｈｅｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｗａｓ１．３５％． Ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓ ｓｉｍｐｌｅ， ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ Ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ； ｐｏｓｔ－ｃｏｌｕｍｎ ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ； ａｓｐａｒａｇｉｎｅ； ａｒｔｉｃｈｏｋｅ
１ 引 言
朝鲜蓟（ａｒｔｉｃｈｏｋｅ），是菊科（ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）菜蓟属中以花蕾供食的多年生草本植物，该植物营养成份丰富，除含有蛋白质、维生素、胡萝卜素、多种微量元素外，还含丰富的黄酮化合物及天冬酰胺等药用成分，本文采用阳离子交换柱分离，荧光检测器检测，ｐＨ梯度洗脱，邻苯二甲醛－２巯基乙醇柱后衍生，成功分离、检测了朝鲜鲜蓟中的天冬酰胺。
２ 实验部分
２．１ 仪器与试剂
仪器：美国Ｗａｔｅｒｓ公司高效液相色谱仪，包括两台Ｍ５１０高压泵、Ｍ６８０程序控制器、Ｍ
ramos
４７０全波道扫描可调波长荧光检测器、柱后衍生泵、柱温控制器。
试剂：硝酸钠、柠檬酸三钠、苯酚、硼酸、氢氧化钠、氢氧化钾为分析纯；甲醇、邻苯二甲醛、２－巯基乙醇为优级纯；天冬酰胺标准物质为色谱纯；重蒸水。２．２ 色谱条件
色谱柱 ：美国Ｗａｔｅｒｓ公司提供的阳离子交换柱（３０ｃｍ ｘ ０．４ ｃｍ ｉ．ｄ．），柱温：６２℃；流动相：ｐＨ＝３．１５的缓冲液Ａ与ｐＨ＝９．７０的缓冲液Ｂ，流速０．５ｍＬ／ｍｉｎ；柱后反应泵流速０．４ ｍＬ／ｍｉｎ ；荧光检测器波长：λｅｘ＝３３８ｎｍ，λｅｍ＝４２５ｎｍ，（下标ｅｘ和ｅｍ分别表示激发波长和发射波长），ｐＨ梯度洗脱，梯度洗脱程序见表１。
表１ 梯度洗脱程序
Ｔｉｍｅ（ｍｉｎ）Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ（ｍＬ／ｍｉｎ）Ｂｕｆｆｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ
Ａ（％）Ｂ（％）
０．００．５３０７０
２０．００．５１０９０
３０．００．５０１００
３５．００．５３０７０
４０．００．５３０７０
２．３ 洗脱液和衍生液的配制
Ａ溶液：称取１９．６ｇ柠檬酸三钠二水合物、１．０ｇ苯酚、用１Ｌ蒸馏水溶解混匀，用硝酸调节溶液的ｐＨ为３．１５，经０．４５μｍ滤膜抽滤备用。
美国黑色星期五Ｂ溶液：称取２１．０ｇ硝酸钠、１．５ｇ硼酸，用１Ｌ蒸馏水溶解混匀，以质量分数为２０％的氢氧化钠溶液调节溶液的ｐＨ为９．７０，经０．４５μｍ滤膜抽滤备用。
ＯＰＡ衍生液：用１０ｍＬ甲醇溶解７００ｍｇ邻苯二甲醛，加入１ｍＬ２－巯基乙醇混匀，将此液加入到１Ｌ硼酸钾溶
收稿日期：２００６－０４－２６
作者简介：刘慧文，高级工程师，从事分析测试技术研究与应用及重点实验室管理。
液（ｐＨ＝１０．４０）中，充份摇匀后用０．４５μｍ滤膜抽滤备用（此液现用现配）。
２．４ 标准溶液及样品液制备
２．４．１ 标准溶液配制platform是什么意思
准确称取天冬酰胺标准物质５．２ｍｇ于２５ｍＬ容量瓶中，用重蒸水溶解并定容，摇匀备用。
２．４．２ 样品溶液制备
服务生英文
准确称取朝鲜蓟样品５ｇ，剪碎研细后放入２５０ｍＬ锥形瓶中，加入５０ｍＬ蒸馏水在水浴上回流提取２小时，过滤后定容于５０ｍＬ容量瓶中，滤液经过０．４５μｍ滤膜抽滤后上机检测。
３ 实验结果
３．１ 标准曲线绘制
准确吸取上述标准熔液１、３、５、８、１０ μＬ ，分别进样，测定被测组分的质量Ｘ（μｇ）与峰高Ｙ（μＶ）之间的关系，得线性回归方程Ｙ＝４５６６Ｘ＋１３９６，ｒ＝０．９９９８。同时得标准分离图谱（图１）。
图１ 天冬酰胺标准溶液色谱图
３．２ 精密度试验
精确吸取天冬酰胺标准溶液５μＬ，重复进样５次（ｎ＝５），测得色谱峰高值。天冬酰胺测定结果的相对标准偏差为１．３５％，标准偏差为０．２７。
３．３ 回收率试验
精确称取天冬酰胺标准品２．８ｍｇ共３份，分别放入３份已经称量好的朝鲜蓟样品中，重复样品制备过程，得测试液，进样５μＬ进行分析，计算天冬酰胺的回收率分别为９６．４％、９７．２％和９７．５％。３．４ 样品测定
在上述色谱条件下，精确吸取样品提取液５μＬ进样分析，得样品分离图谱（图２）。以外标定量法计算朝鲜蓟提取液中天冬酰胺的含量，见表２。
图２ 朝鲜蓟样品溶液色谱图
表２ 朝鲜蓟样品提取液中天冬酰胺的含量（ｇ／１００ｇ）
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样品名称朝鲜蓟叶朝鲜蓟茎朝鲜蓟绿球朝鲜蓟红球天冬酰胺含量０．８６５０．０９０４．１２３３．４１６cog
４ 结果讨论
由于氨基酸及其部分酰胺类物质的衍生物在荧光λｅｘ＝３３８ｎｍ λｅｍ＝４２５ｎｍ波长处具有很强的吸收，所以本实验采用了邻苯二甲醛－２－巯基乙醇（ＯＰＡ）柱后衍生，荧光检测器检测的方法进行天冬酰胺的有效分离和检测，在此波长下，不仅洗脱图形清晰，峰形对称，同时还避免了许多其他物质的吸收干扰，使定量更加准确。
洗脱液ｐＨ值的把握和梯度程序的合理设置是组分洗脱与分离的重要因素，经过反复试验，确定了最佳洗脱液酸度和梯度洗脱程序，实现了两种洗脱液的平缓转换和精密控制，使天冬酰胺与其他成分达到基线分离。
从测试结果可以看到，朝鲜蓟的各部位中都含有对人体有益的天门冬酰胺，尤其是花蕾绿球与红球中这种成分的含量更高，因此，它是一种营养及药用成分丰富、值得推荐的可食用植物。
参考文献高一数学课本
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最好的英语学习方法
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