| celebrate什么意思 实验序号 | 实验名称 | 哺乳动物组织基因组DNA提取 | |||
实验时间 | 是否小组合作 朝鲜柳京饭店 | 是（√） 否（ ） | |||
一．实验预习 | |||||
1．实验目的： （1）掌握动物基因组DNA提取的原理和操作方法； （2）掌握相对分子质量较大的DNA的琼脂糖凝胶电泳技术。 | |||||
2．实验原理： 1）本实验利用去垢剂SDS(十二烷基磺酸钠)是为了使蛋白变性并溶解细胞膜中的脂质从而导致细胞裂解，而细胞裂解物又常用蛋白酶K和蛋白进行水解处理。 随后用酚：氯仿进行抽提，以去除残留的蛋白质，这时蛋白质将进入有机相，或者假如己变性的话将呈现在有机相与水相之间。氯仿处理是为了去除苯酚，而乙醇沉淀处理则可以浓缩DNA，同时去除核苷酸、氨基酸以及低分子量的寡核苷酸和肽。 2）为了进一步保护DNA样品的完整性，通常需要在缓冲液中添加乙二胺四乙酸(EDTA)以整合Mg2+，这样将会减少脱氧核糖核酸酶(DNa)的活性，因为该酶必须在有Mg2+存在时才会起作用。 3）本实验方法分离得到的染色体DNA样品易被限制酶切割，用此方法得到的DNA长度为100~150 kbp，因此，较适用于适用于λ噬菌体基因组文库和Southern杂交的研究。如果所制备的基因组DNA是用于构建克隆文库，要求得到较大分子量的DNA，则必须省略其中的振荡步骤 | |||||
3． 实验器材与试剂： （1）实验仪器（apparatus）： 高压灭菌锅（Autoclave）、电子天平（Electronic balance） 玻璃匀浆器（Glass homogenizer）、高速冷冻离心机（High speed refrigerated centrifuge）、超低温冰箱（Ultra cold storage freezer）、 微波炉（microwave oven）、微量加样器（Pipettes）、电泳系统（Electrophoresis System）、紫外透射仪（Ultraviolet transilluminator）、 恒温水浴锅（constant temperature boiler）等； （2）实验材料（Material）： 小白鼠（Liver of mice ） （3）实验试剂（Reagents）： 50 ml生理盐水（0.85％ NaCl）、Acetic acid(醋酸)、dddH2O （三蒸水）、Phenol（苯酚）、Chloroform（氯仿）、Ethanol（乙醇）、Isoamylol（异戊醇）、TE buffer （TE缓冲液）、Boric acid（硼酸）、Sugar（蔗糖）、Agaro（琼脂糖）、Bromophenol blue（溴酚蓝）、 Gelview Fluorescent dye（Gelviewfour的序数词荧光染料）及NaOH等。 注意：以上试剂均需高压灭菌。 此外的还需要的试剂及其配制方法如下所示： ① 5mol/L氯化钠（NaCl）： 溶解14.6g氯化钠于足量的水中，定容至50ml； ② 0.5mol/L乙二胺四乙酸 pH8.0（EDTA）: 百度英语在线翻译3月托福考试取消 配制等摩尔的Na2EDTA和NaOH溶液（0.5mol/L），混合后形成EDTA的三钠盐。或称取9.31g的Na2EDTA·2H2O和1g的NaOH，pH调至8.0，并溶于约40ml水中，定容至50ml ③ 3mol/L乙酸钠pH5.2（Sodium acetate）： 溶解20.4g的三水乙酸钠于约40ml水中，用冰乙酸调溶液的pH至5.2，再加水定容到50ml； ④ 2％十二烷基硫酸钠（SDS）： 称取1gSDS慢慢转移到约含40ml的水的烧杯中，用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解。用水定容至50ml； ⑤ 40%氢氧化钠（NaOH）： 溶解40g氢氧化钠颗粒于约90ml水的烧杯中（磁力搅拌器搅拌），氢氧化钠完全溶解后用水定容至100ml 。 ⑥ 1mol/L盐酸（HCl）：加8.6ml的浓盐酸至91.4ml的水中。 ⑦ 10mg/ml蛋白酶K（proteina K）： 将100mg的蛋白酶k加入到9.5ml水中，轻轻摇动，直至蛋白酶K完全溶解。不要涡旋混合。加水定容到10ml，然后分装成小份贮存于-20℃。 ⑧ 10mg/mlRna（无DNa）（DNa－free RNa）：即无DNA酶的核糖核酸酶 溶解10mg的胰蛋白RNA酶于1ml的10mmol/L的乙酸钠水溶液中（pH 5.0）。溶解后于水浴中煮沸15min，使DNA酶失活。用1mol/L的Tris－HCl调pH至7.5，于-20℃贮存。（配制过程中要戴手套）； ⑨ 1 mol／L Tris.HCl缓冲液（Tris-HCl buffer pH 8.0）： 将121g的Tris碱溶解于约0.9L水中，再根据所要求的pH（25℃下）加入46 ml的浓盐酸，用蒸馏水调整终体积至1 L ； ⑩6×凝胶加样缓冲液： 0.25% 溴酚蓝（bromophenol blue）：取60ml双蒸水，将250mg溴酚蓝溶解于其中； 40% (W／V)蔗糖水溶液（sucro in water）：在上述溶液中加入40g蔗糖。 另外： Ⅰ.100mL 5×TBE pH8.0（电泳缓冲液）的配制： 称取5.4g Tris，2.75g 硼酸加入2mL 0.5mol／L EDTA(pH8.0)溶液中，再用蒸馏水补加到100mL Ⅱ. 10ml组织匀浆液 （装入10ml离心管中）的配制： 100mmol／L NaCl：0.2ml（ 5M NaCl） 25 mmol／L EDTA(pH8．0)： 0.5ml（ 0.5M EDTA pH8．0) l0mmol／LTris.HCIpH 8．0)： 0.1ml（1M LTris.HCIpH 8．0) 加三蒸水: 9.2ml Ⅲ. 1ml酶解液（装入1.5ml离心管中）: 200mmol／L NaCl：0.04ml （ 5M NaCl） 50mmol／L EDTA(pH 8．0)：0.1ml （ 0.5M EDTA pH8．0) 20mmol／LTris.HCl(pH 8．0)：0.02ml（1M Tris.HCIpH 8．0) 1％SDS： 0.5ml （2％ SDS） 200μg／mL蛋白酶K： 0.02ml （10mg／mL） 霍尔特人加三蒸水: 0.32ml Ⅳ.提取液1：平衡酚(pH8.0)：氯仿：异戊醇（25：24：1）即配即用,每管加500ul 平衡酚(pH8.0)： 250ul 氯仿： 240ul 异戊醇： 10ul Ⅴ.提取液2：氯仿：异戊醇（24：1）即配即用,每支试管加500 ul 氯仿： 480ul 异戊醇： 20ul Ⅵ.TE缓冲液 ： 5ml 10mmol／L Tris.HCl(pH 8．0)：0.05ml（1M LTris.HCIpH 8．0) 1mmol／L EDTA(PH8．0)：0.01ml（ 0.5M EDTA pH8．0) 最后加三蒸水至4.94mL | |||||
4．实验方法步骤及注意事项 1）实验方法步骤： 第一步操作：破碎、酶解细胞（过夜） (1)取0.2g鼠肝，用冰冷的生理盐水洗3次，然后置于2.0mL匀浆液中，用玻璃匀浆器匀浆至无明显组织块存在(冰浴操作，切勿将细胞破碎，可镜检观察)； (2)将组织细胞液移至1.5mL离心管中，5000r／min离心30—60s，(尽可能在低温下操作)，弃上清，若沉淀中血细胞较多，可再加入5倍于细胞体积的匀浆液洗一次； (3)沉淀加400uL无菌水迅速吹散，再加400uL酶解液，翻转混匀(动作一定要轻) 55℃水浴处理12—18h； 第二步操作：抽提DNA 、乙醇沉淀纯化DNA (4)取20uL RNa加入1.5ml离心管内，使RNa至终浓度200μg／mL，37℃水浴1h； (5)将待抽提的样品等量分装在两支离心管内，各加入等体积①提取液 酚／氯仿／异戊醇500ul（25：24：1现配先用），抽提 (慢慢旋转混匀，倾斜使两相接触面增大)一次。 4℃ 10min静置， 然后10000r／min离心10min ； (6)用扩口吸头移出含DNA的水相.(注意勿吸出界面中蛋白沉淀,有时如果DNA含量过高，水相在下层，实验时注意观察)； (7)然后加等体积②提取液:氯仿／异戊醇500ul（24：1 现配现用）抽提 ，4℃静置10min， 然后10000r／min离心10min (若界面或水相中蛋白含量多，可重复5，6，7操作)； (8)用扩口吸头小心吸出上层含DNA的水相，加1／10体积的NaAc，小心混匀(要充分)； (9)再向每管中加入2倍体积的无水乙醇，-20℃ 1-2h ； (10)12000r／min离心15min，弃上清； (11)75％冷乙醇洗涤一次，12000r／min离心15min ； (12)室温干燥(不要太干，否则DNA不易溶解)，加入50μL TE缓冲液。轻摇混匀，即可得到实验动物基因组DNA。存放于4℃； 第三步操作：琼脂糖凝胶电泳检测DNA （Agaro Gel Electrophoresis） (13)制备琼脂糖凝胶（Preparation of the gel）：琼脂糖凝胶浓度为0.3％； (14)加入ＤＮＡ样品（Loading DNA samples）： DNA samples 16µl + Loading buffer4µl (15)电泳（Gel）：电压120V (16)电泳结果的拍照（Gel photographysunshine的意思）：通过紫外透射仪检测凝胶，然后获取图片。并将产物条带与已知分子量的标淮条带进行比较，便可以对合适分子量大小的产物进行鉴定。 2）注意事项： （1）所有用品均需要高温高压，以灭活残余的DNA酶； （2）所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制； （3）；用大口滴管或吸头操作，以尽量减少打断DNA的可能性； （4）用上述方法提取的DNA纯度可以满足一般实验（如Southern 杂交、PCR等）目的，如要求更高，可参考有关资料进行DNA纯化； （5）进行小鼠基因组DNA样品室温干燥时，不要太过于干燥，否则DNA不易溶解； （6）在用冰冷的生理盐水洗鼠肝之前，先要将玻璃匀浆器置于冰块中，待温度下降到一定程度再将鼠肝放入玻璃匀浆器，冰浴操作，但切勿将细胞破碎，整个过程尽可能在低温下操作； （7）用无菌水迅速吹散沉淀，加入酶解液后，翻转混匀时动作一定要轻； （8）抽提时慢慢旋转混匀，倾斜使两相接触面增大，离心后用扩口吸头移出含DNA的水相时，注意勿吸出界面中蛋白沉淀,有时如果DNA含量过高，水相在下层，实验时注意观察 | |||||
二．实验内容 | |||||
1．实验现象与结果： 此次试验本小组所得紫外透射仪检测凝胶照片显示的天道如图所示： 小白鼠基因组DNA的电泳条带图 | |||||
2．对实验现象、实验结果的分析及其结论：韩语我爱你 （1）对实验现象的分析及其结论：从上述所示的DNA电泳条带图可以看出： 小鼠基因组DNA的电泳条带都在同一条水平线上，但同时条带也有些暗淡，形状不佳。 （2）对实验结果的分析及其结论： ①本次实验抽提所得到的小白鼠肝脏细胞基因组DNA样品不纯，可能含有其他的一些杂质； railwaystation②本次所用的凝胶浓度为0.3％，浓度过低，也有可能是导致电泳条带形状不佳的原因之一。 | |||||
3．对本次实验的自我总结： ①本次试验各个组员都积极参与，合作有序，按时按质完成了本次实验； ②通过本次实验进一步认识了作为分子生物学实验重要研究手段之一 琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术； ③由于本次哺乳动物组织基因组DNA提取实验未在电泳时向凝胶中加入相对分子质量标准物Marker作为标准对照，故不好进行进一步的分析。 | |||||
教师评语及评分： 签名： 年 月 日 proven什么意思 | |||||
本文发布于:2023-06-24 03:34:35，感谢您对本站的认可！
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