探讨胆碱对H2O2诱导的心肌细胞凋亡的保护作用
jadu
摘要： 目的 探讨M3受体激动对H2O2诱导的大鼠培养心肌细胞凋亡的作用。方法 以 H2O2诱导大鼠培养心肌细胞损伤模型为基础，给予M3受体激动剂胆碱和M3受体阻断剂4DAMP进行干预。流式细胞仪检测细胞凋亡;RT PCR检测凋亡抑制蛋白Bcl 2。结果 ①胆碱可显著降低 H2O2对心肌细胞的损伤，提高心肌细胞存活率，并降低细胞的凋亡率;②胆碱可增加凋亡心肌细胞Bcl 2的表达;③M3受体阻断剂4DAMP可逆转胆碱的上述作用(P关键词： M3受体;心肌细胞凋亡;过氧化氢;流式细胞仪;反转录聚合酶链式反应
心脏在缺氧、酸化、钙超载等病理条件下，心肌细胞内生存信号因子减少,死亡信号因子增加,导致心肌缺血损伤，从而引起严重的心律失常。因此，目前认为能够有效地改善心肌损伤是治疗某些致死性心律失常的根本方法。胆碱具有许多生物活性,在心血管系统中,通过激动心脏 M3受体产生负性频率和负性肌力作用,对离体大鼠心肌缺血 /再灌注损伤的作用及机制已有较明确的研究〔1～5〕，但对心肌缺血所诱导的心肌细胞凋亡仅有初步探讨〔6，7〕。本
实验拟分组观察外源性胆碱和M3受体阻断剂4 二苯乙酰氧 N 甲基哌啶甲碘化物(4DAMP) 对H2O2诱导的大鼠培养心肌细胞损伤模型的作用，并探讨其可能存在的作用机制。
1 材料与方法
实验动物 1～3 d Wistar 大鼠,雌雄不限,由哈尔滨医科大学第二临床医学院实验动物中心提供。
主要试剂 胆碱(Sigma公司)，4DAMP加拿大蒙特利尔实验中心提供，胰蛋白酶(Sigma公司),优级胎牛血清(中国医学科学院生物工程研究所，北京灏洋生物公司),培养液(Gibco公司),AnnexinⅤ/PI细胞凋亡试剂盒(北京宝赛生物技术有限公司)，RNA总提取试剂盒(Promega公司)，RT试剂盒(Promega公司)，PCR扩增试剂盒(Promega公司)
door
female circumcision 心肌细胞原代培养 取1～3 d龄的 Wistar 乳鼠，雌雄兼用，在无菌条件下，取出心脏放入冰浴的无钙、镁缓冲液中，修剪掉心包后，反复冲洗，并剪切至1 mm大小。加%胰蛋白酶消化(37℃,15 min) 后吸出上层细胞悬液，再加酶消化，反复多次，直至组织碎块消化完毕。消化液加入等体积含血清1640 培养液中终止消化,经100目不锈钢过滤,1 000 r/min，
离心8 min后，去除上清，加含10%胎牛血清的1640培养液轻轻吹打成单细胞悬液。细胞计数后按10个/ml的浓度等量接种于50 ml培养瓶中。放入体积分数 50 ml/L CO2孵育箱中培养，每24 h更换培养液1次，培养4～6 d待实验。一部分细胞悬液接种于盖玻片上同时培养。细胞状态要求:一般接种 24 h后便可见细胞的不规律搏动，4 d后细胞呈单层分布，自发搏动规律。
诱导心肌细胞凋亡的实验分组 将盖玻片涂上多聚赖氨酸，放到37℃烘箱中烘干，然后放到6孔板中。提取分离出的细胞，分装在放有盖玻片的6孔板内，每孔115 ml,将细胞分为4组：①阴性对照组(正常组);②H2O2组:H2O2(200 μmol/L)与心肌细胞共育4 h;③胆碱+H2O2组:胆碱(10 mmol/L)处理心肌细胞10 min后，加入H2O2(200 μmol/L)与心肌细胞共育4 h。④胆碱+H2O2+4DAMP组:将胆碱和4DAMP处理心肌细胞10 min后,加入H2O2(200 μmol/L)与心肌细胞共育4 h。
细胞凋亡率检测 6孔板培养的细胞药物处理,%胰酶消化,预冷的PBS洗3次,Binding Buffer重悬细胞,200目筛过筛,调整细胞浓度为1×106个/ml。检测前30 min加入FITC AnnexinⅤ,低温避光孵育,检测前5 min加入碘化丙啶。用流式细胞仪(DB公司FACS CALibur)检测细胞凋亡率。
culti RT PCR反应
自学网 总RNA提取 利用Trizol Reagent总RNA提取试剂盒，按照说明书的要求操作，并用RNa free的DNaⅠ(Promega，Madison,WI,USA)进行DNA消化，以保证总RNA中不含有DNA污染，然后以甲醛变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度仪检测RNA的质量和浓度。
RT PCR反应 取5 μg总RNA,构成10 μl反应体系,按Promega公司逆转录试剂盒说明书进行cDNA的合成。得到cDNA后,进一步进行常规PCR，每一种细胞均取2 μl cDNA,用Promega公司的PCR扩增试剂盒进行PCR扩增,总反应体积25 μl。扩增条件为:94℃预变性3 min，94℃变性1 min，退火温度72℃ 1 min,72℃延伸5 min,30个循环。用引物设计软件设计引物，Bcl 2 上游引物：5′ TGCACCTGAGCGCCTTCAC 3′;下游引物：5′ CCAGGAGAAATCAAACAAGC 3′，β actin上游引物：5′ ATCATGTTTGAGACCTTCAACA 3′;下游引物：5′ CATCTCTTGGTCGAAGTCCA 3′。
取产物10 ml进行2%琼脂糖凝胶电泳,用100 bp Ladder核酸分子Marker进行对照。
结果检测 将凝胶置于TanonGIS系列数码凝胶图像处理系统中，照相并扫描，利用TanonGSIID图像分析软件()分析确定各特异核酸条带的灰度值。
统计学处理 数据以x±s表表示，采用组间t检验。
text message
2 结 果
曲刚 流式细胞仪检测细胞凋亡 正常组仅有极 少 量 凋亡 细胞 (±)%。表明正常心肌有少量细胞凋亡，H2O2组可见较多凋亡细胞〔(±)%〕，较正常组明显增多(P<);胆碱+H2O2组可见散在凋亡细胞〔(±)%〕，较H2O2组明显减少(P<) ;4DAMP+胆碱+H2O2组仍可见到较多凋亡细胞〔(±)%〕，较胆碱组高(P<)。提示胆碱可降低H2O2诱导的心肌细胞凋亡，而 4DAMP取消了胆碱对心肌细胞的保护作用。
H2O2诱导心肌细胞凋亡后抗凋亡基因Bcl 2 mRNA的表达 在RT PCR的结果中发现，与对照组相比,H2O2组Bcl 2 mRNA表达明显减少(P<);与H2O2组相比,加入胆碱后Bcl 2 mRNA表达又增加(P<);胆碱+4DAMP+H2O2组Bcl 2 mRNA表达减少。表明激动M3受体可以改善Bcl 2 mRNA水平。见图1。
3 讨 论
神经递质受体和离子通道是心肌细胞膜上两大类极其重要的蛋白质，其功能失常是许多心脏疾病发生的原因。目前的研究表明，心脏M3受体具有重要的生理功能和病理意义,可以通过介导一种新型的钾电流(IKm),改善细胞间电信号传导，以及发挥心肌保护作用〔3〕。并且，心脏 M3受体在众多心脏疾病 (如缺血性心律失常、房颤、充血性心力衰竭等 )的发生发展中发挥重要的作用。
damon是什么意思 Bcl 2基因位于染色体18q21,Bcl 2蛋白位于线粒体内膜、核周边及内质上〔8〕。过去认为Bcl 2系抑制抗癌蛋白，但近年来研究提示Bcl 2基因并不促进细胞的分裂，而是促进细胞的生存，抑制细胞的凋亡，其生理功能是防止细胞的衰老，因而与细胞的存活有关〔9〕。若Bcl 2过度表达，则可使细胞凋亡减少。转染后的T、B淋巴细胞存活力明显增强，正常组织中寿命长的细胞基因表达水平也较高。最新研究发现细胞凋亡需要多种蛋白酶的活化，而Bcl 2具有蛋白酶抑制剂的功能，可见Bcl 2抑制细胞凋亡的机制是多方面的。港大面试
本实验在体外用H2O2刺激心肌细胞,结果显示,H2O2对心肌细胞产生损伤作用,心肌细胞存活率明显下降，外源性氧自由基可诱导培养心肌细胞发生凋亡,凋亡细胞百分率高。同
时加入胆碱和H2O2共同孵育,胆碱可显著降低H2O2对心肌细胞的损伤，提高心肌细胞存活率，降低细胞的凋亡率。接下来，本实验应用RT PCR检测大鼠心肌细胞中凋亡抑制蛋白Bcl 2 mRNA表达，结果发现，胆碱使大鼠心肌细胞中的Bcl 2 mRNA表达增加，说明胆碱对心肌细胞凋亡具有保护作用。
【参考文献】
1 刘 艳,王 玲，马满玲,等.M3受体激动剂对大鼠和家兔心脏血流动力学的影响〔J〕.药学学报，20XX;36(2):84 7.
2 Liu Y，Wang Y，Ma ML,et hemodynamic effects of M3 receptor agoniston rat and rabbit heats〔J〕.Acta Pharmac Sin,20XX;36(2)：84 7.
3 Yang BF,Lin HX，Xu CQ,et produces cytoprotec tive effects against ischemic myocardial injuries:evidence for the role of cardiac M3 subtypemuscarinic acetylcholine receptors〔J〕.Cell Physiol Biochem，20XX;16(4 6):163 74.
4 刘 艳，荆玉红，孙宏丽,等.M3受体与大鼠缺血心肌细胞凋亡关系的研究〔J〕.药学学
报，20XX;(5):338 41.
5 Liu Y,Jing YH，Sun HL,et between M3 receptor andmyocyte apoptosis induced by acutemyocardial infarction〔J〕.Acta Pharmac Sin,20XX;(5):338 41.
6 李 丽,刘 艳,李呼伦,等.M3受体激动对心肌细胞损伤的保护作用 〔J〕.哈尔滨医科大学学报,20XX;38(5):416 20.
acrylic 7 刘 艳，孙宏丽，吴 红,等.M3受体对体外H2O2诱导大鼠心肌细胞凋亡的保护作用〔J〕.药学学报，20XX;(11)：887 91.
8 Yang BF,Lin HX,Xiao JN,et musclespecific micro RNA miR21 regulates cardiac arrhythmogenic potential by targeting GJA1 and KCNJ2〔J〕.Nat Med,20XX;13(4):486 91.
