钙离子感受蛋白STIM1与Orai1在钙敏感受体介导钙内流及NO生成中的相互作用
王腊梅;钟华;唐娜;庞丽娟;张春军;何芳
【摘 要】目的:研究Ca2+感受蛋白[基质相互作用分子1(STIM1)与钙释放激活钙通道蛋白1(Orai1)]在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)钙敏感受体(CaSR)介导的钙内流和一氧化氮(NO)生成中的相互作用.方法:将CaSR激动剂精胺[钙池操纵性钙通道(SOC)和受体操纵性钙通道(ROC)均激活]单用或与ROC模拟剂12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯(TPA)+CaSR负性变构调节剂Calhex 231(激活ROC、阻断SOC)、蛋白激酶C(PKC)抑制剂Ro 31-8220和PKCα/β1选择性抑制剂Go 6976(激活SOC、阻断ROC)联合孵育HUVECs;利用免疫荧光技术检测HUVECs中STIM1和Orai1的蛋白表达和共定位;免疫共沉淀法检测STIM1和Orai1之间的相互作用;取2~3代HUVECs随机分为特异性的质粒转染组(shSTIM1+shOrai1组)、空质粒组(vehicle-STIM1+vehicle-Orai1组)和未转染组(control组),将3组细胞分别加入上述4组不同药物刺激,采用荧光探针Fura-2/AM检测HUVECs中Ca2+浓度的变化,NO荧光探针DAF-FM DA负载方法同步检测HUVECs中NO生成的变化.结果:STIM1和Orai1蛋白表达共定位于胞浆,与control组相比,加入Calhex 231+TPA、Ro 31-8220和Go 6976刺激后,STIM1和Orai1在胞浆中
的定位均减少,且二者的相互作用均减弱;在4种不同处理因素作用下,shSTIM1+shOrai1组细胞内Ca2+浓度和NO净荧光强度均明显降低(P<0.05).结论:STIM1与Orai1以二元复合物的形式共同调节CaSR,并通过激活SOC和ROC介导钙内流及NO生成.%AIM:To investigate the interaction of Ca 2+-nsing proteins , stromal interaction molecule 1 (STIM1) and calcium relea-activated calcium channel protein 1 (Orai1), in Ca2+-nsing receptor (CaSR)-mediated extracellular Ca2+ influx and production of nitric oxide ( NO).METHODS: Human umbilical vein endothlial cells (HUVECs) were incubated with CaSR agonist spermine [activating store-operated calcium channels (SOC) and receptor-operated calcium channels ( ROC) ] alone or combined with CaSR negative allosteric modulator Calhex 231+ROC analogue TPA (activating ROC, blocking SOC), protein kina C (PKC) inhibitor Ro 31-8220, or PKCα/β1 lective inhibitor Go 6976 (activate SOC, blocking ROC).The protein expression of STIM1 and Orai1 was determined by the method of immu-nofluorescence .The interaction between STIM 1 and Orai1 was examined by co-immunoprecipitation .The cond to third passages of HUVECs were divided into STIM 1 and Orai1 short hairpin RNA group ( shSTIM1+shOrai1 group ) , vehi
斯克里奇cle-STIM1+vehicle-Orai1 group and control group , and then incubated with the 4 different treatments above .The intracellular Ca2+concentration ( [ Ca2+] I ) was detected using the fluorescent Ca 2+indicator Fura-2/AM.The production of NO was also determined by DAF-FM DA fluorescent probe .RESULTS:The protein expression of STIM 1 and Orai1 was located in the cytoplasm.Compared with control group , the localization of STIM1 and Orai1 in the cytoplasm was reduced after the HUVECs were incubated with Calhex 231+TPA, Ro 31-8220 or Go 6976, and the interaction of STIM1 and Orai1 was de-cread significantly .The [ Ca2+] I and the net NO fluorescence intensity in shSTIM 1+shOrai1 group were significantly re-duced after the 4 different treatments (P<0.05).CONCLUSION:STIM1 and Orai1 are components of SOC and ROC in store-and receptor-operated Ca 2+entry and NO generation .
【期刊名称】《中国病理生理杂志》
【年(卷),期】2017(033)010
【总页数】empirestate8页(P1773-1780)
【关键词】基质相互作用分子1;钙释放激活钙通道蛋白1;钙敏感受体;一氧化氮
【作 者】王腊梅;钟华;唐娜;庞丽娟;张春军;何芳
【作者单位】connection石河子大学医学院新疆地方病与民族高发病教育部重点实验室,新疆石河子832002;石河子大学医学院病理生理教研室,新疆石河子832002;石河子大学医学院新疆地方病与民族高发病教育部重点实验室,新疆石河子832002;石河子大学医学院病理生理教研室,新疆石河子832002;石河子大学医学院新疆地方病与民族高发病教育部重点实验室,新疆石河子832002;石河子大学医学院病理生理教研室,新疆石河子832002;石河子大学医学院新疆地方病与民族高发病教育部重点实验室,新疆石河子832002;石河子大学医学院病理教研室,新疆石河子832002;石河子大学医学院新疆地方病与民族高发病教育部重点实验室,新疆石河子832002;石河子大学医学院病理生理教研室,新疆石河子832002;石河子大学医学院新疆地方病与民族高发病教育部重点实验室,新疆石河子832002;石河子大学医学院病理生理教研室,新疆石河子832002
【正文语种】中 文
【中图分类】R363;R541
钙离子(calcium ion，Ca2+)是细胞内重要的信号分子，钙库的排空可以激活胞外Ca2+的内流，这种钙内流的方式被称作钙池操纵性钙内流(store-operated calcium entry，SOCE)，在传递细胞信息方面非常重要。血管内皮细胞持续Ca2+内流可释放舒张因子如一氧化氮(nitric oxide，NO)以维持血管内环境稳定。血管内皮功能障碍是多种心血管疾病的共同病理机制。在人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)中，精胺(spermine)可通过激活钙敏感受体(Ca2+-nsing receptor，CaSR)而引起细胞内钙离子浓度(intracellular Ca2+ concentration，[Ca2+]i)升高及NO的生成。
suburb在生理条件下，钙池操纵性钙通道(store-operated calcium calcium channels，SOC)和受体操纵性钙通道(receptor-operated channels，ROC)作为非兴奋细胞介导的胞外Ca2+内流的主要途径，两者以协同的方式参与了CaSR激活，进而引发持续Ca2+内流和NO生成[1-2]。本课题组近期的研究逐步揭示了SOCE的分子机制，确定了瞬时受体电位通道1(transient receptor potential channel 1，TRPC1)、基质相互作用分子1(stromal interaction molecule 1，STIM1)和钙释放激活钙通道蛋白1(calcium relea-activated calcium channel protein 1，Orai1)均为参与CaSR经SOC和ROC介导的Ca2+内流和NO生成过程中的关键分子组件，以SOCE复合体的形式对疾病的发生发展产生作用[3]。亦有研
究表明组成SOC亚基的Orai1、TRPC1和STIM1关键分子组件和相互作用模式在不同细胞类型有所不同。如在Jurkat细胞Orai1是构成SOC必需的分子组件，敲低TRPC1或TRPC3则不影响SOC和ROC。本研究拟在前期工作的基础上，试图阐明STIM1与Orai1在钙敏感受体介导Ca2+内流和NO生成中的相互作用模式，有助于学者以介导钙活动相关机制为靶点进行药物筛选，并为心血管疾病防治提供新思路。
1 实验材料
健康孕妇剖宫产的新鲜脐带来自华中科技大学同济医学院附属同济医院妇产科(性别和体重不限)，该实验经伦理委员会批准和个人知情同意。
blest2 主要试剂
内皮细胞培养基(Sciencell)；蛋白酶抑制剂(Calbichem)；G418(Biosharp)；去内毒素高纯度质粒抽提试剂盒(Omega)；LipofectamineTM 2000、Fura-2/AM与Opti-MEM(Invitrogen)；shRNA(上海吉凯基因化学技术有限公司)；BCA蛋白定量试剂盒和DAF-FM DA(NO荧光探针)(Beyotime)；ECL发光试剂盒(ThermoBiosharp)；鼠抗人STIM1
单克隆抗体和鼠抗人Orai1多克隆抗体(Abcam)；鼠抗β-actin单克隆抗体(Santa Cruze)；II 抗(Protein Tech)；其余均为国产分析纯试剂。
3 主要仪器
CX-102型超净工作台(安徽蚌埠净化设备厂)；二氧化碳培养箱(Thermo)；Ca2+成像系统FV300、倒置荧光显微镜IX-70和激光共聚焦显微镜FV300(Olympus)。
iconfinder4 方法
九年级上册英语课文4.1 HUVECs的培养 依据参考文献的方法[4-5]培养HUVECs，在无菌条件下取健康孕产妇剖宫产胎儿的新鲜脐带。采用胰酶消化法用含10%胎牛血清的ECM培养基(添加100 mg/L青霉素和100 mg/L链霉素混合液)原代培养HUVECs，于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养，待细胞生长至90%融合时进行常规传代。
重组质粒由实验室前期构建，基因转染步骤参照LipofectamineTM 2000试剂盒说明书进行。结合文献[6]的方法，取对数生长期的HUVECs接种于6孔板(取2个6孔板铺板)，待细胞融合至85%时，将STIM1 shRNA与Orai1 shRNA联合转染至HUVECs中。实验中1～3孔为
转染STIM1 shRNA和Orai1 shRNA的HUVECs，即实验组(shSTIM1+shOrai1组);4～6孔为空质粒组(vehicle-STIM1+vehicle-Orai1组);7～9孔为未做任何转染处理的细胞，即空白对照组(control组)。分别在转染后的24 h、48 h和72 h于荧光显微镜下观察GFP荧光。同时采用G418进行逐步筛选获得稳定克隆。出埃及记马克西姆钢琴曲mp3下载
市场总监英文4.2 免疫荧光技术检测HUVECs中STIM1与Orai1的蛋白表达 取于玻片上生长24 h 的HUVECs，PBS溶液冲洗细胞，冰甲醇固定20 min后，0.5% Triton-PBS透化10～15 min，封闭后轻甩去封闭液，滴加相应 I 抗混合液，4 ℃孵育(选用湿盒保持玻片湿度)。次日洗片后滴加对应荧光标记的 II 抗混合液(1∶100稀释)，室温避光孵育1 h。洗片，1 mg/L DAPI 室温避光孵育15 min复染细胞核。洗片，滴加防淬灭剂后于荧光显微镜下观察STIM1与Orai1的蛋白表达情况。阴性对照组以PBS代替相应 I 抗孵育，镜下观察并记录结果。
4.3 免疫共沉淀法检测HUVECs中STIM1与Orai1的相互作用 (1)STIM1多克隆抗体沉淀(正向)：将2～3代HUVECs接种于放有圆形玻片的培养皿中，待细胞达85%融合，与药物孵育20 min，加入裂解液充分裂解后，12 000×g 离心 3～5 min，取上清，加入 I 抗，4 ℃摇床过夜，按1∶10体积比加 50%的 Protein G Agaro，4 ℃ 摇床上混匀10 min后，1 000 r/
min，4 ℃离心15 min，吸除上清液，不能吸掉的Protein G Agaro 用裂解液(500 μL)洗涤沉淀5次，洗涤时离心条件和吸除上清液要求同上。完成最后1次洗涤后去上清，加入SDS蛋白上样缓冲液中，混匀煮沸5 min， 200×g 离心 3 min ，取上清进行SDS-PAGE，用Orai1作为I抗(1∶1 000)进行Western blot分析。(2)Orai1单克隆抗体沉淀(反向)：用STIM1作为I抗(1∶1 000)进行Western blot分析，方法同(1)。实验中用非特异性鼠IgG代替 I 抗沉淀作为对照。
4.4 HUVECs中Ca2+浓度的荧光测定 首先将联合转染的HUVECs接种于放有圆形玻片的小培养皿中，待细胞融合至85%以上后，分别加入CaSR激动剂精胺及ROC模拟剂(TPA)+CaSR负性变构调节剂Calhex 231、PKC抑制剂Ro 31-8220与PKCα/β1选择性抑制剂Go 6976。联合转染48 h后将Fura-2/AM与含钙液以1∶499的比例混合后加入，37 ℃孵育细胞后并去酯化处理[6]。激光共聚焦监测荧光的动态变化,分析得出两激发光的荧光强度比值的变化 (即Δratio)以反映[Ca2+]i。
科学的英语
4.5 HUVECs中NO浓度的荧光测定 HUVECs处理同4.4。联合转染48 h后按1∶2 000比例加入DAF-FM DA荧光探针稀释液，37 ℃孵育细胞后室温避光条件下，在细胞层面实时检测刺激前后荧光的强弱[6]，并通过Ingenuity Pathway Analysis软件进行分析。
