南通大学学报(医学版)
Journal of Nantong University (Medical Sciences) 2021 : 41 (1)
6・
D0I:10.16424/jki32-1807/r.2021.01.002
G 蛋白耦联胆汁酸受体激动剂INT777
通过激活AMPK 信号通路抑制施万细胞成髓鞘过程*
关晋东：丁杰，刘晓宇，孙诚***
* ［基金项目］国家自然科学基金青年基金资助项目(81701222)
** ［作者简介］关晋东，男，汉族，生于1995年10月，山西省晋城市人，硕士在读，研究方向：外周神经发育及损伤修复机制的研究。*** ［通信作者］ 孙诚，电话**************,E-mail: ********************
(南通大学教育部/江苏省神经再生重点实验室/神经再生协同创新中心，南通226001)
［摘 要］目的：研究G 蛋白耦联胆汁酸受体(G-protein-coupled bile acid receptor 1, GPBAR1，同时也被称为TGR5) 特异性激动剂6琢-乙基-23(S)-甲基胆酸［6 alpha-ethyl-23(S)-methylcholic acid, INT777［对原代施万细胞髓鞘形成的影响
并初步探讨其可能的作用机制遥方法：用5 滋mol/L 的INT777处理二丁酰环腺苷酸(dibutyryl cyclic adenoslne phosphate, dbcAMP )诱导分化原代施万细胞成髓鞘模型，用免疫印迹(Western Blot )方法检测髓磷脂蛋白表达量的变化遥同时，提取 施万细胞总核糖核酸后用定量聚合酶链式反应试验检测INT777对髓鞘形成过程相关分子基因表达的影响遥另外，用
Western Blot 方法检测INT777对单磷酸腺苷活化蛋白激酶/核糖体蛋白S6激酶(adenosine 5'-monophosphate-activated
英语口语学习资料protein kina/ribosomal S6 kina, AMPK/S6K )信号途径的影响遥结果：在dbcAMP 诱导分化原代施万细胞成髓鞘过程中，
5 滋mol/L INT777的处理抑制了髓鞘早期生长因子20，八聚体结合转录因子6，髓磷脂蛋白的表达，且5滋mol/L INT777 处理激活了 AMPK 的活性，抑制了雷帕霉素作用靶点信号通路遥结论：INT777抑制dbcAMP 诱导的施万细胞成髓鞘过
程，这种抑制作用可能是通过激活施万细胞AMPK 活性、抑制S6K 活性实现的遥
［关键词］施万细胞曰髓鞘曰6琢-乙基-23(S)-甲基胆酸曰单磷酸腺苷活化蛋白激酶
［中图分类号］R338.1 ［文献标志码］A ［文章编号］1674-7887(2021)01-0006-05
G-protein-coupled bile acid receptor agonists INT777 inhibits myelination of Schwann cells by
activating AMPK signaling pathway
*
GUAN Jindong **, DING Jie, LIU Xiaoyu, SUN Cheng ***
('Key Laboratory of Neuroregeneration of Jiangsu and Ministry of
Education, Co-innovation Center of Neuroregeneration, Nantong University, Nantong 226001)
［Abstract ］ Objective: To investigate the effects of G-protein-coupled bile acid receptor 1(GPBAR1, also known as TGR5)specific agonist 6 alpha-ethyl-23(S)-methylcholic acid(INT777) on myelination in primary Schwann cells and the underlying mechanisms. Methods: Primary Schwann cells were treated with 5 滋mol/L INT777 and dibutiryl cyclic adenoslne phosphate (
dbcAMP), and the changes of myelin protein zero were detected by Western Blot. Meanwhile, the total RNA was extracted
from Schwann cells and quantitative real time polymera chain reaction was employed for detecting myelin gene expression. In addition, the effect of INT777 on the adenosine 5' -monophosphate -activated protein kina/ribosomal protein S6 kina (AMPK/S6K) signaling pathway was examined by Western Blot. Results : Treatment with 5 滋mol/L INT777 inhibited the
expression of myelin early growth respon -2, octamer -binding transcription factor 6, and myelin protein zero during dbcAMP-induced myelination of differentiated Schwann cells, and treatment with 5 滋mol/L INT777 activated AMPK activity and inhibited mTOR signaling pathway. Conclusion: INT777 attenuates dbcAMP-induced myelination of Schwann cells, which
may be achieved by activating AMPK and inhibiting S6K activity.
［Key words ］ Schwann cell; myelination; 6 alpha-ethyl -23(S)-methylcholic acid; adenosine 5'-monophosphate-activated protein kina
外周神经系统(peripheral nervous system, PNS) 在机体内分布广泛且起到介导靶器官与中枢神经系 统信号传递的重要作用。轴突的髓鞘化是神经系统
传递神经冲动信号，执行其功能的基础保障，髓鞘化 过程异常会导致多种疾病的发生［1］o 外周神经中执行
髓鞘形成这一重要任务由施万细胞完成。外周神经
髓鞘形成过程是一个严谨的、由多种转录因子参与 调控的复杂生理过程叫 这些转录因子包括SRY 盒
转录因子 10(SRY-box transcription factor 10, Sox10)， 八聚体结合转录因子 6(octamer-binding transcription
关晋东，等.G蛋白耦联胆汁酸受体激动剂INT777通过激活AMPK信号通路抑制施万细胞成髓鞘过程7・
factor-6,Oct6)，髓鞘早期生长因子20(early growth respon-2,Krox20)，髓磷脂蛋白(myelin protein zero, MPZ)等。
G蛋白耦联胆汁酸受体(G-protein-coupled bile acid receptor1,GPBAR1，同时也被称为TGR5)，在多
种组织和器官中有不同水平的表达，功能多样耳有报道网指出TGR5可通过激活环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophsphate,cAMP)-单磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine5'-monophosphate-activated protein kina,AMPK)信号通路调节恶性肿瘤的发生发展过程。6a-乙基-23(S)-甲基胆酸［6alpha-ethyl-23 (S)-methylcholic acid,INT777］是TGR5特异性激动剂，具有毒性低、效价高等特点。研究冋发现施万细胞与背根神经节(dorsal root ganglia,DRG)神经兀共培养模型中，二丁酰环腺苷酸(dibutyryl cyclic adenoslne phosphate,dbcAMP)的添加能促进细胞分化，加速髓鞘化进程。本研究旨在通过激动剂INT777处理原代施万细胞，明确其对外周神经髓鞘化进程的作用，并初步探讨其作用机制。
1材料与方法
1.1实验动物出生1d的SD大鼠红皮30只购于南通大学实验动物中心。
1.2实验试剂Forsklin,HRG(human Heregulin-1)、dbcAMP、Trizol、ComC(Compound C)均购于MERCK 公司，DMEM高糖培养基、胰蛋白酶、胎牛血清均购于 Gibco公司，SuperScript IV/RT-PCR Kit Applied Biosystem SYBR Green Mix购于Thermo Fisher公司,SDS-PAGE凝胶购于碧云天生物公司，细胞裂解液RIPA,5xSDS-PAGE电泳缓冲液、5xSDS-PAGE Loading buffer、10xTrans buffer10x三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液(Tris buffered saline tween,TBST)均在实验室自配。
1.3实验方法
1.3.1施万细胞培养施万细胞的分离纯化参考前人方法，进行稍许改良冋。出生1d的SD红皮鼠,5%乙醇消毒，置于冰盒上冷冻麻醉。沿着坐骨神经走向迅速分离，使神经充分暴露，尽快取出坐骨神经剪碎并放置于预冷的DMEM培养基中,1000g离心5min，弃上清。随后加入1mL浓度为3mg/mL的胶原酶溶液37益孵育30min,1000g离心5min，弃上清。加入胰蛋白酶溶液37益孵育10min，弃上清，加入完全培养基重悬，过400目筛网，并在中皿培养。过夜后，换含10滋mol/L阿糖胞^(Cytarabine,Ara-C)培养48h o随后换含2滋mol/L Forskolin和50ng/mL HRG的培养基，继续培养细胞。当密度达到接触抑制时，吸出上清液，用1mL含Thy1.1抗体的培养基重悬细胞，冰上孵育1h,1000g离心5min，弃上清。再用1mL含补体的培养基37益孵育1h，离心，DMEM高糖培养基重悬种于中皿等待后续实验。本实验严格遵守南通大学动物实验伦理委员会要求，保障实验动物福利。
1.3.2施万细胞处理5滋mol/L的INT777处理施万细胞，分为4组：对照组(NC)、dbcAMP处理组(终浓度为1mmol/L)、INT777处理组及dbcAMP+ INT777处理组。随后，为了进一步验证可能的作用机制，将施万细胞分为4组：对照组(NC)、dbcAMP处理组(终浓度为1mmol/L)、dbcAMP+INT777处理组及dbcAMP+INT777+ComC(终浓度为10nmol/L)处理组。药物处理24h后收样用于后续研究。
desires
enhance1.3.3施万细胞总RNA提取实验过程严格按照说明书步骤进行。通过Trizol试剂裂解施万细胞，经氯仿变性及异丙醇沉淀后，最终获得高质量的总RNAo测定浓度，定量至1滋g后逆转录成cDNA第1链,4益保存用于后续定量实时聚合酶链式反应试验(quantitative real time polymera chain reaction, qPCR)
研究。
1.3.4施万细胞总蛋白质提取所有的步骤均在冰上进行。药物处理后的施万细胞中加入预冷的细胞裂解液RIPA250滋L，用一次性细胞刮将细胞刮离，收集于1.5mL的离心管中。冰上敷育30min，期间不断震荡，4益，12000r/min离心20min后，通过BCA方法进行蛋白质定量。各组样品蛋白浓度调至相同水平，加入上样缓冲液，混匀后于100益加热5min，冷却至室温用于后续Western Blot分析。
1.3.5细胞免疫荧光细胞种于24孔板中预先放置的玻片上，处理完毕后弃上清，多聚甲醛固定。磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗3遍后室温封闭0.5h,—抗过夜。第2天PBS洗净一抗，二抗室温孵育2h,PBS洗3遍后染核。最后在载玻片上滴加荧光封片剂，将玻片正面盖在载玻片上，蔡司荧光显微镜拍照分析。
1.3.6qPCR按照Thermo Fisher公司说明书要求进行实验，每个样品做3个生物学重复，对结果中的Cq值，按照2盘。方法进行计算分析。引物序列为：18S rRNA正向引物:5'-AGCTCCAATAGCGTATAT-TAAAG-3'；负向弓丨物：5'-CGGTCCTATTCCATTAT-TCCTA-3'。Krox20正向引物：5'-TGGGTTTAAG-
8・
南通大学学报（医学版）2021 : 41(1)
TATGGCTGTATA-3'；负向弓【物：5'-AGTTAGTGGT-
TCTGTGTTAGA -3'。MPZ 正向引物：5' -GGATAA GAAATAGCGGTTAGC -3'；负向弓丨物：5'-TTGAGG-
CTGGTTCTACTG -3'。Oct6 正 向引物：5' -TTCC -
TAATTTCTGACCCATCT-3'；负 向引物：5' -GCAAT- AAAGATACAAAGAGAATGG-3'。
1.3.7 Western Blot 预先制备十二烷基硫酸钠聚注:A, DAPI 标记施万细胞核;B, TGR5定位于施万细胞的膜
和胞质中；C, MERGE, DAPI 与TGR5的合图。
图1 TRG5在原代施万细胞中的表达定位
丙烯酰胺凝胶，加样后进行电泳和转膜。室温封闭1 h , 一抗4益过夜。隔天用含有吐温的TBST 洗净一抗,
室温孵育二抗1 h,TBST 洗净，最后配置显影液显影。
1.3.8统计学方法采用SPSS 25.0统计学软件进 行数据分析，以軃s 表示，两组间比较采用t 检验，组 间比较采用one-way ANOVA 检验,P <0.05为差异
有统计学意义。
四六级考试官网报名入口2 结 果
2.1 TGR5在施万细胞的定位通过细胞免疫荧光
图2■ NC
= INT777
Q dbcAMP
MINT777+dbcAMP
**61
*4"
2-
***
***
***
1_'1
Krox20 Od6 MPZ
注：*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001。
INT777抑制dbcAMP 诱导施万细胞成髓鞘模型中髓鞘技术观察TGR5在施万细胞中的表达情况，结果显示
TGR5表达于施万细胞的膜与细胞质中（图1）。因此, 施万细胞体外添加激动剂INT777可有效激活TGR5。
2.2 INT777抑制髓鞘相关因子的表达 qPCR 技术
检测INT777与dbcAMP 诱导分化施万细胞成髓鞘 之间的关系。结果显示,5 滋mol/L 的INT777处理可 显著抑制髓鞘相关基因如Krox20.Oct6及MPZ 的 表达（图 2）。
2.3 INT777激活施万细胞p-AMPK 信号通路 通
相关基因的表达
过Western 印迹技术探究INT777抑制髓鞘基因表
达的可能机制，其中dbcAMP 可有效诱导体外施万
细胞髓鞘的分化形成，因而通常用作阳性对照组。实 验结果显示INT777促进了 p-AMPK 的表达，抑制
p-ERK 与p-S6K 的活性（图3），因此，推测INT777 可能是通过激活AMPK 进而抑制S6K 活性来抑制 施万细胞的成髓鞘过程。
A
B
dbcAMP - + - +INT777 -
-
+
+
p-S6K ［「-----—n
p-AMPK | 一 一 •-—
■55'50'55z z L L 0 0
p-S6K/0-acti INT777 - - + + dbcAMP - + - +
p-AMPK/AMPK
MPZ/0-actin
p-ERK/ERK
注:
A,Western Blot 结果;B,A 图的统计结果。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 oabc news
图3 INT777影响dbcAMP 诱导施万细胞成髓鞘模型中AMPK/S6K 信号通路
2.4 ComC 促进施万细胞髓鞘的形成 ComC 是
AMPK 特异性的抑制剂，之前的实验结果显示INT777 通过激活施万细胞AMPK 活性抑制了髓鞘相关基
因的表达，为进一步证实这个猜想，随后在细胞内加 入10 nmol/L ComC 来抑制AMPK 活性，qPCR 及
Western Blot 结果显示相对于INT777处理组而言， ComC 与INT777双处理后逆转了 INT777对髓鞘基 因表达的抑制效果（图4）。
3 讨 论
PNS 中的外周神经纤维是传输神经冲动的主要
载体，而外周神经纤维主要由轴突、髓鞘和结缔组织
构成的神经内膜组成， 其中影响神经冲动传导的关 键是髓鞘叫髓鞘主要是由施万细胞以1：1模式包裹
直径>1滋m 的轴突而形成的阻施万细胞不仅在维持
外周神经稳态和髓鞘发育过程中发挥重要作用，
且
关晋东，等.G蛋白耦联胆汁酸受体激动剂INT777通过激活AMPK信号通路抑制施万细胞成髓鞘过程9・
A・NC口dbcAMP
口INT777+dbcAMP酬INT777+dbcAMP+ComC
^首戈之电5
4
3
2
1
*
*
*_
B ComC---+
dbcAMP-+++
INT777--++
p-ERK/ERK
I***** Krox20Octo MPZ
p-S6K/0-actin p-AMPK/AMPK
INT777--++ dbcAMP-+++
-++
+++smn是什么
mcx2.5
MPZ/p-actin
********
1.0”■~~■-----美就在身边
-■!***|**匕U10|<--------1I--------1r~~""I
2.0
1.5
1.0
0.5
0.00.0
++
+++++ ;B,Western Blot结果;C,B图的统计结果。**P<0.01,***P<0.001
ComC挽救INT777对施万细胞髓鞘相关基因表达的抑制作用
++
host+
ComC---+
注:A,qPCR结果
图4
能修复损伤的髓鞘[9]o
外周神经髓鞘形成过程分为预髓鞘阶段和成熟髓鞘阶段，是一个严谨的、由多种转录因子参与调控的复杂生理过程。研究问表明，转录因子Sox10与Oct6主要存在于预髓鞘阶段,Sox10是施万细胞形成髓鞘并维持其稳定所必需的，且能激活Oct6，从而启动施万细胞进入预髓鞘化阶段。Sox10与Oct6协同作用可诱导转录因子Krox20的表达，从而促使预髓鞘阶段向髓鞘化阶段转变。Krox20因子一方面可激活大量髓鞘化基因如MPZ及髓磷脂碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)的表达，另一方面可抑制去髓鞘化基因(Sox2、c-Jun)的表达，通过这两方面的作用，促进稳定成熟的髓鞘套的形成问。虽然对外周神经髓鞘形成过程的研究很多，但具体的作用机制并不十分清楚。
TGR5属于GPCR家庭成员，可以调节能量平衡和糖代谢过程，促进胰岛素的分泌和生物合成[12]，参与多种肿瘤的发生发展过程[13]，可激活炎症因子而产生抗炎、利胆作用[14]，也可减轻肝脏炎症，抑制动脉粥样硬化斑块形成问。TGR5作为膜受体，可与相应配体结合内化到细胞质中，在核因子-k B、蛋白激酶B(protein kina B,PKB)和细胞外信号调节激酶(extracellular regulated protein kina,ERK)等信号通路中发挥重要作用皿叫该受体经典的下游靶标是cAMP(由乙酰辅酶A催化ATP后形成)，可直接提高体内PKA活性，抑制AMPK活性两。但是，本研究结果显示在施万细胞中5滋mol/L INT777的处
理激活了AMPK，推测这一现象可能与INT777浓度有关。INT777Deoxycholic acid、TGR5Receptor Agonist等都是TGR5的激活剂，其中INT777因其特异性佳，效果好，毒性小而常被研究者使用。研究凹指出，溶血磷脂酸LPA通过刺激施万细胞等胶质细胞来调节氯喹和TGR5激动剂INT777引起的神经元反应，如瘙痒、疼痛等症状。有研究㈣报道指出脂肪细胞及肝脏细胞经INT777处理显著地提高了胞内cAMP的表达，提高了细胞能量代谢效率，而INT777在dbcAMP诱导的原代施万细胞成髓鞘模型中是否也发挥着同样的作用及具体的作用机制有待进一步研究。
众所周知,AMPK的活化可以延缓合成代谢反应，降低能量消耗，已有报道01指出AMPK可以负向调控外周神经髓鞘的发育。施万细胞中LKB1-AMPK 和mTOR信号网络调节轴突完整性和髓鞘的形成㈣。本研究中,INT777的处理抑制了髓鞘相关因子Krox20、Oct6及MPZ的表达，且促进了p-AMPK 的表达，这与前人㈣报道一致。mTOR信号通路是调控外周神经髓鞘发育的经典的信号途径，而p-S6K 是非常关键的调控因子㈣。髓鞘形成是一种代谢性生理过程,mT0R信号通路作为一种协调细胞代谢的信号中枢，被认为是髓鞘形成的关键信号㈤。本研究显示INT777的处理提高了p-AMPK的表达，抑制了p-S6K的活性，表明该药物对外周神经髓鞘的
-10・南通大学学报（医学版）2021:41(1)
影响可能是通过激活AMPK，抑制S6K活性来发挥作用的。为进一步验证这一猜想，在INT777处理的施万细胞中又同时添加了AMPK的抑制剂ComC，通过Western Blot等证实ComC的添加逆转了INT777对髓鞘发育过程的抑制现象。表明INT777可能通过AMPK信号通路发挥其对髓鞘化过程的影响。
总之,INT777可抑制dbcAMP诱导的施万细胞髓鞘化过程，并且是通过激活AMPK活性，抑制S6K 活性来实现的。
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