亲子鉴定DA提取标准操作规程

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DA提取标准操作规程

1. 目的：规范不同检材的DA提取操作程序，确保DA质量，保证STR分型结果准确性。

2. 原理：

Chelex-100 是一种由苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成的化学螯合树脂，含有成对的亚氨基二乙

酸盐离子，可螯合多价离子，特别是对高价金属离子有很高的亲和力和螯合作用。在低离子强度、

碱性及煮沸的条件下，可以使细胞膜破裂，并使蛋白质变性，通过离心除去Chelex颗粒，使其结

合的物质与DA 分离。

磁珠法提取核酸是通过细胞裂解液裂解细胞，从细胞中游离出来的核酸分子被特异的吸附到磁

性颗粒表面，而蛋白质等杂质不被吸附而留在溶液中。反应一定时间之后，再在磁场作用下，使磁

性颗粒与液体分开，回收颗粒（即磁珠-DA 混合物），再用洗脱液洗脱即可以得到纯净的DA。

3. 操作者：具有法医物证检验资格的广西区妇幼司法鉴定所技术人员。

4. 标本：5％EDTA抗凝全血、8-10ml胎儿羊水、5％EDTA抗凝脐血、FTA纸血斑、口腔拭子、5-10

根带毛囊的毛发、绒毛细胞。

5 试剂：

5.1 试剂的厂家及规格：

5.1.1 DA抽提试剂 Chelex-100 伯乐公司（Bio-Rad Laboratories, Inc. CA U.S.A）。

5.1.2 DA抽提试剂 Promega PP18或PP21 DA System抽提试剂盒。

5.1.3 DA抽提试剂 口腔棉签制备基因组DA试剂盒（G&T，U.S.A）

5.1.4 无水乙醇 分析纯

5.1.5 异丙醇 分析纯

5.1.6 无菌的超纯水由实验室技术人员制备。

5.2 试剂的配制：

5.2.1 5％Chelex-100的配制：称取5克粉状Chelex-100于试剂瓶中，加入灭过菌的超纯水至

100ml。

5.2.2 灭菌超纯水的制备：用干净的试剂瓶装超纯水1升左右，经121℃灭菌30分。

6 仪器及设备：

6.1 生物安全柜。

6.2 高速离心机。

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6.3 超速冷冻离心机。

6.4 移液器，单道微量移液器（0.5-10 ul单道）、单道微量移液器（10-100 ul单道）、单道微量

移液器（100-1000 ul单道）、八道移液器（0.5-10 ul八道）和八道移液器（10-100 ul八道）。

6.5涡旋混匀器。

6.6半导体温控混匀器。

6.7超纯水制造系统。

7 操作程序：

7.1 全血或脐血的DA抽提（Chelex-100法）

7.1.1填写“PCR-STR基因扩增实验记录表”。

7.1.2 按照PCR-STR基因扩增实验记录表顺序标记1.5ml EP管，加无菌超纯水980ul。

7.1.3核对血样，用移液器混匀，吸取1.5ul标本于EP 管中（-80℃存放超过一个月的血样取

2-3.5ul）。

7.1.4颠倒混匀，12600rpm离心3.5min，弃上清，剩余沉淀约20ul。

7.1.5 加无菌超纯水980ul，颠倒混匀，12600rpm离心3.5min，弃上清，剩余沉淀约20ul。

7.1.6取混匀的5% Chelex-100溶液200 ul于EP管中（吸取时注意先摇匀5% Chelex-100），盖紧

EP 管，振荡约15～20sec后， 56℃孵浴0.5～2h。

7.1.7 孵浴结束后振荡约15～20sec， 99℃孵浴8 min。

7.2羊水或绒毛A抽提（Chelex-100法）

7.2.1填写“PCR-STR基因扩增实验记录表”。

7.2.2 按照PCR-STR基因扩增实验记录表顺序标记1.5ml EP管，加无菌超纯水700l。

7.2.3核对标本，用移液器混匀，吸取300l于EP 管中。

7.2.4颠倒混匀，12600rpm离心3.5min，弃上清，剩余沉淀约20ul。

7.2.5 加无菌超纯水1000ul，颠倒混匀，12600rpm离心3.5min，弃上清，剩余沉淀约20ul。

7.2.6取混匀的5% Chelex-100溶液200 ul于EP管中（吸取时注意先摇匀5% Chelex-100），盖紧

EP 管，振荡约15～20sec后， 56℃孵浴0.5～2h。

7.2.7 孵浴结束后振荡约15～20sec， 99℃孵浴8 min。

7.2.8 孵浴结束后趁热振荡约15～20sec，12600rpm离心3.5min，上清即为DA溶液。

7.3 毛发的DA抽提（Chelex-100法）

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7.3.1填写“PCR-STR基因扩增实验记录表”。

7.3.2 按照PCR-STR基因扩增实验记录表顺序标记1.5ml EP管，加无菌超纯水980ul。

7.3.3核对血样，用移液器混匀，吸取1.5ul全血于EP 管中（-80℃存放超过一个月的血样取

2-3.5ul）。

7.3.4颠倒混匀，12600rpm离心3.5min，弃上清，剩余沉淀约20ul。

7.3.5 加无菌超纯水980ul，颠倒混匀，12600rpm离心3.5min，弃上清，剩余沉淀约20ul。

7.3.6取混匀的5% Chelex-100溶液200 ul于EP管中（吸取时注意先摇匀5% Chelex-100），盖紧

EP 管，振荡约15～20sec后， 56℃孵浴0.5～2h。

7.3.7 孵浴结束后振荡约15～20sec， 99℃孵浴8 min。

7.3.8 孵浴结束后趁热振荡约15～20sec，12600rpm离心3.5min，上清即为DA溶液。

7.4 血斑的DA抽提（磁珠法）

7.4.1填写“PCR-STR基因扩增实验记录表”。

7.4.2 按照PCR-STR基因扩增实验记录表顺序标记1.5ml EP管，核对样本，

7.4.3剪取合适大小的样品（2-3mm）放置EP管中。

7.4.4加入Lysis Buffer 150ul盖紧盖子70℃孵育30min。

7.4.5室温下，12000rpm离心2min，吸取上清至一新1.5ml离心管中。

7.4.6将漩涡震荡10s，将resin混匀，取7ul resin加入到样品中。

7.4.7高速漩涡震荡样品/Lysis Buffer/resin混合液3秒钟，室温孵育5min，并且每孵育1min

震荡3秒。

7.4.8高速漩涡震荡2秒，将离心管放置磁力架，resin与溶液分开（注1）。

7.4.9小心吸弃溶液不要碰到聚集成块的resin（注2）

7.4.10加100ul 准备好的Lysis Buffer洗涤，将离心管移出磁力架，高速漩涡震荡2秒。

7.4.11将磁力架再次置于磁力架，将Lysis Buffer吸弃干净。

7.4.12加入100ul准备好的1X Wash Buffer，移出磁力架，高速漩涡震荡2秒立即放回磁力架，

吸弃Wash Buffer，连续洗涤3次，最后1次洗涤将Wash Buffer移除干净。

7.4.13将离心管盖子打开，室温下干燥5-20min。

7.4.14加100ul Elution Buffer，盖上盖子漩涡震荡2秒，65℃孵育5min。

7.4.15孵育后，漩涡震荡2秒后再次放入磁力架。小心吸取DA溶解液至一新离心管中，保存（注

3）。

注1：如果resin不能形成明显的一团与溶液分开，则重新震荡迅速放置磁力架上。

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注2：如头不小心吸到resin，则轻轻打回再次分离。

注3：DA可以4℃短期保存或-20、-70℃长期保存。

7.5 口腔拭子的DA抽提（试剂盒）

7.5.1填写“PCR-STR基因扩增实验记录表”。

7.5.2 按照PCR-STR基因扩增实验记录表顺序标记1.5ml EP管。

7.5.3核对标本，将棉签头部（约1.5厘米长）剪短，置于标记好的EP管中。加入600微升SWA

溶液，使棉签浸泡在溶液中。

7.5.4盖紧EP管盖子置振荡器剧烈震荡20秒，使黏附在棉签上的口腔细胞脱落到液体中。震荡后

会出现很多气泡。

7.5.5 60℃温浴10分钟，充分裂解。

7.5.6温浴结束，待冷却到室温后用镊子夹住棉签头，在试管壁上挤压出所吸附的液体后废弃棉签

头。镊子用酒精纸巾擦干净后可直接用于其他样品。根据不同种类棉签，这时试管中液体体积大约

在400到450微升之间。

7.5.7 加入150微升试剂SWB，颠倒混匀数次，透明溶液变成白浑浊液。

7.5.8 以每分钟13000转离心10分钟，用加样器吸取透明上清液置于另外一干净的EP管。溶液体

积大约在540到600微升之间，会观察到溶液出现浑浊现象。吸样时注意必须保留管底30到40微

升沉淀物，内含细胞残渣和蛋白质沉淀。

7.5.9 在以上取得的溶液中加入400微升异丙醇，颠倒混匀30次使DA充分沉淀。这时肉眼看不

见丝状DA沉淀。

7.5.10 以每分钟13000转离心15分钟，小心吸弃上清液，不要接触试管底DA沉淀。

7.5.11 加入500微升75%乙醇，以每分钟13000离心5分钟。尽量吸弃上清液。然后打开EP管盖

置室温5分钟，使残留乙醇挥发干净。

7.5.12 加入100微升TE缓冲液。置室温过夜或65℃小时，使DA充分溶解。4℃保存备用，-20℃

或-80℃长期保存。

8. 防护

8.1 实验过程中须穿上专用的实验服，带帽子和口罩，带一次性的PE手套或无粉橡胶手套。如果

手套破损、刺破、或失去其屏障功能，则应尽快更换。

8.2 实验操作必须在生物安全柜中进行。

8.3 如果不小心被血样溅到皮肤，立即用75％的乙醇擦拭消毒，然后用自来水冲干净。溅到眼睛，

立即用洗眼器清洗。

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8.4每天工作前和工作后对实验室进行常规消毒并做好记录：每天工作前生物安全柜和空气用紫外

线照射30分钟以上，工作结束后空气用紫外线照射60分钟以上。

8.5衣物污染时，尽快脱掉污染的衣物，进行消毒处理。发生小范围污染物泼溅事故时，应立即进

行消毒处理。发生大范围污染物泼溅事故时，应立即通知实验室主管领导和安全负责人到达事故现

场查清情况，确定消毒的程序。

9. 注意事项

9.1在实验完毕后实验台面及桌面，实验垃圾放到指定位置，由清洁人员拿走处理。

9.2 在实验完毕后，按实验室清洁消毒程序进行清洁、消毒工作，并填写实验消毒登记表。

9.3在实验工作结束后或取下手套后应立即洗手。在离开实验室之前应脱下所有的个人防护装备。

9.4 在离开实验室之前应关掉所有仪器的电源并拔下插头（生物安全柜除外）。

10. 参考文献：

1)杨本海,刘永忠. Chelex-100一步法快速提取外周血DA.皖南医学院学报,1999 ,18 (1): 9-10.

2). 陈 辉,刘永波,等.有机酚法和Chelex - 100 法提取不同组织微量DA 效果比较.郑州大学

学报(医学版).2004,6(39):988-991.

3). 步嵘,王耀平,等.以Chelex 100 为介质抽提DA. 中华病理学杂志.1999 , 5 (28) :379-380.

4). Walsh PS , Metzger DA , Higuchi R. Chelex-100 as a Mediumfor simple extraction of DA

for PCR-Based typing fromforensic material . Biotechniques 1991 ,10 :5062513.

5). Sepp R , Szabo I , Uda H , et al . Rapid techniques for DA extraction from routinely

processed archival tissue for use in PCR. J Clin Pathol , 1994 ,47 :3182323.

11. 本SOP的变动程序：本标准操作程序如须修改或项目增删，须经论证合理并实验验证后，由研

究所所长审核签署同意后颁布执行。

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