毛细管电泳联合二代测序技术用于亲子鉴定突变分析

刑事技术

2021年 第46卷 第3期

·论 著·

DOI10.16467/j.1008-3650.2020.0006

：

毛细管电泳联合二代测序技术用于亲子鉴定突变分析

张庆霞，刘金杰，付丽红，任 贺，刘小芳，陈 冲，贾 丽，石 妍，

11121111

赵 怡，焦章平，刘雅诚，马万山，李 健

1111,2

*

（1. 北京市公安司法鉴定中心，北京100192；2. 北京警察学院，北京102202）

摘 要： 目的 联合应用毛细管电泳与二代测序技术，探索肯定亲权案件中的STR基因座的突变率和突变方式。

方法 2600例肯定亲权关系的案件材料采用PowerPlex21试剂盒进行STR检验，发现67例存在基因座突变，对

该67例亲子关系（62例三联体，5例二联体）的196个样本用SeqTyper平台

®TM

24构建文库，使用Ion PGM

进行二代测序。结果 12个STR基因座共发现71个突变，父源突变与母源突变的比例为3.13‥1。其中64例

亲子关系观察到1个基因座突变，2例观察到2个基因座突变，1例观察到3个基因座突变，有些突变从毛细

管电泳所得STR基因座结果无法判断是增加还是减少了一步，二代测序则可以明晰等位基因的遗传方式及突

变情况。结论 对于复杂核心序列、含不完全重复单位的基因座，有些突变可以通过二代测序明确突变的来源

和方式，更直观地从微观碱基序列的角度观察等位基因的遗传。

关键词：法医遗传学；亲子鉴定；二代测序；短串联重复；突变率；突变方式

中图分类号：DF795.2 文献标识码：A 文章编号：1008-3650(2021)03-0247-05

ext Generation Sequencing Coalesced into Capillary Electrophoresis

to Analyze Mutations from Paternity Testing

ZHAG Qingxia, LIU Jinjie, FU Lihong, RE He, LIU Xiaofang, CHE Chong, JIA Li, SHI Yan, ZHAO Yi,

111211111

JIAO Zhangping, LIU Yacheng, MA Wanshan, LI Jian

111,*2

(1. Beijing Center of Forensic Medical Examination and Identification, Beijing 100192, China;

2. Beijing Police College, Beijing 102202, China)

ABSTRACT: Objective To coalesce capillary electrophoresis into next generation sequencing for exploring the mutational

patterns among STR loci from paternity testing. Methods From 2600 cases of confirmed paternity, the relevant STR loci were

screened with PowerPlex21 kit, thus having 67 cases found of mutations that involved with 196 samples (relating to 62 trios

and 5 duos) which were afterwards detected through SeqTyper24 to construct the correlative library. Further, Ion PGM

®TM

platform was adopted to carry out next generation sequencing. Results There were 12 STR loci having been found of totaling

71 mutations, among which the mutant ratio of paternal to maternal was 3.13:1. Single one-locus mutations were observed

in 64 cases, with the two-locus’ in two cases and the three-locus’ in one case. For some mutations, it is difficult to determine

whether there has been increased or decreased of a step from the capillary electrophoretic results of STR loci. In contrast, next

generation sequencing can clarify the inheritance route and mutational pattern. Conclusion For the locus harboring complex

core sequence and/or incomplete repetitive unit, next generation sequencing is able to identify and confirm certain mutations,

having the inheritance of alleles observed more directly from the microscopic DA base sequences.

KEY WORDS: forensic genetics; paternity testing; next generation sequencing; short tandem repeats (STR); mutation rate;

mutational pattern

基金项目：北京市自然科学基金资助项目（7182022）；河北省法医学重点实验室开放课题（KF201606)

第一作者简介：张庆霞，女，河南淮阳人，硕士，主任法医师，研究方向为法医物证检验与研究。Email:*********************

-

* 通信作者简介：马万山，男，北京人，学士，主任法医师，研究方向为法医物证检验与研究。Email:136****************

-

网络出版时间：20201229；网络出版地址：/10.16467/j.10083650.2020.0006

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·248·

刑事技术

Forensic Science and Technology

2021年 第46卷 第3期

毛细管电泳检测（-）技术早已广于10 000则“支持被检测男子是孩子的生物学父亲”，

STRCESTR

泛应用于亲子鉴定。近年来，二代测序技术开始应在实践中即认为达到认定的水平。

用于法医物证领域。二代测序技术 ( 本文中的三联体的累积亲权指数大于107，二联

[1]

secondgener-

ationsequencingSGSnextgenerationsequencing

，或 ，

GS

)是通过边合成边测序，经捕捉新合成的末端标

记来确定的碱基序列。技术可以同时在一为突变基因座。由于案件受理时样本提供者已确认生

DAGS

个反应内完成数十万到数百万条分子片段的序母，本文三联体按亲母疑父进行计算，当孩子的突变

DA

列测定，具有高测序深度、高并行性和高准确性的特基因来自母亲，在计算值时不考虑已明确来自母

点，能够充分地挖掘有效的遗传信息，在亲子鉴定方亲的突变。

面，应用二代测序技术检测 (-)可以获1.2.3 突变等位基因及来源的确认 

STRGSSTR

得基因座序列内部的结构差异，能增加多态性对于突变基因座要先确定突变的等位基因，再确

STR

信息，因此可以更好地鉴别亲权关系以及突变情况。定来源。

本文联合应用-和-，以2015

CESTRGSSTR

年至2016年北京通达首城司法鉴定所已出具鉴定书在父母的等位基因中，以与突变而成的新等位基

的2 600例肯定亲权关系的案件为基础，对存在因步数相差最小的等位基因为发生突变的等位基因，

STR

基因座不符合遗传规律的67例案件所涉及的196个即优先考虑一步突变，然后再考虑发生概率较小的多

样本，应用步突变，多步突变是通过逐步突变形成的；若相差的

SeqTyper

®

24试剂盒进行文库构建和二代

测序技术检测，分析相关基因座的突变来源、突变步步数相同，则以结构相同的等位基因作为突变基因；

数等，探讨二代测序在亲权鉴定方面的优势与不足。若步数相同而结构不同则判为来源无法判定。

1 材料与方法

1.1 材料

2 600例肯定亲权关系的7 722份血斑样本来自

北京通达首城司法鉴定所日常受案工作。

样本提供者签署了知情同意书。本研究已经伦理

委员会论证，符合伦理要求。

1.2 方法

1.2.1 DA提取、PCR扩增和STR分型 

采用试剂盒（美国公司）提取7 722

IQPromega

份样本的，以21试剂盒（美国

DAPowerPlexPro-

megaPCR

公司）进行扩增，扩增体系和条件按试剂

盒说明书进行。

扩增产物以3130型基因分析仪（美国

xLTher-

moFisherGeneMarker

公司）电泳检测，采用软件进

行基因分析。

1.2.2 突变基因座的确认 

对于20个基因座（21系统）中

STRPowerPlex

检出1~2个不符合遗传规律基因座的亲缘样本，补

充检测 23 苏州阅微基

MicroreaderTMspIDSystem

（

因技术有限公司）和 人类身

SureIDPanGlobalDA

份鉴定试剂盒（宁波海尔施基因科技有限公司），共

检验43个常染体基因座。

按照/ 37223-2018亲子鉴定技术规范要

GBT

[2]

求计算亲权指数（ , 值），当值大

paternityindexPIPI

体的累积亲权指数大于104，符合亲子关系，因此作

者将上述亲子鉴定中不符合遗传关系的基因座确认

PI

[3]

1）确定突变等位基因的原则

[4]

2）确定突变来源的原则

对于三联体，由于同一基因座源自父母同时发生

突变的几率较低，故较易判断孩子中发生突变的等位

基因。

1.2.4 文库制备、高通量测序与数据分析 

将检出不符合遗传规律的基因座的62例三联体

鉴定、5例二联体鉴定，应用北京爱普益生物科技有

限公司

SeqTyper

®

24试剂盒（包含1、、

CSFPOvWA

DSDSDSDSDS

31358、5818、7820、81179、13317、

DSDSDSFGATHTPOX

16539、2111、1851、、01、、

DSDSDSPentaDDS

21338、19433、61043、 、12391、

PentaEDSDSDSDS

、6474、17974、11679、11656和

Amelbp

，片段长度在95~281 之间）进行文库构建，

采用 自动化测序模板制备系统和测序

IonChefPGM

系统（均为美国公司）进行测序，芯

ThermoFisher

片为3182（美国公司），操作参照

VBCThermoFisher

IonPGMHiQviewchefKitThermoFisher

- （美国公司）

试剂盒说明进行。

采用 1.5软件（北京爱普益生物科技

SeqVisionV

有限公司）与参考序列比对进行分析，流程包括长度

质控、归类、基因座归类、基因分型。

Barcode

等位基因序列命名主要以公布为准，

STRbase

并以、、编号作为后缀，、、是在

ABCABCSTR-

base

中公开的序列

[5]

，如2111 29。本研究中自

DSA

己新发现的序列用#1、#2表示，按发现时间的先后

2021年 第46卷 第3期

张庆霞, 等：毛细管电泳联合二代测序技术用于亲子鉴定突变分析

·249·

顺序，第一次发现的序列命名为#1，第二次命名为观察到3个基因座突变。

#2，依次类推。

本研究中，01、、31358、7820、

THTPOXDSDS

DSDSDSDS

16539、21338、19433、61043基因座未

发现突变。

2.2 突变步数

在67例亲子关系案件中共发生了71次突变（表

1），其中一步突变为60次 (84.50%)，增加和减少一

步各30次；两步突变为4次 (5.63%)，两步增加1次，

两步减少3次；三步突变为3次 (4.23%)，三步增加

1次，三步减少2次。

对比两个平台对突变步数判断的影响，经平

CE

台检测有2例不能确定突变步数是增加还是减少了一

步，而通过平台检测结果的序列推断，确定此

GS

2例（详见表3的案例1和案例2）均为增加一步的

突变；有4例两个平台均不能确定类型。

2 结果与分析

2.1 突变基因座及突变率

2 600例肯定亲权关系的案件，共7 722份样本，

双亲（三联体）鉴定2 522例，单亲（二联体）鉴定78例，

共观察到5 122次减数分裂。经检验共发现67

STR

例亲子关系（其中62例三联体，5例二联体）存在基

因座突变。对该67例亲子关系所涉及的196个样本

进行二代测序，平台得到的分型结果与

CESTRGS

平台得到的结果完全一致。经计算得到的突变率及突

变步数结果见表1，67例案件的突变方式见表2。

在64例亲子关系案件中观察到1个基因座突变，

2例亲子关系观察到2个基因座突变，1例亲子关系

表 12个STR基因座的突变率及突变步数（=5122)

1

Table 1 Mutation rate and steps from the involving 12 STR loci (=5122)

基因座突变例数突变率/‰

D12S391142.73671/1

FGA122.3444112/2

D8S1179122.34741/0

D21S11112.15461/0

vWA101.9546

Penta E30.06111

D18S5130.06111

Penta D20.0411/1

D13S31710.021

CSF1PO10.021

D5S81810.021

D17S129010.021

合计7128/303013126/4

一步突变两步突变三步突变

+1-1+2-2+3-3

CE/GS不确定

表 67例案件的突变方式

2

Table 2 Mutation patterns of the related 67 cases

基因座

D12S391950/0

FGA912/2

D8S11791020/0

D21S11461/0

vWA802/2

Penta E300/0

D18S51300/0

Penta D110/0

D13S317010/0

CSF1PO100/0

D5S818100/0

D17S1290100/0

突变来源

父源母源CE/GS不确定

·250·

刑事技术

Forensic Science and Technology

2021年 第46卷 第3期

表 部分案例中突变基因座的等位基因序列

3

Table 3 Allelic base sequence of mutationharboring STR loci from the related cases

-

序号基因座样本基因分型等位基因序列

M13

案例1D8S1179

C13

F12,14

M29B,31A

案例2D21S11

C28A,30A

F28A,32.2A

M31A,31#2

案例3D21S11

C30A,30B

F29A,30A

M14,19

案例4VWA

C19,20

F14,19

[TCTA]13

[TCTA]13

[TCTA]13

[TCTA]13

[TCTA]12

[TCTA][TCTG][TCTA]12

[TCTA]6[TCTG]5[TCTA]3TA[TCTA]3TCA[TCTA]2TCCATA[TCTA]10

[TCTA]5[TCTG]6[TCTA]3TA[TCTA]3TAC[TCTA]2TCCATA[TCTA]12

[TCTA]4[TCTG]6[TCTA]3TA[TCTA]3TCA[TCTA]2TCCATA[TCTA]10

[TCTA]6[TCTG]5[TCTA]3TA[TCTA]3TCA[TCTA]2TCCATA[TCTA]11

[TCTA]4[TCTG]6[TCTA]3TA[TCTA]3TCA[TCTA]2TCCATA[TCTA]10

[TCTA]5[TCTG]6[TCTA]3TA[TCTA]3TCA[TCTA]2TCCATA[TCTA]12TA[TCTA]

[TCTA]5[TCTG]6[TCTA]3TA[TCTA]3TCA[TCTA]2TCCATA[TCTA]12

[TCTA]8[TCTG]5[TCTA]3TA[TCTA]3TCA[TCTA]2TCCATA[TCTA]10

[TCTA]6[TCTG]5[TCTA]3TA[TCTA]3TCA[TCTA]2TCCATA[TCTA]11

[TCTA]5[TCTG]6[TCTA]3TA[TCTA]3TCA[TCTA]2TCCATA[TCTA]11

[TCTA]4[TCTG]6[TCTA]3TA[TCTA]3TCA[TCTA]2TCCATA[TCTA]11

[TCTA]6[TCTG]5[TCTA]3TA[TCTA]3TCA[TCTA]2TCCATA[TCTA]11

[TCTA][TCTG][TCTA][TCTG]4[TCTA]3[TCCA][TCTA]3

[TCTA][TCTG]4[TCTA]14

[TCTA][TCTG]4[TCTA]14

[TCTA][TCTG]4[TCTA]15

[TCTA][TCTG][TCTA][TCTG]4[TCTA]3[TCCA][TCTA]3

[TCTA][TCTG]4[TCTA]14

2.3 突变来源平台的测序可发现纯合子实为两个等位基因序

根据1.2.3中的原则确定突变的父源或母源，在列不同的亚型。有4例则经过二代测序也无法判断突

71次突变中观察到父源突变50例，母源突变16例，

两者比例为3.13‥1，不能确定为5例，经

CEGS

平台检测后仍有4例不能确定，详见表2。

本研究表3中的案例2，的结果在2111

CEDS

上，父亲的分型为28/32.2，孩子为28/30，母亲为

29/31，其突变来源于母亲，既可是29→30，也

可以是31→30，根据测序的结果母亲的29序列

B

与孩子的30序列差异仅表现在最后[]10与

ATCTA

[]11不同，其余序列均相同，而母亲的31与

TCTAA

孩子的30序列差异较大，因此判断来自母亲的突

A

变应为29→30。通过平台的测序结果还可以

GS

判断具体突变来源于亲代的哪个等位基因，本研究的

案例3，2111，平台得到的分型，父亲为

DSCESTR

29/30，孩子为30，母亲为31，测序结果表明孩子的

30由两个不同的亚型组成，即30和30，母亲的

AB

31也由两个不同的亚型组成，即31和31#2，孩子

A

的30来自父亲，孩子的30是由母亲的31突变

ABA

而来。亲代为长度相同的纯合子，平台检测的结

CE

果无法判断该亲代的哪个等位基因传递给子代，经

GS

变来源，例如表3的案例4。

3 讨论

3.1 突变率、突变步数与突变来源的分析

本研究在5 122次减数分裂中观察到12个

STR

基因座发生71个突变，突变率在0.02‰~2.73‰，

其中12391、、81179、2111四个基因

DSFGADSDS

座的突变率在2‰以上，的突变率接近2‰，因

vWA

此在亲权鉴定时应加以注意。

本研究观察到的高突变基因座与毕洁等对

[6]

20 723例亲子鉴定中19个基因座的突变分析中

STR

DSFGAPentaE

12391、为高突变基因座相一致，但

的突变率存在差异。突变率高的原因是基因座

STR

长度较长，根据测序结果可以看到重复单位数目较

多、序列相对复杂。一步突变中，出现重复单位增加

为30次，与出现重复单位减少了30次的数目相当，

两步与三步突变中，重复单位减少的数目多于增加的

数目。

父源突变与母源突变的比例为3.33‥1，与文献

2021年 第46卷 第3期

张庆霞, 等：毛细管电泳联合二代测序技术用于亲子鉴定突变分析

·251·

[7]报道的父系突变率是母系突变率3.5倍的结论相

一致，父系突变多见的原因是男性的精原细胞成为精本研究发现，对于核心序列复杂、含不完全重复

子所经历的复制和分裂比卵细胞多，因此产生滑动错单位的基因座，二代测序可以通过序列测定明确某些

配的概率相应增多。突变的来源，更直观地从微观碱基序列的角度观察等

3.2 存在多个基因座突变的案例分析

检验基因座数量越多，检测到的突变基因座就会段“亚型”的检测能力，提高基因座的等位

越多。针对一个案例中发现多个突变基因座，本文共基因检出数目和鉴别能力。

检验43个常染体基因座，选择三套试剂盒，一是

确证突变，印证基因型的准确性，二是增加新的基因

座来增加累积值，以更加科学地认定或排除亲权

PI

关系。

另外，在计算累积值时，不符合遗传规律的

PI

基因座必须参与计算，针对两个及以上突变基因座的

案例，本研究累积值均达到了107以上，同时增

PI

加检验了性染体，分型结果也符合遗传规律，

STR

因此支持认定亲权关系。

对多个基因座突变的案例，为防止出现鉴定结论

XSTRYSTRSTR

-、-、错误，通过增加检测常染体、

SP

等多种遗传标记以及采用序列测定方法补充

信息含量尤为必要，不能单纯依靠出现3个或以上

STR

基因座不符合遗传规律就做出排除的鉴定意见。

3.3 二代测序在亲权鉴定方面的优劣势

与基于毛细管电泳平台所得长度多态性结

STR

果相比，二代测序可以反映基因座序列内部结

STR

构的差异，增加了多态性信息。针对突变来源的分析，

主要分为以下三种类型。

第一种类型，得到的分型结果无法判断

CESTR

突变步数是增加还是减少了一步时，二代测序能明

晰，如表3中的案例1和案例2。

第二种类型，的结果为纯合型，经二代测序

CE

发现亚型不同，测序结果可以明确是由具体何种亚型

突变而来。等位基因亚型即序列多态性的发现更加细

分了基因座的分型，其等位基因亚型频率低于对应的

等位基因频率，提高了基因座的个体识别能力和非父

排除率，可提高个案的亲权指数，但目前由于缺乏等

位基因亚型的体遗传数据，因此本文计算时仍按照

该等位基因的频率进行计算。

第三种类型，如案例4，两种方法均无法判断突

变来源，对于父母序列均相同的等位基因，如

vWA

的19，父母核心序列均为[][]4[]14，

TCTATCTGTCTA

在侧翼区也未见不同，此时应用二代测序没有优势。

与毛细管电泳检测相比，二代测序具有直接检测

序列多态性、可组合的基因座不受荧光种类限制、每

个基因座的扩增片段长度不受荧光组合限制等优点，

[8]

但二代测序的检测时间相对较长、测序成本较高。

位基因的遗传，能充分发挥其对相同长度等位基因片

[9]

STR

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收稿日期：2020-02-18；修回日期：2020-12-04

引用本文格式：张庆霞，刘金杰，付丽红，等.毛细管电泳联合二代测序技术用于亲子鉴定突变分析[J]. 刑事技术，2021,46(3):247-251.