活细胞培养观测装置、制造方法和使用方法
1.本发明属于生物实验用品技术领域，更具体地涉及一种活细胞培养观测装置、其制造方法和使用方法。
背景技术：
2.如果能够在保持细胞活性的同时追踪细胞结构和生理状态的变化，将对于揭示生命活动规律、疾病发病机制、微生物进化发育、地壳元素分布、污染物毒理效应等许多细胞生物学问题有极大促进作用。现阶段对于细胞的显微观测主要是先在培养基中培养，然后在不同的阶段取样转移至显微镜的操作台上进行观测。这种操作首先导致一些细胞由于缺乏营养物质而失去生理活性，无法连续观测；其次，转移过程中会改变环境的氧化还原条件，影响对实验结果的判断。
3.活细胞成像技术要求在不破坏细胞整体结构的前提下，准确捕捉活细胞的真实生理状态。考虑到维持细胞正常生理状态需要营养物质、气体氛围、适宜的温度条件等，用于活细胞连续培养及观测的装置必须具有营养物质供给、良好的气密性和/或温控系统。目前，针对活细胞连续培养及观测的装置主要有两种设计思路，一是对显微镜进行改造，二是对培养皿进行功能化设计。为控制观测环境中的氧气浓度，一些显微镜制造商在显微镜上搭建了一个小型密封箱，可以根据不同细胞的生长需求调节箱内气体成分和含量。但是，这种设计为保持温度恒定需要消耗较多的能量，并且没有设置给细胞供给营养物质的功能部件。
4.为解决营养物质的供给，一些制造商改进了培养皿的结构，在培养皿侧壁上开设了液体流通管道，允许新鲜培养基的流入和废物的排出。然而，由于技术受限导致各组装部件的连接处容易漏气，影响了装置的整体气密性。此外，将多个部件组装在一起的操作也较为复杂。因此，亟需开发一种整体考虑且更加适用的活细胞培养观测装置及配套的使用方法。
技术实现要素：
5.有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种活细胞培养观测装置、其制造方法和使用方法，以期至少部分地解决上述技术问题。
6.为了实现上述目的，作为本发明的第一个方面，提出了一种活细胞培养观测装置，包括主体腔室、孵育底片和顶盖，其中：
7.所述主体腔室为内部中空的结构，上下表面贯通，分别与孵育底片和顶盖密封固定连接；所述主体腔室内部中空结构与所述孵育底片及顶盖围成一空间，其内放置培养观测的活细胞及其培养基质；所述主体腔室的侧壁上设置有液体出入口和气体出入口，用于给所述活细胞供给营养物质和提供适宜的气氛；
8.所述孵育底片需要满足显微镜成像要求，用于承载所述活细胞及其培养基质；
9.所述顶盖采用透明设计，用于提供观察窗口和显微镜成像的光路通道。
10.作为本发明的第二个方面，还提出了一种如上所述的活细胞培养观测装置的制造方法，包括如下步骤：
11.单独制造所述主体腔室，尤其优选采用3d打印方式制造所述主体腔室；
12.将预先制造和/或购买的孵育底片和顶盖装配到所述主体腔室上，密封固定，由此得到所述活细胞培养观测装置。
13.作为本发明的第三个方面，还提出了一种如上所述的活细胞培养观测装置的使用方法，包括以下步骤：
14.将所述活细胞培养观测装置转移到超净台或厌氧手套箱中；
15.将所述活细胞培养观测装置的液体入口和液体出口与对应连接管道连接，其中液体出口与废液收集装置固定连接；将活细胞和新鲜的培养基质从液体入口注入到孵育底片上；
16.将所述活细胞培养观测装置的气体入口和气体出口与对应连接管道连接，在外部调节好所需的气体氛围后通过气体入口将其导入所述主体腔室；
17.将所述活细胞培养观测装置从超净台或厌氧手套箱中取出，安装加热元件和测温元件；完成所述活细胞培养观测装置各部分的机械连接和电连接后，将所述活细胞培养观测装置转移到观测或成像装置的对应平台上，进行连续的培养及观测。
18.基于上述方案可知，本发明的活细胞培养观测装置、其制造方法和使用方法相对于现有技术至少具有如下有益效果之一：
19.(1)本发明的培养观测装置集成了多种功能，结构简单，组装方便，可根据不同实验需要调整气体出入口的位置、大小和数量；
20.(2)本发明的培养观测装置满足了各类细胞正常生长的营养物质需要，并可通过液体出口及时排出废物；
21.(3)本发明的培养观测装置气密性良好，至少可在48h内保持严格厌氧的气体氛围(例如，氧气浓度＜0.5％)，能够在至少24h内稳定厌氧微生物的生理状态；并且可根据不同种类细胞的需要，调整气体的成分和浓度；
22.(4)本发明的培养观测装置能够为细胞的生长提供适宜的温度(例如，30-40℃)，维持了细胞的生理活性；
23.(5)本发明的培养观测装置兼容性强，可适配于多种观测及成像装置，应用范围广；并且装置的成本较低，清洗消毒后可以重复使用。
附图说明
24.下面结合附图和实施例对本发明的装置作进一步说明：
25.图1是本发明实施例1的活细胞培养观测装置的结构示意图；
26.图2a为所述活细胞培养观测装置的主体腔室的正视图；
27.图2b为所述活细胞培养观测装置的主体腔室的侧视图；
28.图2c为所述活细胞培养观测装置的主体腔室的俯视图；
29.图3a是所述活细胞培养观测装置的主体腔室的侧剖面图；
30.图3b是所述活细胞培养观测装置的主体腔室的正剖面图；
31.图4是采用本发明实施例1的活细胞培养观测装置对大肠杆菌进行培养及观测的
结果的多张显微镜照片；
32.上述附图中，附图标记含义如下：
33.1、顶盖；
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2、主体腔室上凹槽；
34.3、气体出口；
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4、液体出口；
35.5、主体腔室；
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6、孵育底片；
36.7、温度传感器探头固定处；
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8、电加热带穿入起点；
37.9、液体入口；
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10、气体入口；
38.11、电加热带穿入终点；
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12、气体流通通道端口；
39.13、固定电加热带通道；
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14、液体流通通道；
40.15、主体腔室下凹槽；
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16、主体腔室侧壁内气体通道；
41.17、电加热带的半程穿入点；
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18、液体流通通道端口。
具体实施方式
42.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
43.为了在保持细胞活性的同时，还可以追踪细胞结构和生理状态的变化，本发明的发明人经过精心研究，在考虑到维持细胞正常生理状态需要营养物质、气体氛围、适宜的温度等条件时，开发出一种活细胞培养观测装置、其制造方法和使用方法，以用于活细胞的连续培养及观测，该培养观测装置根据任务的需要，具有营养物质供给、良好的气密性和/或温控系统。本发明的活细胞培养观测装置既可以临时作为培养装置，满足活细胞的培养条件，又可以作为观测装置，直接插接到体式显微镜、倒置显微镜、激光共聚焦显微镜或高清照相机等多种观测及成像装置上，进行活细胞的实时观测。
44.具体地，本发明的活细胞培养观测装置，包括主体腔室、孵育底片和顶盖，其中：
45.主体腔室为内部中空的结构，上下表面贯通，可以分别与孵育底片和顶盖密封连接。所述主体腔室内部中空结构与所述孵育底片及顶盖围成一空间，其内放置培养观测的活细胞及其培养基质。所述主体腔室材质例如包括透光性好的材料，如透明树脂(如亚克力)或玻璃，优选为树脂。在一个优选实施方式中，所述主体腔室顶部和底部均设有环状凹槽，分别用于固定顶盖和孵育底片。所述主体腔室的侧壁根据具体应用场景可能设置有液体入口/出口、气体入口/出口。在一个优选实施方式中，所述主体腔室侧壁可以同时开设有液体入口/液体出口、气体入口/气体出口，用于分别提供液体培养基、气体氛围的输入输出和废物的排出；所述液体入口、液体出口、气体入口、气体出口与所述主体腔室内部连通，例如主体腔室侧壁内设有内径6-10mm的贯穿管道，用于外界气体和液体通过气体出入口和液体出入口与腔室内部连通。液体入口、液体出口、气体入口、气体出口优选采用标准接口，便于与乳胶管等其它器件连接。液体流量通过微型蠕动泵控制，气体流量通过气体流量计控制。此外，所述主体腔室的侧壁上可以设置有若干温度检测装置和/或温度调节装置，例如，所述主体腔室侧壁内设有一圈长10-15mm，宽2-10mm的条形通道，用于固定微型电加热元件，如电加热片、电加热膜、电加热带和/或电加热棒等。此外，所述主体腔室的底部可以设置有测温元件，例如，所述主体腔室底部设有一内径4mm、长30mm的圆柱形通道，用于嵌入温度传感器探头、热敏电阻元件等。
46.孵育底片需要满足多种显微镜的物镜成像要求，可以选用现成的承载玻片，也可以采用透明材料制造，例如透明玻璃或光学树脂来制造；更优选地，可以采用表面经过亲水性处理的硼硅酸盐玻璃来制造。所述孵育底片的厚度范围例如在0.05-0.50mm，优选0.17mm。孵育底片与主体腔室密封连接后形成一个用于放置活细胞和液体培养基的容器，其中可以通过主体腔室侧壁的液体入口/出口、气体入口/出口给所述活细胞供给适合的营养物质和气氛。
47.所述顶盖也是透明设计，可以用于肉眼观察腔室内液体和显微镜的位置，并允许各类光源的透过。所述顶盖材质例如包括透光性好的材料，例如透明玻璃或树脂(如亚克力)，优选透明玻璃。
48.在一个优选实施方式中，所述顶盖和孵育底片通过粘结剂与主体腔室的上下凹槽分别固定连接；所述主体腔室的上下凹槽深度大于孵育底片和顶盖的厚度；所述主体腔室的上下凹槽面积大于孵育底片和顶盖的面积，所述主体腔室的上下凹槽内的上下圆孔的面积小于孵育底片和顶盖的面积，光线可以从上下圆孔穿透顶盖、主体腔室和孵育底片到达显微镜物镜处。
49.在一个优选实施方式中，所述主体腔室侧壁内用于安装加热元件的条形通道设置在气体出入口和液体出入口之间，宽度范围在2-10mm，优选4mm；所述主体腔室侧壁内的条形通道与主体腔室内壁的距离范围在0.2-1.0mm，优选0.5mm；所述主体腔室侧壁内的条形通道与主体腔室外壁的距离为5-10mm，优选6.5mm。
50.作为优选，所述主体腔室侧壁内的条形通道在垂直于气体出入口和液体出入口处例如可以相对设置长方形开口，以便于条形电加热带的嵌入。
51.所述主体腔室侧壁内的液体管道入口端位置高于出口端，高度差范围在2-5mm，防止主体腔室内部的液体倒吸；所述主体腔室侧壁内的液体管道入口端和出口端均为缝隙结构，例如圆弧形的缝隙结构，缝隙与腔室内径的长度比为1/2-2/3，宽度范围在1-3mm，便于液体快速均匀分布；所述主体腔室侧壁内的液体管道与出口端缝隙的连接处为渐变结构，渐变段长度范围在2-5mm，收缩角介于15-30
°
间，这样的设计进一步优化了液体流动平稳性，避免管道堵塞和积存基质残渣，也避免液体流动太剧烈导致观测活细胞时无法对焦某一具体活细胞。
52.所述活细胞培养观测装置外形轮廓和部件设置与各观测及成像装置相匹配，从而可兼容体式显微镜、倒置显微镜、激光共聚焦显微镜以及高清照相机等多种观测及成像装置。
53.此外，本发明还提出一种上述活细胞培养观测装置的制造方法，包括如下步骤：
54.单独制造所述主体腔室，例如可以采用增材制造，尤其例如是3d打印的方式来制造所述主体腔室；当然也可以采用先制造多个部件再拼装的方式，不过要处理好密封性和粘结强度的问题。
55.将预先制造和/或购买的孵育底片、顶盖装配到所述主体腔室上，密封固定，由此得到所述活细胞培养观测装置。
56.上述步骤中，密封固定方式例如可以为胶粘剂粘结，也可以是密封垫片等密封材料压紧封装。
57.此外，本发明还提出一种活细胞培养和/或观测的方法，其采用上述的活细胞培养
观测装置进行操作，其也是上述活细胞培养观测装置的使用方法，包括以下步骤：
58.将所述活细胞培养观测装置转移到超净台或厌氧手套箱中；
59.将所述活细胞培养观测装置的液体入口和液体出口与对应连接管道连接，其中液体出口与废液收集装置固定连接；将活细胞和新鲜的培养基质从液体入口注入到孵育底片上；
60.将所述活细胞培养观测装置的气体入口和气体出口与对应连接管道连接，在外部调节好所需的气体氛围后通过气体入口将其导入所述主体腔室；
61.将所述活细胞培养观测装置从超净台或厌氧手套箱中取出，安装加热元件和测温元件；完成所述活细胞培养观测装置各部分的机械连接和电连接后，将所述活细胞培养观测装置转移到观测或成像装置的对应平台上，进行连续的培养及观测。
62.在一个优选实施方式中，该使用方法包括如下步骤：
63.首先将孵育底片、主体腔室和顶盖组装完成后，转移到超净台或厌氧手套箱中；然后将活细胞从液体入口端注入到孵育底片上，再把新鲜培养基和废液收集瓶通过软管分别与液体入口端和出口端固定；然后再将细胞所需的气体氛围通过软管与气体的入口端和出口端固定；
64.将装置从超净台或厌氧手套箱中取出，安装电加热带和温度传感器探头；完成装置各部分的连接后，将装置转移到观测或成像装置的对应平台上进行连续的培养及观测。
65.其中，液体入口端例如通过接入带微型蠕动泵的输液管道来控制液体供给；而气体入口段例如通过控制气体流量计，以控制若干气体的气体流量，或者直接输送预先配制好对应浓度的气体来控制气体气氛。
66.下面结合实施例对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的范围不限于此。显然，下文中描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部实施例；基于本发明的下述实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有实施例，都属于本发明的保护范围。
67.实施例
68.本实施例的活细胞培养观测装置的结构如图1-图3b所示，主要包括顶盖1、主体腔室5和孵育底片6，其中：
69.顶盖1用于肉眼观察腔室内液体和显微镜的位置，并允许各类光源的透过；孵育底片6用于承载活细胞和液体培养基。
70.主体腔室5材质为透明的光敏树脂，其侧壁分别开设有液体入口9和液体出口4，液体入口9用于添加新鲜的培养基，液体出口4用于排出细胞培养过程中产生的废物；主体腔室5的侧壁开设有气体入口10和气体出口3，用于提供气体氛围。气体入口10、气体出口3、液体入口9、液体出口4均为变径结构，便于固定硅胶导管，提高装置的气密性。
71.主体腔室5侧壁内设有贯穿管道16，用于气体入口10和气体出口3与腔室内部联通；主体腔室5侧壁内设有贯穿管道14，用于液体入口9和液体出口4与腔室内部联通。主体腔室5侧壁内的气体管道16的进口端和出口端设置在同一水平线上，主体腔室5侧壁内的液体管道14进口端位置高于出口端，防止主体腔室5内部的液体倒吸。液体管道14的出口端18为一段圆弧型的缝隙结构，缝隙与腔室内径的长度比为1/2，宽度为1mm，便于液体快速均匀分布；液体管道14与出口端18的连接处为渐变结构，渐变段长度为5mm，收缩角为15
°
。
72.主体腔室5的侧壁内设有一圈条形通道13，用于固定电加热带；条形通道13开设有两个长方形开口，方便电加热带的穿入，长方形开口8作为电加热带的穿入起点，长方形开口17作为电加热带的半程穿入点，条形通道13的开口11作为电加热带的终点。主体腔室5底部设有一顶端封闭的圆柱形通道7，用于嵌入温度传感器探头。
73.主体腔室5的顶部和底部分别开设了上凹槽2和下凹槽15，上凹槽2用于固定连接顶盖1，下凹槽15用于固定连接孵育底片6。上凹槽2的深度大于顶盖1的厚度，下凹槽15的深度大于孵育底片6的厚度。上下凹槽2和15与顶盖1和孵育底片6的连接处涂有粘结剂，可将顶盖1和孵育底片6与主体腔室5稳定连接，气密性良好。
74.本实施例使用所述活细胞连续培养及观测的装置和使用方法对大肠杆菌进行了连续培养和观测。首先将主体腔室5、孵育底片6和顶盖1组装到一起放进超净台中，将预先培养的大肠杆菌从液体入口9处注射进主体腔室5内，然后将充满洁净空气的集气袋通过硅橡胶管分别连接在气体入口10和气体出口3处，然后再将液体培养基通过硅橡胶管连接在液体入口9处，将废物收集瓶连接在液体出口4处。
75.然后将装置整体移出超净台，并组装温控系统。首先将电加热带从主体腔室5侧壁的长方形开口8处穿入，一直延伸至半程穿入点长方形开口17，然后在条形通道13的开口11处穿出，完成电加热带的组装。再将温度传感器探头嵌入到主体腔室5底部的圆柱形通道7，温度传感器探头的顶部要顶到圆柱形通道7的尽头，完成整套温控系统的组装。
76.将装置转移至激光扫描共聚焦显微镜的载物台上，更换物镜至100倍油镜后，在油镜的镜头上均匀地涂抹香柏油，调整载物台将主体腔室5的圆孔对准显微镜的物镜，移动粗准焦螺旋抬升物镜至刚好接触孵育底片6，再微调细准焦螺旋和光源，进行显微观测。实验结果如图4所示，大肠杆菌清晰可见，观测效果与商用的共聚焦培养皿效果一致。
77.本实施例的装置和方法操作简便，能根据实际需求对不同种类的细胞进行连续培养、观测和暴露实验，可适配于多种观测及成像装置，兼容性强。
78.以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
