牡丹皮提取物在制备抗海洋弧菌药物中的用途
1.本发明涉及中草药用途领域，特别涉及一种牡丹皮提取物在制备抗海洋弧菌药物中的用途。
背景技术：
2.近年来，我国水产养殖业迅速发展，渔业产量大幅增长，稳居世界前列。但随着养殖规模与集约化程度的不断提高，养殖水域污染逐渐加重，水产致病菌引起的病害频发，严重阻碍了海水鱼类的养殖和发展。海洋致病菌主要包括副溶血弧菌、鳗弧菌、创伤弧菌、弧菌等。这些致病菌不仅给海水养殖业造成巨大经济损失，而且威胁海洋自然生物资源。
3.目前，对于海洋致病菌多采用化学药物防治的方法，主要包括青霉素，诺氟沙星，新诺明等，但长期单一使用一种药物会产生抗性，出现耐药性菌株。中草药具有成分丰富、不易产生耐药性、绿环保及功效多样等优点，在病毒性、细菌性等各类鱼病防治中均拥有独到的作用及良好的效果。
4.现有对中草药进行筛选来抑制海洋致病菌的研究，但是关于本发明的中草药在抑制海洋致病菌中的应用目前尚缺乏报道。因此，筛选中草药，寻具有较好抑制海洋致病菌有效的中草药具有重要的意义。
技术实现要素：
5.本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种牡丹皮提取物在制备抑制海洋致病菌药物中的新用途。
6.本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是牡丹皮提取物的用途，所述的用途为牡丹皮提取物在制备抑制海洋致病菌的药物中的用途；所述的海洋致病菌为创伤弧菌、弧菌。所述的牡丹皮提取物是以牡丹皮为原料，采用水提取或无水乙醇提取所得到的牡丹皮提取物。
7.本发明优选的技术方案是：所述的牡丹皮提取物的制备方法为：称取牡丹皮中药制成的粉末，加入溶剂水或无水乙醇，在室温下超声提取30～90min，再在30℃～80℃下回流提取30～120min，抽滤，同法提取2～4次，收集滤液，浓缩即得。
8.本发明优选的技术方案是：所述的牡丹皮提取物的提取方法如下：
9.(1)提取：称取牡丹皮粉末，加入无水乙醇，在一定温度下超声提取30min，再在50℃下回流提取60min，抽滤，同法提取2次，收集滤液，浓缩使生药的最终浓度为1g/ml；
10.(2)抑菌活性成分分离：对牡丹皮醇提物进行分离，牡丹皮醇提物旋蒸成浸膏后加入蒸馏水配成混浊液，分别用等体积石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，萃取至溶液澄清无，每次萃取时间30min。萃取完毕后，将溶剂旋干得到干燥粉末，将不同萃取物干燥粉末，配置成10mg/ml的样品溶液，用牛津杯法测定样品溶液的抑菌活性；
11.(3)抑菌活性成分化学定性检测：使用化学定性的方法对4个组分进行检测，用盐酸+镁粉、溴甲酚绿溶液及三氯化铁铁溶液进行化学定性检测；确定乙酸乙酯组为酚
酸类化合物；确定酚酸类化合物为抑制海洋致病菌。
12.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
13.本发明将牡丹皮提取物用于制备抑制海洋致病菌的药物，牡丹皮醇提物对创伤弧菌和弧菌均有较好的抑制作用，mic值分别为15.63mg/ml和31.25mg/ml。
具体实施方式
14.下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
15.实施例1，筛选具有抑制海洋致病菌作用的中草药，确定牡丹皮为抑制海洋致病菌活性最好的中草药。
16.1、抑制海洋致病菌中草药的筛选
17.初步选出沙棘、小蓟、大叶桉叶、南酸枣、桂枝、制何首乌、茯苓、藿香、佩兰、白蔹、老鹳草、牡丹皮、三白草、夜交藤、车前草、紫苏水提物或醇提取物中的一种16种中草药。称取中药粉末，加入溶剂(水、无水乙醇)，在室温下超声提取30min，再在50℃下回流提取60min，抽滤，同法提取2次，收集滤液，浓缩使生药的最终浓度为1g/ml。
18.选取创伤弧菌(vibrio vulnificus)弧菌(vibrio cholerae)为目标菌株，采用牛津杯法，在无菌环境下，向平板中倒入约20ml已灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，凝固后，加入200μl的菌悬液，涂布棒涂布均匀，静置10min。将牛津杯垂直均匀放置于培养基上，在杯中加入200μl的提取物样品，每个样品进行3次平行实验，移至37℃恒温培养箱培养18h后，用电子数显卡尺测定抑菌圈直径，结果取3次测量结果的平均值。抑菌圈直径大于20mm为极敏，15～19mm为高敏，10～15mm为中敏，小于10mm为低敏(无活性)。
19.通过上述体外抑菌实验筛选出对创伤弧菌、弧菌抑制作用较强的中草药作为进一步实验对象。16种中草药提取物对两种弧菌的抑菌效果见表1：
20.表1 16种中草药提取物对两种弧菌的抑菌效果
[0021][0022][0023]
注：“+++”表示极敏、“++”表示高敏、“+”表示中敏、
“‑”
表示低敏(无活性)。
[0024]
实验结果如表1所示，沙棘水提物及醇提物、大叶桉叶醇提物、南酸枣水提物、桂枝醇提物、藿香醇提物、佩兰醇提物、老鹳草水提物及醇提物、牡丹皮水提物及醇提物、三白草醇提物、车前草水提物及醇提物对弧菌有抑制作用；沙棘水提物及醇提物、大叶桉叶水提物及醇提物、南酸枣醇提物、桂枝水提物及醇提物、藿香水提物及醇提物、佩兰水提物醇提物、老鹳草水提物及醇提物、牡丹皮水提物及醇提物、三白草醇提物、夜交藤水提物及醇提物，车前草醇提物，紫苏醇提物对创伤弧菌有抑制作用。其中，牡丹皮水提物及醇提物对弧菌的抑菌圈直径均达到15mm以上，对创伤弧菌的抑菌圈直径达到20mm以上；沙棘水提物及醇提物、大叶桉叶水提物及醇提物、藿香水提物及醇提物对创伤弧菌的抑菌圈也达到15mm以上。牡丹皮醇提物抑制两种弧菌活性最强，抑菌圈直径最大，分别为(18.08
±
0.20)mm、(21.69
±
0.30)mm。
[0025]
根据上述实验结果，选择抑制创伤弧菌、弧菌活性最好的牡丹皮醇提物作为
进一步实验对象，测定其最小抑菌浓度(mic)。
[0026]
2、牡丹皮醇提物对两种弧菌的mic测定
[0027]
采用二倍稀释法测定牡丹皮醇提物对两种弧菌的mic，即将1g/ml的牡丹皮醇提液分别稀释至生药浓度为500mg/ml、250mg/ml、125mg/ml、62.5mg/ml、31.25mg/ml、15.63mg/ml、7.82mg/ml。于30℃，200r/min摇床振荡恒温培养24h后观察结果，把无菌生长稀释度最大的药液浓度作为mic值。
[0028]
表2牡丹皮醇提物对两种弧菌的最低抑菌浓度实验结果
[0029][0030]
注：
“‑”
表示无活性。
[0031]
实验结果如表2所示，牡丹皮醇提物对创伤弧菌和弧菌均有较好的抑制作用，mic值分别为15.63mg/ml和31.25mg/ml。
[0032]
实施例2，牡丹皮抑制海洋致病菌有效成分的提取分离、检测分析。
[0033]
1、抑菌活性成分提取
[0034]
称取牡丹皮粉末，加入无水乙醇，在室温下超声提取30min，再在50℃下回流提取60min，抽滤，同法提取2次，收集滤液，浓缩使生药的最终浓度为1g/ml。
[0035]
2、抑菌活性成分分离
[0036]
对牡丹皮醇提物进行分离，牡丹皮醇提物旋蒸成浸膏后加入蒸馏水配成混浊液，分别用等体积石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，萃取至溶液澄清无，每次萃取时间30min。萃取完毕后，将溶剂旋干后得到干燥粉末，将不同萃取物干燥粉末，配置成10mg/ml的样品溶液。选取创伤弧菌为目标菌株，采用牛津杯法，在无菌环境下，向平板中倒入约20ml已灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，凝固后，加入200μl的菌悬液，涂布棒涂布均匀，静置10min。将牛津杯垂直均匀放置于培养基上，分别在杯中加入200μl样品溶液溶液，每个样品进行3次平行实验，移至37℃恒温培养箱培养18h后，用电子数显卡尺测定抑菌圈直径，结果取三次测量结果的平均值。抑菌圈直径大于20mm为极敏，15～19mm为高敏，10～15mm为中敏，小于10mm为低敏(无活性)。
[0037]
表3牡丹皮各组分抑制创伤弧菌结果
[0038]
[0039]
注：“+++”表示极敏、“++”表示高敏、“+”表示中敏、
“‑”
表示低敏(无活性)。
[0040]
通过对不同极性段的分离，得到四个组分。将四个组分进行抑菌实验，实验结果如表3所示，石油醚组对创伤弧菌没有抑制活性，正丁醇组与蒸馏水组对创伤弧菌均有抑制作用。乙酸乙酯组对创伤弧菌有较好的抑制作用。
[0041]
3抑菌活性成分化学定性检测
[0042]
使用化学定性的方法对乙酸乙酯组进行检测，用盐酸+镁粉、溴甲酚绿溶液及三氯化铁-铁溶液进行化学定性检测。
[0043]
表4牡丹皮抑制创伤弧菌活性成分的检测
[0044][0045]
实验结果如表4所示，乙酸乙酯组与溴甲酚绿溶液呈现阳性反应，说明其主要成分为羧酸类化合物；乙酸乙酯组又与三氯化铁-铁溶液呈现阳性反应，说明其主要成分为酚酸类化合物。
[0046]
通过上述分离、化学定性检测，初步确定牡丹皮抑制海洋致病菌的有效成分为酚酸类化合物。
[0047]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
