一种单细胞全序列标记的方法及其应用与流程
1.本发明属于基因测序领域，具体涉及一种单细胞全序列标记的方法及其应用。
背景技术：
2.众所周知复杂的生命机体由许多性质特异的细胞组成，在特定的状态下每个细胞表达的核酸和蛋白的种类与数量都有所不同，所以在单细胞水平上检测核酸和蛋白指标对生物医学研究有重要意义。单细胞测序从检测指标来看主要有单细胞基因组测序、单细胞rna测序、单细胞表观基因组测序及空间单细胞测序；从检测通量来看主要分为低通量单细胞测序（一次检测1-500细胞）和高通量单细胞测序（一次检测1000-10000细胞）。
3.目前商业化的高通量单细胞rna测序以分析单细胞中rna的表达量为主，并没有实现对rna全长序列的检测，而且，相对于低通量单细胞rna测序技术smart-seq或quartz-seq，目前商业化高通量的单细胞rna测序单个细胞检出的基因数偏低，存在低表达rna漏检问题。
技术实现要素：
4.本发明的目的在于提供一种单细胞全序列标记的方法及其应用，旨在后续的检测步骤中，能够获取高通量单细胞的全序列信息以及提高基因检测数。
5.为达到上述目的，本发明提供一种单细胞全序列标记的方法，包括以下步骤：步骤s1:提供待检测rna，所述待检测rna来自多个细胞；步骤s2:采用步骤（a）或步骤（b）中的任一方式获取双链产物：步骤（a）:将逆转录反应体系加入所述待检测rna中，进行逆转录反应后，得到的mrna/cdna杂合链即为所述双链产物；步骤（b）:将逆转录反应体系加入所述待检测rna中，进行逆转录反应后，得到cdna第一链，以所述cdna第一链为模板进行二链合成，得到所述双链产物；步骤s3:将所述双链产物用转座酶进行转座反应，得到多个细胞的多个片段化产物；步骤s4:将多个所述片段化产物与多个细胞标签一一对应连接，其中，同一细胞的多个片段化产物与相同的所述细胞标签连接，不同细胞的多个片段化产物与不同的所述细胞标签连接，得到标记的单细胞全序列。
6.可选地，所述步骤（b）包括以下步骤：步骤s201:将逆转录反应体系加入所述待检测rna中，进行逆转录反应后，得到cdna第一链；步骤s202:以所述cdna第一链为模板，采用含有随机序列的引物或经过消化后的rna链起始二链合成，得到所述双链产物。
7.可选地，所述步骤s1包括以下步骤：步骤s101:提供富集体；
步骤s102:提供含目的rna的细胞rna，将所述细胞rna中的目的rna富集于所述富集体上，得到所述待检测rna。
8.可选地，所述富集体偶联有逆转录引物和模板转换序列同源序列，且所述步骤（b）包括以下步骤：步骤s201:将逆转录反应体系加入所述待检测rna中，进行逆转录反应后，得到cdna第一链，所述逆转录反应体系含有模板转换序列和逆转录酶，所述模板转换序列含有与所述模板转换序列同源序列相同的序列；步骤s202:以所述cdna第一链为模板，以所述模板转换序列同源序列为引物进行原位扩增，得到所述双链产物。
9.可选地，所述步骤s1包括：步骤s101:提供多个待检测细胞以及多个检测区域，将多个所述待检测细胞一一对应地沉积在多个所述检测区域；步骤s102:将各所述检测区域中，将各待检测细胞进行裂解后富集目的rna，得到所述待检测rna。
10.可选地，所述步骤s3中，所述转座酶含有转座子序列；所述步骤s4包括：步骤s401:提供多个标记微珠，各所述标记微珠包括一个微珠本体和多条含有相同所述细胞标签的功能序列，且不同所述标记微珠的所述功能序列的所述细胞标签不同，各所述功能序列还包括与所述转座子序列连接的接头1’，所述接头1’连接在所述细胞标签的一端，所述微珠本体连接在所述细胞标签的另一端，且与所述细胞标签可条件性断裂；步骤s402:将多个细胞的多个所述片段化产物与多个所述标记微珠混合，使所述接头1’与所述转座子序列连接，并施加条件，使所述微珠本体与所述细胞标签断裂，得到标记的单细胞全序列，其中，同一细胞的多个所述片段化产物对应地与同一所述标记微珠混合，不同细胞的多个所述片段化产物与不同的所述标记微珠混合。
11.此外，本发明还提供一种高通量单细胞全序列转录组文库构建的方法，包括以下步骤：采用上述方法获取标记的单细胞全序列；将所述标记的单细胞全序列进行index pcr，对所述标记的单细胞全序列进行富集并引入测序接头序列及文库标签，得到所述高通量单细胞全序列转录组文库。
12.此外，本发明还提供一种高通量单细胞全序列的测序方法，包括以下步骤：采用上述方法构建高通量单细胞全序列转录组文库；采用测序平台对所述高通量单细胞全序列转录组文库进行测序。
13.此外，本发明还提供一种实现上述高通量单细胞全序列转录组文库构建的方法的试剂盒，包括：逆转录体系，所述逆转录体系用于对rna进行逆转录，得到dna双链或mrna/cdna杂合链；转座酶体系，所述转座酶体系用于对所述dna双链或所述mrna/cdna杂合链进行切割，获得片段化产物；标记体系，所述标记体系可使同一细胞的多个所述片段化产物与相同的细胞标签连接，不同细胞的多个所述片段化产物与不同的细胞标签连接，得到标记产物；
index pcr体系，所述index pcr体系用于对所述标记产物进行富集并引入测序接头序列及文库标签，形成所述高通量单细胞全序列转录组文库。
14.本发明中，通过转座酶将双链产物片段化并引入转座子序列，片段化产物连接特异性的细胞标签，以此实现单个细胞基因序列的细胞标签标记，便于后续实现单细胞全序列的检测，也提高了单细胞基因获取总量。
附图说明
15.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
16.图1为本发明一实施例单细胞全序列标记的方法流程图；图2为本发明反应原理图；图3为标记微珠图；图4为建库产物示意图；图5为实施例1和对比例1的获取的核酸分布；图6为实施例2获取的核酸分布；图7为实施例1~2以及对比例1测得的基因数目。
17.本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
18.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
19.需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“a和/或b”为例，包括a方案、或b方案、或a和b同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
20.鉴于现有的高通量单细胞测序，无法获取全序列信息，且获取单细胞基因数总量低的技术缺陷，参见图1和图2，本发明提供一种单细胞全序列标记的方法，包括以下步骤：步骤s1:提供待检测rna，所述待检测rna来自多个细胞；步骤s2:采用步骤（a）或步骤（b）中的任一方式获取双链产物：步骤（a）:将逆转录反应体系加入所述待检测rna中，进行逆转录反应后，得到的mrna/cdna杂合链即为所述双链产物；步骤（b）:将逆转录反应体系加入所述待检测rna中，进行逆转录反应后，得到cdna
第一链，以所述cdna第一链为模板进行二链合成，得到所述双链产物；步骤s3:将所述双链产物用转座酶进行转座反应，得到多个细胞的多个片段化产物；步骤s4:将多个所述片段化产物与多个细胞标签一一对应连接，其中，同一细胞的多个片段化产物与相同的所述细胞标签连接，不同细胞的多个片段化产物与不同的所述细胞标签连接，得到标记的单细胞全序列。
21.本发明中，在转座酶的作用下，将双链产物进行片段化并引入转座子序列，片段化的双链产物连接上特异性的细胞标签，以此实现单个细胞基因序列的细胞标签标记，便于后续实现单细胞全序列的检测，同时也提高了单细胞基因获取总量。
22.在一些实施例中，所述步骤s1包括：步骤s101:提供富集体；步骤s102:提供含目的rna的细胞rna，将所述细胞rna中的目的rna富集于所述富集体上，得到所述待检测rna。通过富集，可以对样品中的rna进行提取，去除非目的基因。
23.在一些实施例中，所述富集体含有富集本体以及连接于所述富集本体上的捕获探针，所述捕获探针可特异性结合rna，以此捕获待检测rna。具体地，所述捕获探针为oligo-(dt)n，n的数量在10~100之间，该序列对应的真核细胞中的poly a结构。
24.在一些实施例中，所述捕获探针末端有封闭基团修饰，使其仅为富集作用，不进行逆转录反应，在逆转录反应体系中加入感兴趣基因的特异性引物进行延伸。以此可选择性地获取感兴趣基因的全序列文库，而不再需要通过捕获方法得到。
25.需要说明的是，所述富集本体的材质可以为柔性材质也可以为硬性材质。
26.在一些实施例中，所述步骤s102包括：步骤s1021:提供多个待检测细胞；步骤s1022:将多个待检测细胞进行裂解，释放出rna，然后采用所述富集体富集目的rna，得到所述待检测rna。通过上述步骤可以使待检测细胞中rna进行充分释放。
27.在一些实施例中，所述步骤s1包括：步骤s101:提供多个待检测细胞以及多个检测区域，将多个所述待检测细胞一一对应地沉积在多个所述检测区域；步骤s102:将各所述检测区域中，将各待检测细胞进行裂解后富集目的rna，得到所述待检测rna。
28.具体地，通过提供一个微流控芯片，所述微流控芯片设有多个沉积孔，每个沉积孔为一个沉积区域。该微孔芯片可以含有100个到10000000个沉积区域，同一张芯片的每个微孔的直径是相同的，其直径可以在10-200um之间。投入微孔芯片的细胞数不应超过沉积区域数的1/5，可以通过重力使细胞自然沉降到沉积区域。
29.步骤s20中，采用步骤（a）得到所述双链产物时，可在不降低基因数的情况下，还进一步的缩短建库流程；需要说明的是，由于rna易降解，逆转录后需立即进行转座酶处理；采用步骤（b）得到的所述双链产物时，采用该方得到双链产物为dna，相较rna更稳定，易于保存，实验灵活度更高。
30.在一些实施例中，所述富集体偶联有逆转录引物和模板转换序列同源序列；参见图2，所述步骤s2包括以下步骤：
步骤s201:将逆转录反应体系加入所述待检测rna中，进行逆转录反应后，得到cdna第一链，所述逆转录体系含有模板转换序列和逆转录酶，所述模板转换序列包含与所述模板转换序列同源序列相同的序列；所述逆转录酶具有模板转换功能；步骤s202:以所述cdna第一链为模板，所述模板转换同源序列为引物进行原位扩增，得到双链产物。
31.本发明术语所述的“模板转换功能”是指逆转录酶的末端转移酶活性会在新合成的cdna的3’末端添加一些额外的碱基。
32.本发明术语所述的“模板转换序列”是指与cdna的3’末端添加的额外的碱基部分互补配对，并作为模板进行延伸的序列，以此实现另一端通用引物的添加，便于后续进行pcr反应。
33.参见图2，采用该方法形成的双链dna，其两端均与富集体连接，相较于传统的双链dna，省略了转座反应后的纯化步骤，简化实验流程。采用该方法得到的双链dna，由于进行扩增反应，基因拷贝数增加，避免在index pcr后的纯化过程中基因的丢失，可提高检测基因数和检测灵敏度。
34.参见图2，在一些实施例中，所述步骤s2包括：步骤s201:将逆转录反应体系加入所述待检测rna中，进行逆转录反应后，得到cdna第一链；步骤s202:以cdna为模板，采用含有随机序列的引物或经rnaseh消化后的rna链起始cdna二链合成。
35.需要说明的是，采用含有随机序列的引物，其生成的产物为多个cdna片段，多个cdna片段共同构成cdna，且多个cdna片段覆盖多条cdna第一链的序列信息。其具体覆盖方式可包括：多个cdna片段中的部分可分为若干个集合，每个集合中多个cdna片段经过拼接后，其形成的单链信息与其中一条cdna第一链一致，多个集合拼接后形成的所有单链，其序列信息，包含了所有的cdna第一链信息；当然，多个cdna片段中的部分片段也可各自具有完整cdna第一链序列信息。具体地，不再一一阐述。
36.在一些实施例中，所述步骤s3中，所述转座酶含有转座子序列。转座子序列可作为接头，用于后续细胞标签的连接。
37.具体地，在一些实施例中，所述转座酶还含有转座酶体，所述转座酶含有两个转座子序列，其中一个转座子序列为第一转座子序列，含有read1 sequence primer的全部或部分序列和第一转座酶识别序列，所述read1 sequence primer包含与细胞标签连接的接头1，所述转座酶体与所述第一转座酶识别序列的一端连接，所述read1 sequence primer与所述第一转座酶识别序列的另一端连接。
38.当然，可以理解的是，另一个转座子序列为第二转座子序列，包含第二转座酶识别序列和read2 sequence primer的全部或部分序列，所述第二转座酶识别序列与第一转座酶识别序列相同。
39.在一些实施例中，所述步骤s4包括以下步骤：步骤s401:提供多个标记微珠，参见图3，各所述标记微珠包括一个微珠本体1和多
条含有相同所述细胞标签201的功能序列2，且不同所述标记微珠的所述功能序列的所述细胞标签201不同，各所述功能序列还包括与所述转座子序列连接的接头1’，所述接头1’202连接在所述细胞标签201的一端，所述微珠本体1与连接在所述细胞标签201的另一端，且与所述细胞标签可条件性断裂；步骤s402:将多个细胞的多个所述片段化产物与多个标记微珠混合，使接头1’与所述转座子序列连接，并施加条件，使所述微珠本体与所述细胞标签断裂，得到标记的单细胞全序列，其中，同一细胞的多个所述片段化产物对应地与同一个所述标记微珠混合。
40.连接接头1’与所述转座子序列，具体地，接头1与接头1’连接，使其借助标记微珠引入细胞标签，可以一次性连接多个细胞标签，以此提高细胞标签的连接效率，例如，每个微珠本体上连接10^
5-10^
10
个功能序列，就能实现10^
5-10^
10
个序列的标记。需要说明的是，所述微珠本体的材质可以为柔性材质也可以为硬性材质。
41.在一些实施例中，所述微珠本体与所述细胞标签之间设有可裂解基团x 203，x可以在特定刺激条件下从微珠上脱落下来，比如光照刺激或者化学刺激。在上述过程中具有微珠本体在微孔中可以溶解消失也可以不溶解。
42.在一些实施例中，参见图3，所述细胞标签和所述微珠本体之间还设有引物结合序列204。通过设置引物结合序列，以此完成后续的文库富集及测序接头序列和文库标签的引入。
43.在一些实施例中，所述步骤s402中，接头1与接头1’进行在reverse primer介导下连接，所述reverse primer包括与接头1互补的第一区域和与接头1’互补的第二区域。
44.此外，本发明提供一种高通量单细胞全序列转录组文库构建的方法，包括以下步骤：步骤a10:采用上述单细胞全序列标记的方法获取标记的单细胞全序列；步骤a20:将所述标记的单细胞全序列进行index pcr，在所述index pcr的过程引入测序接头序列及文库标签，得到所述高通量单细胞全序列转录组文库。
45.在一些实施例中，采用扩增引物进行index pcr，所述扩增引物包括第一引物和第二引物，其中，所述第一引物包含与所述引物结合序列（204）相同的序列，进一步地，所述引物结合序列为illumina测序平台可识别的p5序列；所述第二引物包含转座子结合序列、文库标签及第二测序接头序列，所述转座子结合序列与所述第二转座子序列相同，所述文库标签设于所述第二测序接头序列与所述转座子结合序列之间，且所述第二测序接头序列为illumina测序平台可识别的p7序列。
46.通过上述步骤，在单细胞全序列引入文库标签，用于分辨样品。需要说明的是，测序标签可以根据需要进行添加，具体不做一一限制。具体地，在一些实施例中，通过index pcr引入测序接头序列及文库标签。因此构建的文库产物如图4所示。
47.此外，本发明还提供一种高通量单细胞全序列的测序方法，包括以下步骤：步骤b10:采用上述方法构建高通量单细胞全序列转录组文库；步骤b20:采用测序平台对所述高通量单细胞全序列转录组文库进行测序。通过上述方法，完成对文库的测序后，确定相应的序列信息，完成测序。
48.在一些实施例中，所述步骤b20中，所述测序平台包括 illumina novaseq 6000。
49.此外，本发明还提供一种实现上述高通量单细胞全序列转录组文库构建的方法的
试剂盒，包括：逆转录体系，所述逆转录体系用于对rna进行逆转录，得到dna双链或mrna/cdna杂合链；转座酶体系，所述转座酶体系用于对所述dna双链或所述mrna/cdna杂合链进行切割，获得片段化产物；标记体系，所述标记体系可使同一细胞的多个所述片段化产物与相同的细胞标签连接，不同细胞的多个所述片段化产物与不同的细胞标签连接，得到标记产物；index pcr体系，所述index pcr体系用于对所述标记产物进行富集并引入测序接头序列及文库标签，形成所述高通量单细胞全序列转录组文库。
50.可以理解的是，所述逆转录体系包括逆转录酶、逆转录引物和逆转录反应液，以此实现逆转录反应。
51.在一些实施例，所述逆转录引物也可以用于捕获待检测rna；例如oligo-（dt）n，n的数量在10~100之间因此，所述逆转录引物也可附于捕获本体上，制备成捕获体。
52.当然，所述逆转录引物不具备捕获rna的功能时，所述逆转录引物也可以接枝于所述捕获本体，而对应的在所述捕获本体上另外接枝捕获序列。
53.在一些实施例中，所述捕获体还包括模板转换序列同源序列；对应的，所述逆转录酶具有模板转换活性的逆转录酶，例如superscript ii逆转录酶，用于在逆转录反应中进行模板转换。可以理解的是，在进行模板转换的过程中，需要在所述逆转录体系中加入模板转换序列，所述模板转换序列包含与所述模板转换序列同源相同的序列。以此，便于后续进行原位扩增，形成双链dna产物。
54.在一些实施例中，所述转座酶体系包括转座酶，所述转座酶含有第一转座子序列和第二转座子序列。
55.转座子序列可作为接头，用于后续通过细胞标签的连接。
56.具体地，所述转座酶还含有转座酶体，所述转座酶含有两个转座子序列，其中一个转座子序列为第一转座子序列，含有read1 sequence primer的全部或部分序列和第一转座酶识别序列，所述read1 sequence primer包含与细胞标签连接的接头1，所述转座酶体与所述第一转座酶识别序列的一端连接，所述read1 sequence primer与所述第一转座酶识别序列的另一端连接。
57.当然，可以理解的是，另一个转座子序列为第二转座子序列，包含第二转座酶识别序列和read2 sequence primer的全部或部分序列，所述第二转座酶识别序列与第一转座酶识别序列相同。
58.在一些实施例中，所述标记体系包括多个标记微珠和连接反应液，各所述标记微珠包括一个微珠本体和多条含有相同所述细胞标签的功能序列，且不同所述标记微珠的所述功能序列的所述细胞标签不同，各所述功能序列还包括与所述第一转座子序列连接的接头1’，所述接头1’连接在所述细胞标签的一端，所述微珠本体与连接在所述细胞标签的另一端，且与所述细胞标签可条件性断裂，所述连接反应液使所述接头1’与所述转座子序列连接。
59.在一些实施例中，所述index pcr系包括扩增引物和pcr反应液。
60.在一些实施例中，所述扩增引物包括第一引物和第二引物，其中，所述第一引物包
含所述引物结合序列（204）相同的序列，进一步地，所述引物结合序列为illumina测序平台可识别的p5序列；所述第二引物包含转座子结合序列、文库标签及第二测序接头序列，所述转座子结合序列与所述第二转座子序列相同，所述文库标签设于所述第二测序接头序列与所述转座子结合序列之间，且所述第二测序接头序列为illumina测序平台可识别的p7序列。
61.所述扩增引物序列如下：第一引物n5：aatgatacggcgaccaccga第二引物n7：caagcagaagacggcatacgagatxxxxxxxxgtctcgtgggctcgg，其中caagcagaagacggcatacgagat为p7序列，xxxxxxxx为文库标签，gtctcgtgggctcgg为read2 sequencing primer部分序列；以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
62.实施例11、使用磁珠在微孔芯片中捕获细胞rna并逆转录1.1 抽取外周血并获得新鲜的pbmc细胞，重悬于pbs中；1.2 按照寻因公司已经市售的seekone
®ꢀ
mm 3’单细胞转录组文库构建试剂盒中提供的微孔芯片说明书处理芯片，并加入3000个孵育好的pbmc细胞；1.3 加入经pbs洗涤的偶联有 oligo (dt)
25 的 3um直径磁珠400μl至微孔板中，磁吸入孔后清洗掉多余磁珠；1.4 加入裂解液裂解2min；1.5 按照seekone
®ꢀ
mm 3’单细胞文库构建试剂盒中的如下配方配置逆转录体系400μl并混匀：1.6 取配置好的逆转录反应体系加入微孔板中，封口后置于以下温度条件反应；
1.7 完成后使用移液器注入450μl空气以清空芯片腔室，然后加入450μl 1
×
pbs以冲洗芯片；此步骤重复两次后将微孔芯片平放至4℃冰箱保存。注意不要颠倒芯片防止捕获磁珠在微孔之间交换造成细胞间rna污染。
63.2、对微孔芯片中磁珠上的cdna进行二链合成2.1 按试剂盒（neb #e7770s）如下配方配置二链合成试剂并混匀：2.2 取出实施例1中已完成逆转录的微孔芯片，使用移液器注入450μl空气以清空芯片腔室；然后注入400μl配置好的二链合成试剂，封口后置于16℃条件下反应1小时：2.3 完成后使用移液器注入450μl空气以清空芯片腔室，然后加入450μl 1
×
pbs以冲洗芯片；此步骤重复两次后将微孔芯片平放至4℃冰箱保存。注意不要颠倒芯片防止捕获磁珠在微孔之间交换造成细胞间rna污染。
64.3、使用转座酶对cdna打断并连接细胞标签3.1 按照以下方案配置转座酶反应液400μl并混匀：3.2 取出实施例1或实施例2中已完成逆转录或二链合成的微孔芯片，使用移液器注入450μl空气以清空芯片腔室；然后注入400μl配置好的转座酶反应液，将芯片置于pcr仪上55℃反应15分钟后冷却至10℃；3.3 反应完成后使用pbs冲洗3次芯片腔室并加入450μl 直径30um左右的cell barcoded beads，该beads可以是磁珠或水凝胶微珠；此处的cell barcoded beads携带的
具体核酸序列如下表所示，其中可裂解集团可以是可被光断裂的pclinker，也可以是被还原剂断裂的s-s键，本发明中这两种核酸修饰均由上海生工引物合成商合成；3.4 按以下体系配置连接反应体系并加入到微孔板中，使用紫外光裂解1min后置于22℃反应15min以完成连接反应。
65.4、扩增建库并测序分析4.1 将磁力板放置于实施例3中完成连接后的微孔芯片上方，使用移液器快速注入1000μlpbs吹出芯片腔室中悬浮的磁珠，使用10mm tris溶液洗涤两次后加入如下扩增反应体系吹匀后进行扩增以添加文库接头和样本标签：
将pcr产物用dna clean beads进行分选得到文库，文库大小如图5所示；实施例2本实施例提供的是提供一种pbmc的单细胞全序列转录组文库的构建。与实施例1的差异在于步骤2及步骤4。
66.其中步骤2的差异在于本实施例中无需进行二链合成，步骤1后直接进行步骤3即可。
67.所述步骤4差异部分仅为扩增酶体系不同，扩增体系如下：对比例1根据北京寻因科技公司的seekone
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mm 3’单细胞转录组试剂盒中记载的操作方法对pbmc细胞进行文库构建。
68.测试实施例illumina novaseq 6000测序，测序策略如图4所示。使用生物信息学方法分析测到的核酸序列在rna的位置和每个细胞测到的基因数。如图5~7所示，其中，实施例1的获取的核酸分布如图5a所示，对比例1的获取的核酸分布如图5b所示，实施例2获取的核酸分布如图6所示，实施例1~2以及对比例1测得的基因数目如图7所示，结果显示，本发明方法比普通的3’单细胞文库（seekone mm 3’转录组文库）更均匀分布在rna全长上，而且每个细胞测得的基因数明显3’单细胞文库高。
69.以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。
