具有黄嘌呤氧化酶抑制活性的小分子肽及其应用的制作方法
1.本发明涉及具有黄嘌呤氧化酶抑制活性的小分子肽及其应用，属于生物活性肽技术领域。
背景技术：
2.高尿酸血症是由嘌呤代谢紊乱引起的一种常见代谢疾病，以血清尿酸水平升高为特征。过高的尿酸水平可导致关节炎和痛风，甚至导致心血管疾病、高血压和ⅱ型糖尿病等。尿酸的产生和代谢是一个复杂的过程，参与嘌呤代谢的酶可以调节体内尿酸的产生，尿酸转运体调节尿酸的排泄和再吸收。黄嘌呤氧化酶（xo）是嘌呤分解代谢的关键酶，它催化次黄嘌呤生成黄嘌呤，然后生成尿酸，同时过高的xo水平也会导致尿酸在体内沉积，xo抑制剂可阻断尿酸的生物合成。因此xo是高尿酸血症的重要靶点。
3.近年来，各种合成的xo抑制剂如别嘌呤醇、非布索坦等被开发出来用于临床高尿酸血症。虽然合成的xo抑制剂作为抗高尿酸血症药物非常有效，但它们不可避免地会引起各种不良副作用，如过敏反应和血压升高，甚至心血管疾病和慢性肾脏疾病等。因此，迫切需要探索或开发具有较少不良副作用的xo抑制剂。
4.近几十年来，多肽由于其易吸收、无毒、高特异性和多种生物活性等特点引起了广泛的关注。越来越多的生物活性肽，如ace抑制肽和抗菌肽等从水产品中获得，然而从水产品中获取xo抑制肽的研究却较少。此外，传统的xo抑制肽纯化方法主要包括凝胶过滤、离子交换、反相高效液相谱等，耗时长且纯化过程繁琐，因此迫切需要一种更加简便可行的筛选xo抑制肽的研究方法。随着科学技术不断进步，结合高性能计算机辅助设计筛选活性肽的研究逐渐发展，比如利用分子对接技术不仅能减少筛选强度、降低筛选周期，还能提高筛选成功的概率。但是利用计算机模拟蛋白质酶解却受限于蛋白序列的长度，不适用于序列较大的蛋白质酶解，这大大降低了筛选xo抑制肽的效率。因此，酶解与分子对接相结合可能是一种替代传统酶解筛选xo抑制肽更可行、更有效的方法。
技术实现要素：
5.针对上述现有技术，本发明提供了6种具有黄嘌呤氧化酶抑制活性的小分子肽，及其应用。本发明主要是利用分子对接技术对虾酶解产物中xo抑制肽进行筛选，并通过分子对接阐明其高xo抑制活性的作用位点，确定其半抑制浓度。
6.本发明是通过以下技术方案实现的：具有黄嘌呤氧化酶抑制活性的小分子肽，为以下6种，氨基酸序列分别为：aeaqmwr，如seq id no.1所示；efgmggw，如seq id no.2所示；agginlar，如seq id no.3所示；mafgdkf，如seq id no.4所示；rwpgdmdr，如seq id no.5所示；
fnhhmf，如seq id no.6所示。
7.上述6种小分子肽，在作为或制备黄嘌呤氧化酶抑制剂中的应用；在作为或制备具有抑制尿酸水平功效的药物中的应用。
8.本发明通过实验研究，从南美白对虾的酶解液（胃蛋白酶、胰蛋白酶、α-糜蛋白酶）中筛选得到了6种具有黄嘌呤氧化酶抑制活性的小分子肽，这些小分子肽具有作为黄嘌呤氧化酶抑制剂、抑制尿酸水平的功能性产品的潜力，可用于制备具有抑制尿酸水平功效的药物。其中aeaqmwr、efgmggw及agginlar表现出更高的xo抑制活性，其预防高尿酸血症的潜在价值可能更大。本发明是对传统复杂的xo抑制肽筛选方法的革新，采用了传统酶解鉴定+分子对接相结合的筛选方法，提高了xo抑制肽的筛选工作效率。
9.本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。
附图说明
10.图1：南美白对虾酶解液中xo抑制肽的分离纯化，其中，图1：酶解液及超滤分离酶解液得到的不同分子量组分的xo抑制活性示意图。
11.图2：采用sephadex g-15凝胶层析柱纯化组分b（得到5个洗脱峰）示意图。
12.图3：葡聚糖凝胶柱纯化后得到的各组分（组分b1、b2、b3、b4、b5）的xo抑制活性示意图。
13.图4：b-3组分的lc
−ꢀ
ms/ms图谱。
14.图5：3种多肽的分子对接结果示意图，其中，a-c：3种多肽aeaqmwr、efgmggw及agginlar分别与xo的分子对接结果，绿代表hydrogen bond；浅蓝代表carbon hydrogen bond；橙代表attractive charge、pi-cation和salt-bridge；红代表unfavorable donor-donor；粉代表alkyl and pi-alkyl；玫瑰红代表pi-pi stacked。
具体实施方式
15.下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域技术人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
16.下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法、检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法、检测方法。
17.实施例1 南美白对虾的模拟胃肠道消化将南美白对虾的虾肉切碎后按1:9（w/v，g/ml）的比例与水混合，调整其ph至3.0。加入1.5%（w/w）的胃蛋白酶，37℃震荡反应4 h；然后调节酶解液ph至6.5，加入胰蛋白酶和α-糜蛋白酶，添加量均为1%（w/w），37℃继续反应1.5 h；煮沸灭酶10 min，得到酶解液，冻干保存。
18.实施例2 采用高效液相谱法验证活性肽的体外xo抑制活性取样品或100 mmol/l pbs缓冲液（ph 7.4），加入终浓度为0.7 mmol/l的黄嘌呤和0.15 u/ml的xo，37℃孵育15 min，加入1 mol/l盐酸终止反应。
19.谱柱为 agilent xdb c 18（250 mm
×
4.6 mm，5μm），流动相为85%的10 mmol/l
水溶液和15%甲醇，流速为1.0 ml/min。
20.最终混合物中尿酸的含量由290 nm处的吸光度测定。酶促反应中xo抑制活性计算为：[(空白尿酸含量
−
样品尿酸含量)/空白尿酸含量]
×
100%。
[0021]
实施例3 南美白对虾酶解液的超滤分离及活性测定通过两种分子量分别为10 kda和5 kda的超滤膜分离酶解液，收集不同分子量的组分测定其xo抑制活性，结果如图1所示。酶解液（组分a）被超滤为三个组分（组分b、c、d），其中，组分b（《5 kda）具有较高的xo抑制活性（50.46
±
0.68%，ic
50
=19.82
±
0.27 mg/ml），高于组分c（5～10 kda）和组分d（10 kda）。
[0022]
实施例4 葡聚糖凝胶过滤层析及其组分活性分析葡聚糖凝胶g-15加入适量超纯水煮沸2 h，除去浮沫及杂质；再加入超纯水搅拌、静置。除去上层杂质，重复以上操作直至上层无杂质。吸掉凝胶上层多余的水，将填料以玻璃棒引流至16 mm
×
80 cm层析柱，避免分层和气泡出现，柱子填好后用纯水冲洗，直至层析柱高度不再发生变化。
[0023]
以实施例3中测定得到的组分b作为样品进行上样。上样浓度及体积为：50 mg/ml，5 ml；收集出峰的组分（流动相为超纯水，洗脱速度为2 ml/min），冻干测定不同组分的活性。
[0024]
酶解液经凝胶谱柱的分离结果如图2所示，依次收集洗脱峰b1～b5，冻干后复配成多肽溶液，测定各组分的xo抑制率，结果如图3所示。洗脱峰b-3所对应的洗脱液的抑制率最高，因此选择洗脱峰b-3所对应的洗脱液进行下一步的实验。
[0025]
实施例5 b-3组分肽段组成的lc-ms/ms质谱鉴定（1）多肽提取b-3组分肽段脱盐后真空干燥，以0.1％三氟乙酸溶液复溶，测定肽段浓度，以备lc-ms分析。
[0026]
（2）lc-ms/ms分析采用easy-nlc 1200系统（thermo fisher scientific）和 q-exactive hf-x质谱（thermo scientific）进行多肽检测。多肽被装入内部填充的c 18毛细管捕集柱（100μm
×
20 mm， 5μm）中，并用 c 18分离柱（75μm
×
150 mm，3μm）分离。a流动相为0.1%甲酸（v/v）水溶液，b流动相为含0.1%甲酸（v/v）和 80%乙腈（v/v）的水溶液。梯度为：2%～5% b流动相0～2 min，5%～28% b流动相2～44 min，28%～40% b流动相44～51 min，40%～100% b流动相51～53 min，b流动相保持100% 53～60 min。扫描范围设置为300～1800 m/z，初级ms分辨率为60000@m/z 200，agc目标为3e6，一级最大it为50 ms。二次ms分辨率为15000@ m/z 200，agc靶为1e5，二次最大it为50 ms，ms2激活类型为hcd，隔离窗口为1.6 m/z，归一化碰撞能量为28。利用质谱检测的原始文件，用maxquant1.6.1.0 检索uniprot protein database，最终得到150个蛋白组和585个肽段。样品质谱basepeak图如图4所示。
[0027]
实施例6 肽段筛选、合成及验证（1）配体的处理采用chem3d pro 14 .0软件绘制多肽的分子结构式，保存为mo12文件。
[0028]
（2）对受体处理从pdb数据库中下载xo的晶体结构1n5x，采用discovery studio（ds）2019软件的
cdocker将1n5x中的b链删除，并抽离配体非布索坦（tei）保存备用。
[0029]
（3）分子对接使用discoverystudio（ds）2019软件的cdocker模块进行分子对接。对接坐标为x=96.6635,y=54.963,z=39.4334，对接半径为15
å
。其他参数保持默认值。对于每个配体，使用ds2019软件生成10个最佳位姿，通过-cdockerenergy、-cdockerinteractionenergy的数值确定其结合程度，筛选出能量值最高的15种多肽，合成验证其xo抑制活性，结果如表1所示。
[0030]
表1筛选的多肽信息
注：
①
由于分子对接结果具有随机性，表中显示的得分为10个最佳位姿的平均值；
②
多肽的毒性通过http://crdd.osdd.net/raghava//toxinpred/计算；
③“‑”
表示未检出活性。
[0031]
（4）多肽合成及活性验证表1中具有xo抑制活性的6个肽段，均由生工生物工程（上海）股份有限公司采用fmoc固相合成方法合成。多肽活性验证参照实施例2中的方法。
[0032]
如表1所示，6个肽段均具有xo抑制活性，其中，aeaqmwr，efgmggw及agginlar表现出更高的xo抑制活性，所以决定对这3种多肽进一步进行活性位点分析。
[0033]
分子对接结果表明（图5），传统氢键作用、相互吸引电荷作用和盐桥作用在xo抑制肽与xo的关键残基glu802、glu1261和arg880的相互作用中起重要作用。此外，多肽aeaqmwr的活性高于其他肽，这可能和aeaqmwr与xo中的关键金属原子mos3004连接有关。
[0034]
给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。
