一种基于喹啉设计的过氧化氢小分子荧光探针及其制备方法
1.本发明属于荧光探针技术领域，涉及了一种基于喹啉设计的过氧化氢小分子荧光探针的制备方法；具体的，是涉及了一种基于喹啉设计的过氧化氢小分子荧光探针的光学性能。
背景技术：
2.活性氧物种(ros)指的是含氧的活性物质。每种ros的化学反应活性和存在时间都不同。其中，过氧化氢(h2o2)是其中一种较为活跃的活性氧，因其具有相对温和的反应活性和较长的存在寿命而备受关注。据相关研究发现：体内的过氧化氢与细胞信号转导具有密切相关性。活细胞中过氧化氢浓度的异常可能会导致一系列器官功能紊乱，从而会进一步加剧核酸的氧化损伤和蛋白质结构的改变，并最终导致人类衰老和各种与年龄相关的疾病，如心血管疾病、神经退行性疾病、糖尿病和癌症等。
3.在目前已有的众多检测方法中，荧光探针法由于其响应快速和高灵敏度等能力，展现出了其他方法无法比拟的突出优势，特别是近红外(nir)荧光探针在用于活体成像时，因其有效的组织深度穿透能力和良好的信号可视比而备受欢迎。因此，发展一种低毒、高灵敏度、高选择性的过氧化氢探针具有极其重要的现实意义。
技术实现要素：
4.针对上述问题，本发明提供了一种基于喹啉设计的过氧化氢小分子荧光探针，该荧光探针化合物对过氧化氢专一性识别，比率检测并且灵敏度高。
5.本发明还提供了基于喹啉设计的过氧化氢小分子荧光探针的制备方法和性能。
6.本发明的技术方案是：本发明所述的一种基于喹啉设计的过氧化氢小分子荧光探针，所述荧光探针的结构式如式(ⅰ)所示：
[0007][0008]
进一步的，一种基于喹啉设计的过氧化氢小分子荧光探针的制备方法，其具体准备步骤如下：
[0009]
步骤(1)、将预备的间氨基苯酚通过环化反应得到中间体(ⅱ)；
[0010]
步骤(2)、再以中间体(ⅱ)和预备的4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯为原料，在有机溶剂中进行反应，最终制得荧光探针(ⅰ)，即过氧化氢小分子荧光探针。
[0011]
进一步的，在步骤(1)中，所述中间体(ⅱ)的具体制备步骤如下：
[0012]
首先，将预备的间氨基苯酚溶解在盐酸中，从而制得含有间氨基苯酚的反应试剂；
[0013]
其次，在室温搅拌下，将预制的四氯苯醌正丁醇溶液添加至上述反应试剂中，从而制得混合液。将制得的该反应混合液在搅拌中加热至回流，之后并将预制的巴豆醛正丁醇溶液缓慢滴加到该搅拌的回流溶液中，滴加时间不少于30分钟，添加完毕后，将该反应混合液再继续回流反应2-4小时；
[0014]
随后，反应完成后，待反应液冷却至室温后，再通过减压蒸馏除去有机溶剂正丁醇，后将残余物溶解到水中，并用乙醚萃取以除去残余物中残留的有机物；
[0015]
最后，将水层用10％naoh溶液中和后，再用乙酸乙酯萃取，合并的有机相用无水na2so4干燥后，减压除去有机溶剂即得粗产品；将该粗产品再通过薄层谱柱提纯，以制得纯的中间体(ⅱ)。
[0016]
进一步的，所述间氨基苯酚与盐酸的摩尔比是：1:3-4；
[0017]
所述四氯苯醌正丁醇溶液中四氯苯醌和正丁醇的摩尔比是：1:250-350；
[0018]
所述巴豆醛正丁醇溶液中巴豆醛和正丁醇的摩尔比是：1:1-5。
[0019]
进一步的，在步骤(2)中，所述荧光探针(ⅰ)的具体制备步骤如下：
[0020]
首先，将制备的中间体(ⅱ)、预备的4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯和碳酸钾依次溶解于有机溶液乙腈中，回流搅拌；待反应结束后制得反应液；
[0021]
然后，将制得的反应液抽滤，将滤渣用乙腈洗涤后，放入真空干燥箱干燥后得到荧光探针(ⅰ)。
[0022]
进一步的，所述中间体(ⅱ)、4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯和碳酸钾的摩尔比是：1:1.2:1.2。
[0023]
进一步的，一种基于喹啉设计的过氧化氢小分子荧光探针在检测溶液过氧化氢中的应用。
[0024]
具体的，1、间氨基酚，是一种有机化合物，化学式为c6h7no，是一种重要的精细化工中间体，广泛应用于医药、染料、农药等行业。
[0025]
2、四氯苯醌，tetra-chloro-benzoquinone，又称四氯对苯醌，四氯代醌，氯冉等；分子式c6cl4o2，分子量245.88；从乙酸或丙酮中析出者为金黄片状结晶，从苯或甲苯中析出者或升华制得者为单斜晶系黄柱状结晶；有令人不愉快的持久性气味；有升华性。不溶于水，难溶于冷乙醇、冷石油醚，溶于乙醚、氯仿、四氯化碳和二硫化碳；缓慢溶于碱溶液，当有空气存在时，生成红棕至紫的沉淀(四氯对苯醌钾)；可用作非内吸性杀菌剂，用于谷物、花生、蔬菜、棉花、豆类的种子杀菌，也可以用作染料中间体，农药原料以及制革行业等。
[0026]
本发明的有益效果是：该探针通过醚键将喹啉和硼酸酯连接起来，避免了季铵盐的形成而导致探针分子的分离纯化困难和膜透性差的不足；所得产品为固体粉末，易于存储，稳定性好；该探针分子与过氧化氢浓度均呈现良好的线性关系，r2＝0.996，检测限低至1.447μmol/l，这一数值低于大部分喹啉系过氧化氢荧光探针。与包括活性氧分子、氨基酸和无机盐在内的其他相关物种相比，该探针都对过氧化氢表现出优良的选择性识别。
附图说明
[0027]
图1是本发明实施例中制得的过氧化氢荧光探针在0.1％dmso的pbs缓冲液(10mm,ph＝7.4)中对不同浓度过氧化氢(h2o2)的紫外吸收光谱图；
[0028]
图2是本发明实施例中制得的过氧化氢荧光探针在0.1％dmso的pbs缓冲液(10mm,
ph＝7.4)中对不同浓度过氧化氢(h2o2)的荧光光谱响应图；
[0029]
图3是本发明实施例中制得的荧光探针检测过氧化氢时的响应时间图；
[0030]
图4是本发明实施例中制得的过氧化氢荧光探针在0.1％dmso的pbs缓冲液(10mm,ph＝7.4)中在不同ph下的荧光光谱响应图；
[0031]
图5是本发明实施例中制得的过氧化氢荧光探针在0.1％dmso的pbs缓冲液(10mm,ph＝7.4)中对相关物种选择性的荧光光谱响应图；
[0032]
图6是本发明实施例中制得的荧光探针的质谱ms谱图；
[0033]
图7是本发明实施例中制得的荧光探针的核磁共振1h-nmr谱图；
[0034]
图8是本发明实施例中制得的荧光探针的核磁共振
13
c-nmr谱图；
[0035]
图9是本发明的具体制备反应路线图。
具体实施方式
[0036]
为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面结合附图对本发明的技术方案做进一步的详细说明：
[0037]
本发明的合成路线如下所示：
[0038][0039]
其中，中间体(ⅱ)为2-甲基-7-羟基喹啉，化合物(ⅰ)为本发明所述检测过氧化氢荧光探针。
[0040]
进一步地，所述制备过程包括：
[0041]
(1)、制备中间体(ⅱ)：
[0042]
将间氨基苯酚溶解在12n盐酸中，制得含有间氨基苯酚的反应试剂中；
[0043]
随后依次将四氯苯醌正丁醇溶液添加到该试剂中，添加结束后，该混合液在105℃下回流；随后在此温度下，将预制的巴豆醛正丁醇溶液缓慢滴加到该搅拌的回流溶液中，添加完后再回流；反应完后通过减压旋蒸除去有机溶剂正丁醇，后将残余物溶解到水中并由乙醚洗涤，水层用10％naoh溶液中和后，用乙酸乙酯萃取，再通过薄层谱柱提纯，得到中间体(ⅱ)；
[0044]
(2)、制备荧光探针(ⅰ)，即：基于喹啉的过氧化氢荧光探针化合物ⅰ：
[0045]
将制备的中间体(ⅱ)、预备的4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯和碳酸钾依次溶解于有机
溶剂乙腈中，在80℃下回流搅拌；待反应结束后，将反应液抽滤，滤渣用乙腈洗涤后，放入真空干燥箱干燥后得到制备荧光探针(ⅰ)，即：基于喹啉的过氧化氢荧光探针化合物ⅰ。
[0046]
本发明所述的基于喹啉设计的过氧化氢小分子荧光探针在检测溶液中过氧化氢的应用。
[0047]
本发明中使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。实验所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中所选用的以下所有试剂皆为市售分析纯或化学纯。
[0048]
实施例1
[0049]
一种基于喹啉设计的过氧化氢小分子荧光探针的制备方法，其制备方法：
[0050]
(1)、制备中间体(ⅱ)2-甲基-7-羟基喹啉
[0051]
首先，将间氨基苯酚(775.0mg,7.1mmol)溶解在12n hcl中，随后依次将四氯苯醌(1.81g,7.1mmol)和正丁醇(2.5ml)添加到反应混合液中，添加结束后，反应混合液在105℃下回流；随后在此温度下，将巴豆醛(0.2ml)和正丁醇(0.2ml)的混合液在20min内滴加到反应液中，添加完后再回流30min；反应完后通过减压旋蒸除去反应液中的正丁醇，后将残余物溶解到水中并由乙醚洗涤，水层用10％naoh溶液中和后，用乙酸乙酯(50ml
×
3)萃取，合并的有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，再通过薄层谱柱提纯(v
ea
:v
pe
＝3:2)，旋干，真空干燥得2-甲基-7-羟基喹啉(31.8mg，收率为20％)。
[0052]
所得中间体(ⅱ)的结构式为：
[0053][0054]
(2)、制备基于喹啉设计的过氧化氢荧光探针化合物：
[0055]
将2-甲基-7-羟基喹啉(159.2mg,0.2mmol)、4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯(71.3mg,0.24mmol)和碳酸钾(33.2mg,0.24mmol)依次溶解于乙腈中，在80℃下回流12h；待反应结束后，将反应液抽滤，滤渣用乙腈(5ml
×
2)洗涤后，放入真空干燥箱干燥后得到基于喹啉设计的过氧化氢荧光探针化合物ⅰ，为白粉末(225.2mg，收率为60％)。
[0056]
所得到的荧光探针化合物结构式为：
[0057][0058]
本发明制得的过氧化氢荧光探针化合物1h nmr(400mhz,chloroform-d)δ7.94(d,j＝8.3hz,1h),7.84(d,j＝8.1hz,2h),7.64(d,j＝8.9hz,1h),7.48(d,j＝8.2hz,2h),7.42(d,j＝2.5hz,1h),7.21(dd,j＝8.9,2.5hz,1h),7.13(d,j＝8.3hz,1h),5.21(s,2h),2.70(s,3h),1.34(s,12h).
13
c nmr(101mhz,chloroform-d)δ159.9,159.3,149.4,139.7,136.0,135.2(2c),128.7,126.8(2c),121.8,120.0,119.2,108.0,83.9(2c),77.4,70.0,25.4,25.0(4c).ms(api),m/z(％):calcd for c
23h26
bno3([m+h]
+
):376.3,found:376.2.
[0059]
实施例1中制得的荧光探针的质谱ms谱图、核磁共振1h-nmr谱图、核磁共振
13
c-nmr谱图分别如图6、图7和图8所示，说明本发明的荧光探针成功合成。
[0060]
实施例2
[0061]
将实施例1制得的过氧化氢检测荧光探针用pbs缓冲液配置成1mm的探针储备液，过氧化氢及相关对比物种用去离子水配置成3mm的储备液，向3ml的0.1％dmso的pbs缓冲液中加入30μl的探针储备液和100μl的过氧化氢储备液并用荧光光谱仪和紫外分光光度计进行检测，测试得知荧光探针的最大激发波长为242nm，最大发射波长为390nm，具体测试结果如下：
[0062]
取两个比皿，分别加入3ml的0.1％dmso的pbs缓冲液和30μl的探针储备液，向其中一个比皿加入0～100μl的过氧化氢储备液，另外一个比皿不加过氧化氢储备液，进行紫外光谱测试；如图1所示，荧光探针本身在波长λ＝311nm处有较强的紫外吸收，当往溶液中加入过氧化氢后，紫外吸收峰渐渐的减弱；除此之外，荧光探针在波长λ＝390nm处几乎没有紫外吸收，当往溶液中增加过氧化氢浓度后，紫外吸收峰渐渐的增强；结果表明探针对h2o2具有很高的灵敏度。
[0063]
如图2所述，该探针对不同浓度过氧化氢(h2o2)的荧光光谱响应图；向3ml的0.1％dmso的pbs缓冲液中加入30μl的探针储备液和0～100μl(0、10、20、30
……
90、100μl)的过氧化氢储备液，该荧光探针在溶液中本身有荧光，随着过氧化氢浓度的增加，在390nm处荧光不断的减弱，在506nm处荧光不断的增强，检测限低至1.447μmol/l，r2＝0.996；说明该探针能够进行比率检测并且与过氧化氢浓度呈现良好的线性关系。
[0064]
如图3所示，向3ml的0.1％dmso的pbs缓冲液中加入30μl的探针储备液和100μl的过氧化氢储备液，探针在390nm处的荧光强度逐渐降低，并且在40分钟内达到稳定值。
[0065]
如图4所示，加入3ml经过hcl和naoh调整后的ph为4、5、6、7、8、9、10的pbs缓冲液，再加入30μl探针和100μl过氧化氢储备液；摇匀后静置1h，测定其荧光强度；当探针与过氧化氢反应后，在ph＝4-8的范围内荧光强度明显降低，然后随着ph继续升高，发现荧光强度在ph＝8时达到最小值，之后在ph＝9-10内荧光强度有所回升，表明探针具备在弱碱性环境中检测过氧化氢的能力。
[0066]
如图5所示，该探针加入各种对比物种后的荧光光谱图；向3ml的0.1％dmso的pbs缓冲液中加入30μl的探针储备液和100μl的各种对比物种储备液，结果表明加入过氧化氢时，荧光光谱在390nm处荧光强度发生了明显的降低，而加入其他对比物种时，荧光无明显变化，即本发明的荧光探针对过氧化氢有很好的选择性。
[0067]
最后，应当理解的是，本发明中所述实施例仅用以说明本发明实施例的原则；其他的变形也可能属于本发明的范围；因此，作为示例而非限制，本发明实施例的替代配置可视为与本发明的教导一致；相应地，本发明的实施例不限于本发明明确介绍和描述的实施例。
