一种菌酶酸复合制剂及其应用的制作方法
1.本发明属于饲料添加剂技术领域，具体涉及一种菌酶酸复合制剂及其应用。
背景技术：
2.饲料原料常见的霉菌毒素来源有：曲霉菌属(aspergillus，主要分泌黄曲霉毒素等)、青霉菌属(penicillium，主要分泌赭曲霉毒素、桔霉素等)、镰刀菌属(fusarium，主要分泌呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、t-2毒素等)和镰刀菌、赭曲霉、桔青霉属(主要分泌麦角毒素)等。霉菌的大量繁殖会引起饲料发生霉变，这不仅会使饲料的适口性降低，而且还会影响畜禽的采食量，同时由于霉菌的生长和繁殖是通过饲料中的营养成分来供给，因此霉变还会降低饲料的营养价值。另外，霉菌在代谢过程中产生霉菌毒素，而霉菌毒素在畜禽采食后不仅会影响畜禽的免疫机能，高剂量的霉菌毒素还会导致畜禽发生中毒现象。据统计，有66％以上的饲料原料至少存在1种霉菌毒素污染，35％的饲料原料存在2种以上霉菌毒素污染，而玉米粕、豆粕及麸皮等霉菌毒素的含量是整粒谷物含量的30～500倍，几乎所有的花生粕都存在霉菌毒素污染，饲料霉变严重危害饲料业及畜牧业。
3.为此，急需开发能够抑制饲料原料中有害霉菌的绿产品，以提高饲料产品的安全性，减少公共危害。
技术实现要素：
4.本发明的目的是提供一种能够抑制多种霉菌生长繁殖的饲料添加剂。
5.为此，本发明提供了一种菌酶酸复合制剂，包括：3-4份葡萄糖氧化酶、3-4份凝结芽孢杆菌、1-2份乳酸制剂和0-2份载体。
6.具体的，上述葡萄糖氧化酶的酶活为8000u/g。
7.具体的，上述凝结芽孢杆菌的菌活为1.0
×
10
10
cfu/ml。
8.具体的，上述乳酸制剂中乳酸质量浓度为25％。
9.本发明还提供了一种抑制饲料中镰刀菌、赭曲霉、桔青霉生长繁殖的方法，包括以下步骤：将上述菌酶酸复合制剂加入到生理盐水中，摇床提取后离心取上清液，得到菌酶酸复合制剂溶液，将所述菌酶酸复合制剂溶液加入到饲料中混匀。
10.具体的，以饲料质量计，所述菌酶酸复合剂溶液的添加量为0.48％-1.6％。
11.与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
12.本发明提供的这种菌酶酸复合制剂可显著抑制镰刀菌、赭曲霉、桔青霉的生长繁殖，将其作为添加剂加入饲料中，能够从源头抑制镰刀菌、赭曲霉、桔青霉，有效去除饲料中相应酶菌毒素的累积，可提高饲料产品的安全性，减少公共危害。
13.以下将结合附图对本发明做进一步详细说明。
附图说明
14.图1是本发明实施例3中不同试验组桔青霉生长情况；a、试验组1；b、试验组2、c、试
验组3；d、试验组4；e、试验组5；f、试验组6；g、阳性对照；h、阴性对照。
15.图2是本发明实施例3中不同对照组桔青霉生长情况；a、对照组1；b、对照组2、c、对照组3。
16.图3是本发明实施例3中不同试验组赭曲霉生长情况；a、试验组1；b、试验组2、c、试验组3；d、试验组4；e、试验组5；f、试验组6；g、阳性对照；h、阴性对照。
17.图4是本发明实施例3中不同对照组赭曲霉生长情况；a、对照组1；b、对照组2、c、对照组3。
18.图5是本发明实施例3中不同试验组镰刀菌生长情况；a、试验组1；b、试验组2、c、试验组3；d、试验组4；e、试验组5；f、试验组6；g、阳性对照；h、阴性对照。
19.图6是本发明实施例中3不同对照组镰刀菌生长情况；a、对照组1；b、对照组2、c、对照组3。
具体实施方式
20.下面将结合实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。尽管已经详细描述了本发明的代表性实施例，但是本发明所属技术领域的普通技术人员将理解，在不脱离本发明范围的情况下可以对本发明进行各种修改和改变。因此，本发明的范围不应局限于实施方案，而应由所附权利要求及其等同物来限定。
21.下面通过具体实施例对本发明的菌酶酸复合制剂的效果进行研究，本发明实施例中使用的乳酸制剂中乳酸质量浓度为25％。
22.实施例1：
23.本实施例提供了一种菌酶酸复合制剂，包括：3份葡萄糖氧化酶、4份凝结芽孢杆菌、2份乳酸制剂和2份淀粉。
24.其中葡萄糖氧化酶的酶活为8000u/g，凝结芽孢杆菌的菌活为1.0
×
1010cfu/ml。
25.实施例2：
26.本实施例提供了一种菌酶酸复合制剂，包括：4份葡萄糖氧化酶、3份凝结芽孢杆菌、1份乳酸和1份淀粉。
27.其中葡萄糖氧化酶的酶活为8000u/g，凝结芽孢杆菌的菌活为1.0
×
1010cfu/ml。
28.实施例3：
29.本实施例研究了酶酸复合制剂对镰刀菌、赭曲霉、桔青霉的抑制作用，具体步骤如下。
30.1、配制培养基
31.pda培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水补足至1000ml。液体培养基不添加琼脂。
32.察氏培养基：：硝酸钠3g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁(mgso4·
7h2o)0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，蔗糖30g，琼脂15～20g，蒸馏水补足至1000ml。液体培养基不添加琼脂。
33.ypd培养基：1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖，2％琼脂粉。液体培养基不添加琼脂。
34.2、实验试剂配制
35.制备菌酶酸复合制剂溶液：称取1g实施例1提供的酶酸复合制剂，加入99ml灭菌的生理盐水，于摇床提取30min，离心取上清，再用灭菌生理盐水稀释至不同浓度，备用。
36.制备镰刀菌悬液：将镰刀菌接种于50ml pda液体培养基中，置于28℃培养72h左右，观察菌悬液浑浊度，选择对数期菌液作为试验菌悬液备用。
37.制备赭曲霉菌悬液：将赭曲霉接种于50ml察氏液体培养基中，置于28℃培养72h左右，观察菌悬液浑浊度，选择对数期菌液作为试验菌悬液备用。
38.制备桔青霉菌悬液：将桔青霉接种到ypd斜面，置于28℃培养72h左右，用无菌生理盐水从斜面洗脱菌液，作为备用菌悬液。
39.制备葡萄糖氧化酶溶液：称取1g酶活为8000u/g的葡萄糖氧化酶，加入99ml灭菌的生理盐水，于摇床提取30min，离心取上清，再用灭菌生理盐水稀释至不同浓度，备用。
40.制备凝结芽孢杆菌溶液：称取1g菌活为1.0
×
1010cfu/ml的凝结芽孢杆菌，加入99ml灭菌的生理盐水，于摇床提取30min，离心取上清，再用灭菌生理盐水稀释至不同浓度，备用。
41.制备乳酸溶液：称取1g乳酸，加入99ml灭菌的生理盐水，于摇床提取30min，离心取上清，再用灭菌生理盐水稀释至不同浓度，备用。
42.3、平板混菌实验
43.(1)桔青霉组
44.取11个pda平板培养基，分别作为阴性对照组、阳性对照组、试验组1-6和对照组1-3，每个平板中菌酶酸复合制剂溶液和桔青霉菌悬液的添加量如下，其中菌酶酸复合制剂的浓度为相对于平板中培养基的体积浓度。
45.阳性对照：加入1ml的桔青霉菌悬液；
46.阴性对照：加入1ml经煮沸5分钟灭活的桔青霉菌悬液；
47.试验组1：加入1ml的桔青霉菌悬液和0.08％的菌酶酸复合制剂溶液；
48.试验组2：加入1ml的桔青霉菌悬液和0.16％的菌酶酸复合制剂溶液；
49.试验组3：加入1ml的桔青霉菌悬液和0.32％的菌酶酸复合制剂溶液；
50.试验组4：加入1ml的桔青霉菌悬液和0.48％的菌酶酸复合制剂溶液；
51.试验组5：加入1ml的桔青霉菌悬液和0.64％的菌酶酸复合制剂溶液；
52.试验组6：加入1ml的桔青霉菌悬液和1.6％的菌酶酸复合制剂溶液；
53.对照组1：加入1ml的桔青霉菌悬液和1.6％的葡萄糖氧化酶溶液；
54.对照组2：加入1ml的桔青霉菌悬液和1.6％的凝结芽孢杆菌溶液；
55.对照组3：加入1ml的桔青霉菌悬液和1.6％的乳酸溶液。
56.将各组均置于28℃摇床培养72h，观察桔青霉的生长情况，结果如图1-2所示。6个试验组桔青霉平板上均未正常生长，但加入到平板中的菌丝周边有气泡，可能菌体未被杀死或完全抑制，仍有活力，但生长十分缓慢，已无法繁殖。阳性对照组和对照组1-4中桔青霉生长旺盛。
57.检测各试验组和对照组对桔青霉cgmcc 3.10140抑菌率，结果如表1所示。
58.表1桔青霉抑菌率检测结果
[0059] 抑菌率试验组190％
试验组292％试验组397％试验组499％试验组5100％试验组6100％对照组130％对照组215％对照组310％
[0060]
(2)赭曲霉组
[0061]
取11个察氏平板培养基，分别作为阴性对照组、阳性对照组、试验组1-6和对照组1-3，每个平板中菌酶酸复合制剂溶液和赭曲霉菌悬液的添加量如下，其中菌酶酸复合制剂的浓度为相对于平板中培养基的体积浓度。
[0062]
阳性对照：加入1ml的赭曲霉菌悬液；
[0063]
阴性对照：加入1ml经煮沸5分钟灭活的赭曲霉菌悬液；
[0064]
试验组1：加入1ml的赭曲霉菌悬液和0.08％的菌酶酸复合制剂溶液；
[0065]
试验组2：加入1ml的赭曲霉菌悬液和0.16％的菌酶酸复合制剂溶液；
[0066]
试验组3：加入1ml的赭曲霉菌悬液和0.32％的菌酶酸复合制剂溶液；
[0067]
试验组4：加入1ml的赭曲霉菌悬液和0.48％的菌酶酸复合制剂溶液；
[0068]
试验组5：加入1ml的赭曲霉菌悬液和0.64％的菌酶酸复合制剂溶液；
[0069]
试验组6：加入1ml的赭曲霉菌悬液和1.6％的菌酶酸复合制剂溶液；
[0070]
对照组1：加入1ml的赭曲霉菌悬液和1.6％的葡萄糖氧化酶溶液；
[0071]
对照组2：加入1ml的赭曲霉菌悬液和1.6％的凝结芽孢杆菌溶液；
[0072]
对照组3：加入1ml的赭曲霉菌悬液和1.6％的乳酸溶液。
[0073]
将各组均置于28℃摇床培养72h，观察赭曲霉的生长情况，结果如图3-4所示。6个试验组平板上均未见赭曲霉生长，跟阴性对照一致，说明菌酶酸产品对赭曲霉抑制效果明显。阳性对照组和对照组1-4中赭曲霉生长旺盛。
[0074]
检测各试验组和对照组对赭曲霉cgmcc 3.6255抑菌率，结果如表2所示。
[0075]
表2赭曲霉抑菌率检测结果
[0076]
[0077][0078]
(3)镰刀菌组
[0079]
取11个ypd平板培养基，分别作为阴性对照组、阳性对照组、试验组1-6和对照组1-3，每个平板中菌酶酸复合制剂溶液和镰刀菌菌悬液的添加量如下，其中菌酶酸复合制剂的浓度为相对于平板中培养基的体积浓度。
[0080]
阳性对照：加入1ml的镰刀菌菌悬液；
[0081]
阴性对照：加入1ml经煮沸5分钟灭活的镰刀菌菌悬液；
[0082]
试验组1：加入1ml的镰刀菌菌悬液和0.08％的菌酶酸复合制剂溶液；
[0083]
试验组2：加入1ml的镰刀菌菌悬液和0.16％的菌酶酸复合制剂溶液；
[0084]
试验组3：加入1ml的镰刀菌菌悬液和0.32％的菌酶酸复合制剂溶液；
[0085]
试验组4：加入1ml的镰刀菌菌悬液和0.48％的菌酶酸复合制剂溶液；
[0086]
试验组5：加入1ml的镰刀菌菌悬液和0.64％的菌酶酸复合制剂溶液；
[0087]
试验组6：加入1ml的镰刀菌菌悬液和1.6％的菌酶酸复合制剂溶液；
[0088]
对照组1：加入1ml的镰刀菌菌悬液和1.6％的葡萄糖氧化酶溶液；
[0089]
对照组2：加入1ml的镰刀菌菌悬液和1.6％的凝结芽孢杆菌溶液；
[0090]
对照组3：加入1ml的镰刀菌菌悬液和1.6％的乳酸溶液。
[0091]
将各组均置于28℃摇床培养72h，观察镰刀菌的生长情况，结果如图5-6所示。添加量在0.08％-0.32％的试验组1-3镰刀菌抑制率在50％以上，添加量0.48％-1.6％的试验组4-6能完全抑制镰刀菌。阳性对照组和对照组1-4中桔青霉生长旺盛。检测各试验组和对照组对镰刀菌cgmcc 3.4610抑菌率，结果如表3所示。
[0092]
表3镰刀菌抑菌率检测结果
[0093]
[0094][0095]
综上所述，添加量不低于0.48％时，菌酶酸复合制剂对镰刀菌、赭曲霉、桔青霉的生长抑制效果显著。
[0096]
以上例举仅仅是对本发明的举例说明，并不构成对本发明的保护范围的限制，凡是与本发明相同或相似的设计均属于本发明的保护范围之内。
