黄芩根水解物的生产方法、该方法得到的水解物及其在化妆品和皮肤学级化妆品方面的应用与流程
olszewska z.b.等，adv.clin.exp.med.，2008：17，337-345)。因此，基于这种植物化学特性，不出意外地，含有某些黄酮类衍生物的黄芩根的水提取物或醇提取物对于生物体具有广泛的活性：抗肿瘤、抗病毒、抗微生物、抗炎、抗氧化、神经保护、肝保护、抗惊厥等(wang z.l.等，pharm.biol.，2018：56，465-484及其引用文献)。
5.关于定性和定量评价存在于植物根部的代谢物的文献一致认为，被称为“黄芩苷”(系统化学命名为5,6-二羟基黄酮-7-o-β-d-葡萄糖醛酸苷)和“汉黄芩苷”(5,7-二羟基-8-甲氧基黄酮-7-o-β-d-葡萄糖醛酸苷)的黄酮类化合物、以及它们相应的苷元衍生物“黄芩素”(5,6,7-三羟基黄酮)和“汉黄芩素”(5,7-二羟基-8-甲氧基黄酮)共同构成了在植物根部发现的代谢物中最主要的部分(li c.等，biopharm. amp;drug disposition，2011：32，424-445；zhao q.等，sci.bull.，2016，61，1391-1398)。另外据报道，对于该植物而言，这些主要代谢物的游离形式(苷元)比它们的糖基化类似物具有更高的药理学活性，从而暗示了此类黄酮苷元在上述“黄芩”的临床效果中发挥了至关重要的作用(wang z.l.等，pharm.biol.，2018，56，465-484及其参考文献)。
6.由于黄芩素和汉黄芩素这两种苷元各自在生物体中表现出的许多优点，它们在植物界的分布引起了人们极大的兴趣。黄芩素被认为针对转移酶和若干种癌症具有细胞毒性(liu h.等，int.j.mol.，2016：17，1-18)。汉黄芩素也因其强效的抗肿瘤活性和细胞凋亡活性出现在有效的抗癌策略中(wu x.等，onco targets and ther.，2016：6，2935-2943)。在皮肤护理领域，发现汉黄芩素可作为增白剂有效皮肤素沉着(kudo m.等，plos one，2017：12，1-26)。最近对皮肤病中的表皮角质形成细胞进行的研究表明，黄芩素表现出抑制促炎性白细胞介素产生的能力(da x.等，j.dermatol.sci.，2019：95,84-87)。最后，汉黄芩素和黄芩素都被证明有利于修复长期暴露于紫外线辐射引起的皮肤损伤(kimura y.等，2011：661，124-132)。
技术实现要素：
7.此外，为了响应日益增长的在化妆品产品中融合创新、安全和有效的天然来源活性成分的需求，基于上述发现，申请人开始关注新的黄芩提取物的设计；在一方面，在其中的糖苷前体进行受控转化后，所述新的黄芩提取物富集了汉黄芩素和黄芩素的含量；另一方面，所述新的黄芩提取物由这两种苷元目标标志物的标准化比值定义。
[0008]“标准化比值”是指在对几种汉黄芩素与黄芩素的合成复制品的混合物进行比较筛选后确定的汉黄芩素和黄芩素的质量比(重量/重量)，其目的是定义能够使新提取物在皮肤上具有最佳生物学特性的所述两种标志物的比值。这种测定起源于人们对来自不同背景的、用于特定药物制剂的黄芩批次进行的定性测定；发明人注意到，这一过程不仅关注对植物化学单组分的单独定量，现在还关注重要的黄酮类化合物之间的比例(shang x.等，j.ethnopharmacol.，2010：128，279-313)。
[0009]“受控转化”是指确定能够使所释放的目标黄酮苷元同时保持增溶和稳定的操作条件。
[0010]
已知黄酮类化合物的化学性质通常不稳定，这是此类受控转化的限制因素(wang j.，j.serb.chem.soc.，2016：81，243-253)。这种不稳定性容易导致它们的降解，特别是例如发生不利的自氧化或二聚反应。黄酮苷元的另一典型问题通常是它们几乎不溶于除短链
醇以外的常用溶剂及其混合物，特别地，这导致它们在本质为水性的水解介质里形成时发生沉淀或结晶。因此，虽然传统的水-醇提取法(尤其是使用乙醇/水混合物)经常被用于获得植物提取物，由于在使用这种方法时无法确保植物中原本存在的所有代谢物都已被提取，导致在最终产品里仅存在部分苷元形式，因而应当放弃这种方法。此外，这种类型的提取通常需要易燃的短链醇溶剂、例如乙醇，因此不适用于工业规模的生产。
[0011]
因此，鉴于上述情况，本发明计划解决的技术问题是开发一种工业规模的用于获取黄芩根水解提取物的方法，该提取物对游离形式(苷元)的目标黄酮类化合物进行富集和标准化。更具体地来讲，所述问题在于研究和确定提取、水解和加工条件，该条件使得黄芩苷和汉黄芩苷这两种糖苷最大限度地、不变性地转化为它们各自对应的苷元——黄芩素和汉黄芩素，并在没有任何纯化步骤的情况下在所述苷元溶液中达到最佳回收率。在设计水解提取物之前，申请人在一项旨在确定使能够抑制皮肤炎症介质分泌功能的试剂达到最佳效能的汉黄芩素与黄芩素的比值的实验中，确定了汉黄芩素与黄芩素的重量比的最小值应当约为0.2(参见以下试验1)；之后，申请人在该富集问题中加入了使汉黄芩素与黄芩素的质量比接近0.2的探索。
具体实施方式
[0012]
为了实现这些目标、特别是使糖缀合物达到最大转化率的目标，申请人自然地想到了酶水解技术。事实上，开发内源性水解酶被认为是解决本发明提出的技术问题的机会，特别是因为在贝加尔黄芩中有大量的内源性水解酶存在，尤其是β-d-葡萄糖醛酸苷酶和β-d-葡萄糖苷酶，即使不确定其他属于β-d-糖苷酶的水解酶是否存在(yu c.等，pharm.biol.，2013：51，1228-1235及其引用文献)。
[0013]
在此基础上，申请人首先通过活化步骤利用了植物的这种内源性活性。然后在作为本发明的基础的第二步中，申请人发现，在一组适当的操作条件下进行的目标代谢物的提取、水解和回收的序贯过程可以在不导致水解产物变性的情况下，根据预先定义的标准化比值，同时完全释放溶液中的两种目标苷元形式。特别是已经观察到，与技术偏见相反，在严格的操作条件和特定的ph、温度和水/混溶溶剂比下，将某种类型的有机溶剂引入水解介质中(在此情况下为二元醇、优选1,3-丙二醇)最终不会影响内源性酶水解，而且在另一方面，会作为目标水解产物的适当的增溶剂和稳定剂。因此，这种工艺的开发对上述目标作出了令人满意的回应，而且还具有以下其他优点：
[0014]-在不影响或干扰黄酮糖苷的水解动力学的情况下，通过添加这种二元醇使反应介质均匀化，更不会像现有技术所预测的那样导致植物内源酶的变性，尽管蛋白质和酶在醇(booth n.，biochem.j.1930：24，1699-1705)或水/有机共溶剂混合物(mozhaev v.v.等，eur.j.biochem.，1989：184，597-602)的存在下会发生众所周知的变性。因此，通过将两种目标黄酮苷元在此类生理学上可接受的用于化妆品的溶剂中进行此类最优的增溶和稳定化，可以通过简单、快速、易于以工业规模应用的工艺最终获得水解提取物，该工艺被称为“一锅法”，即产生可直接用于化妆品的提取物；
[0015]-获得了在长期保存的情况下具有稳定性以及物理化学和感官特性(颜、透明度)的水解提取物(参见以下试验2)，并具有固有的杀菌特性(特别是当使用1,3-丙二醇时)，从而避免添加抗菌添加剂；
[0016]-最后，作为本发明的另一个重要方面，获得了相对于参与皮肤胞外基质的蛋白质水解的基质金属蛋白酶来说生物学表现远优于天然提取物的水解提取物(参见以下试验3)。“天然提取物”是指在植物内源酶被激活后未发生水解作用的提取物，因此是一种主要成分为黄酮糖苷的未水解的提取物。
[0017]
关于可能接近本发明所提技术问题的解决方案的现有技术，应当注意一篇仅出于分析目的对黄芩进行动力学研究的文章，其目的是在相对于后续提取步骤之前对植物进行“预处理”的上下文中，观察能够影响黄酮糖苷转化为其相应苷元衍生物的主要物理化学参数的影响程度(yu c.等，pharm.biol.，2013：51，1228-1235及其引用文献)。然而与本发明不同的是，该文章没有提出任何在溶液中(以经过水解、并对目标代谢物进行标准化的提取物形式)进行最优化回收的技术解决方案。在现有技术中，还提到了将汉黄芩苷和/或黄芩苷这两种糖苷转化为其各自对应的苷元的生物催化方法，但添加了外源性糖苷酶(yu c.等，oncology reports，2013：30，2411-2418)或者甚至是特定的发酵微生物(yun m.y等，pharmacogn.mag.，2018：14，s453-7)。最后，在提取溶剂方面，乙醇在局部施用的生物制药目的方面成为了设计黄芩提取物的最佳溶剂(vytis cizinauskas，论文摘要，2013年5月)。在最近一项旨在观察黄芩根提取过程中黄芩苷水解动力学的研究中也使用了乙醇(boyko.n.n.等，pharm. amp;pharmacol.，2019：7，129-137)。
[0018]
因此，本发明的第一个目的是提供生产对汉黄芩素和黄芩素进行富集并标准化的黄芩属植物根部水解物的方法，包括以下步骤：
[0019]
(i)激活内源性酶、优选一种或多种β-糖苷酶的阶段，在约0.1至约0.5的根/水重量比下，通过机械搅拌对所述根进行分散，持续约10分钟至约1小时；
[0020]
(ii)通过热化学手段对步骤(i)中获得的分散物进行酶水解的阶段，本阶段包括以下步骤：(a)以约1至约5的溶剂/水重量比加入二元醇型混溶性有机溶剂；(b)在约40至约55℃的温度下，对步骤(ii/a)中获得的反应介质进行约20小时至约50小时的热处理；
[0021]
(iii)对在步骤(ii)中获得的反应介质中的酶活性进行不可逆抑制的阶段，在约65℃至约90℃的温度下进行约1小时至约3小时的热处理；
[0022]
(iv)将ph值调节至约3.5至约5.5的阶段；
[0023]
(v)调节粗水解物质量的阶段，添加二元醇型溶剂以保证水解物以约1.8％至约2.5％的可变含量折合为其干提取物。
[0024]
在步骤(v)结束时获得的“对汉黄芩素和黄芩素进行富集并标准化的黄芩属植物根部水解物”是指首先需要至少符合以下标准之一的水解物：
[0025]-对游离形式(苷元)的汉黄芩素和黄芩素进行富集并标准化的水解物，特别是与传统的水-醇型提取物相比的情况，该水-醇型提取物用于对天然状态下的植物进行植物化学成分的常规分析；
[0026]-对汉黄芩素和黄芩素进行富集并标准化的水解物，其中汉黄芩素/黄芩素重量比至少为约0.2；
[0027]-包含汉黄芩素摩尔含量为约1mm至约5mm(即重量含量为约0.28mg/g至约1.40mg/g)的水解物；
[0028]-包含黄芩素摩尔含量为约10mm至约15mm(即重量含量为约2.7mg/g至约4.05mg/g)的水解物；
[0029]-包含汉黄芩苷重量含量小于约50ppm(即小于约0.05mg/g)的水解物；
[0030]-包含黄芩苷重量含量小于约50ppm(即小于约0.05mg/g)的水解物；
[0031]-汉黄芩苷到汉黄芩素的转化率至少为约95％的水解物；
[0032]-黄芩苷到黄芩素的转化率至少为约95％的水解物；
[0033]-溶解的汉黄芩素回收率至少为约80％的水解物；
[0034]-溶解的黄芩素回收率至少为约60％的水解物。
[0035]
其次，“对汉黄芩素和黄芩素进行富集并标准化的黄芩属植物根部水解物”应理解为至少符合以下标准之一的水解物：
[0036]-对汉黄芩素和黄芩素进行富集并标准化的水解物，其中汉黄芩素/黄芩素重量比至多为约0.4；
[0037]-未经过任何谱分离步骤的水解物；
[0038]-可直接用于化妆品的水解物，特别是在化妆品配方的背景下。
[0039]
根据本发明的优选实施方案，根据本发明的术语“黄芩属植物的根”是指预先被研磨或粉碎的根，并且任选被碎减成粉末状态。这些根来自一种或多种选自于以下宣称具有相似植物成分的物种：黄芩(scutellaria baicalensis)、滇黄芩(scutellaria amoena)、半枝莲(scutellaria barbata)、连翘叶黄芩(scutellaria hypericifolia)、美黄芩(scutellaria lateriflora)、南美黄芩(scutellaria racemosa)、scutellaria tomentosa、粘毛黄芩(scutellaria viscidula)、scutellaria wrightii和木根黄芩(scutellaria planipes)(chiang chan e.w.等,j.chin.pharma.sci.,2019,28,217-228；shang x.等,j.ethnopharmacol.,2010,128,279-313)。优选地，这些根来自于黄芩或美黄芩。特别优选地，这些根来自于黄芩。
[0040]
根据本发明的优选实施方案，根被碾碎或磨碎，并碎减成粉末状态。
[0041]
根据本发明的优选实施方案，步骤(i)中的根/水重量比为约0.2。
[0042]
根据本发明的优选实施方案，步骤(ii/a)中的溶剂/水重量比为约4。
[0043]
根据本发明的优选实施方案，步骤(ii/a)中的二元醇型混溶性有机溶剂优选选自于1,3-丙二醇、1,2-丙二醇、甲基丙二醇、苯氧基丙二醇、1,3-丁二醇、1,2-丁二醇、1,4-丁二醇、2,3-丁二醇、1,2-己二醇、乙二醇、3-氧杂戊-1,5-二醇以及上述物质的混合物。优选地，选用1,3-丙二醇、1,2-丙二醇、1,3-丁二醇或这些溶剂的混合物。进一步优选采用1,3-丙二醇。
[0044]
根据本发明的优选实施方案，步骤(ii/b)中的热处理的温度为约45℃至约55℃、优选约50℃。
[0045]
根据本发明的优选实施方案，步骤(ii/b)中的热处理的持续时间为约20小时至约30小时、优选约24小时。
[0046]
根据本发明的优选实施方案，步骤(iii)中的热处理的温度为约65℃至约75℃、优选约70℃。
[0047]
根据本发明的优选实施方案，步骤(iii)中的热处理的持续时间为约1小时30分钟至约2小时30分钟、优选约2小时。
[0048]
根据本发明的优选实施方案，步骤(iv)中调节ph至约4.5。
[0049]
根据本发明的优选实施方案，步骤(v)中折合为其干提取物的水解物的含量为约
2％。
[0050]
作为本发明的第一目的的说明性实例，根据包括以下步骤的方法制备对目标黄酮苷元进行富集并标准化的黄芩属植物根部水解物：
[0051]
(i)通过机械搅拌将25g磨碎的黄芩根悬浮在100g水中，以激活其内源性β-糖苷酶；
[0052]
(ii)加入75g 1,3-丙二醇，然后将反应介质置于50℃的温度下24小时，对分散物进行酶水解；
[0053]
(iii)加入350g 1,3-丙二醇，然后将反应介质置于70℃的温度下2小时，然后在冷却至室温后过滤，以获得澄清滤液；
[0054]
(iv)向反应介质中加入几滴6n hcl，以重新调节反应介质ph至4.5；
[0055]
(v)用94g 1,3-丙二醇调节粗水解物的质量，以保证折合为其干提取物的水解物的含量为2％，并在搅拌后最终获得526g对汉黄芩素和黄芩素进行富集并标准化的澄清的水解物，在以下配方和活性试验中，将其称为“黄芩根水解物(批号37582)”，其中包含或显示出下述条件：
[0056]-0.87mg/g(即3.1mm)的汉黄芩素；
[0057]-3.43mg/g(即12.7mm)的黄芩素；
[0058]-汉黄芩素与黄芩素的重量比为0.25；
[0059]-不可检出量的黄芩苷，至少低于50ppm(即0.05mg/g)；
[0060]-不可检出量的汉黄芩苷，至少低于50ppm(即0.05mg/g)；
[0061]-一定量的溶解汉黄芩素，其回收率为87％；
[0062]-一定量的溶解黄芩素，其回收率为65％；
[0063]-汉黄芩素的富集因子接近6(5.8)；
[0064]-黄芩素富集因子接近10(9.8)。
[0065]
本发明还涉及能够通过上述方法得到的对汉黄芩素和黄芩素进行富集并标准化的黄芩属植物根部水解物。
[0066]
根据本发明的另一个目的是根据本发明所述方法得到的对汉黄芩素和黄芩素进行富集并标准化的黄芩属植物根部水解物在化妆品或皮肤学级化妆品方面的应用，原因在于所述水解物除了具有与未水解的提取物相比更优异的表现以外(参见以下试验3)，还表现出其他有益于皮肤的反应，如以下试验所示：
[0067]-保护皮肤成纤维细胞避免其进入应激状况诱导的早熟性衰老状态的能力，这是由于所述水解物对这种状态的皮肤水解酶标志物——sa-β-半乳糖苷酶(与衰老相关的β-半乳糖苷酶类)的活性具有抑制作用(参见以下试验4)；
[0068]-保护皮肤成纤维细胞避免其进入应激状况诱导的早熟性衰老状态的能力，这是由于所述水解物对细胞的还原能力会过度刺激其内源性谷胱甘肽的合成以对抗所述应激状况(参见以下试验5)；
[0069]-保护皮肤成纤维细胞避免其进入应激状况诱导的早熟性衰老状态的能力，这是由于所述水解物对活性氧物质的产生具有抗氧化作用(参见以下试验6)；
[0070]-保护皮肤成纤维细胞避免其进入应激状况诱导的早熟性衰老状态的能力，这是由于所述水解物对外泌体的分泌(与细胞衰老相关的分泌表型)具有抑制作用(参见以下试
验7)。
[0071]“皮肤学级化妆品”是指同时具有化妆品作用和皮肤学作用。
[0072]
根据本发明的优选实施方案，特别是由于其抗氧化性质，可根据本发明的方法得到的对汉黄芩素和黄芩素进行富集并标准化的黄芩属植物根部水解物在化妆品方面的应用涉及维持皮肤表面微生物的内稳态。
[0073]
根据本发明的另一优选实施方案，可根据本发明的方法得到的对汉黄芩素和黄芩素进行富集并标准化的黄芩属植物根部水解物在(皮肤学级)化妆品方面的应用涉及防止或对抗可见光辐射作用(vis：波长400-700nm)、尤其是对抗蓝光(波长380-470nm)，尤其涉及其对蓝光诱导的基质金属蛋白酶mmp-1的过度产生所起到的抑制作用。
[0074]
本发明的另一优选实施方案涉及可根据本发明的方法得到的对汉黄芩素和黄芩素进行富集并标准化的黄芩属植物根部水解物在(皮肤学级)化妆品方面的应用，其用于防止或对抗由应激压力(例如空气污染、接触化学异物或烟雾环境)引起的皮肤病征。
[0075]
本发明的另一优选实施方案涉及可根据本发明的方法得到的对汉黄芩素和黄芩素进行富集并标准化的黄芩属植物根部水解物在化妆品方面的应用，将其用作皮肤的增强剂(energizing agent)。
[0076]
根据本发明的另一优选实施方案，特别是由于其具有舒缓的功效，根据本发明的方法得到的对汉黄芩素和黄芩素进行富集并标准化的黄芩属植物根部水解物在皮肤学级化妆品方面的应用涉及处置皮肤表面的红肿和其他瘙痒。
[0077]
本发明的另一优选实施方案是根据本发明的方法得到的对汉黄芩素和黄芩素进行富集并标准化的黄芩属植物根部水解物在(皮肤学级)化妆品方面的应用，其用于防止或对抗细胞衰老，特别是对抗与细胞衰老相关的分泌表型的有害影响。
[0078]
本发明的另一优选实施方案是根据本发明的方法得到的对汉黄芩素和黄芩素进行富集并标准化的黄芩属植物根部水解物作为金属蛋白酶mmp-1的抑制剂的应用，特别是用于处置涉及该金属蛋白酶的任何病理状态或紊乱。
[0079]
最后，本发明的最后一个目的涉及一种用于化妆品或皮肤学级化妆品方面的组合物，其包含如上所述的对汉黄芩素和黄芩素进行富集并标准化的黄芩属植物根部水解物作为主要活性成分，并与一种或多种与皮肤或其附属物生理相容的助剂相结合。
[0080]
优选地，在所述组合物中，上述对汉黄芩素和黄芩素进行富集并标准化的黄芩属植物根部水解物的量是组合物总重量的0.05重量％至5重量％、优选0.5重量％至2.5重量％。
[0081]
根据本发明的组合物适用于皮肤局部施用的方式，并以通常用于这种施用方式的所有形式呈现。仅出于说明性的、而非限制性的目的，所述组合物可以是悬浮液、涂液、乳霜、水性或水醇凝胶、粉末和多重乳液(可任选为微乳液或纳米乳液)等形式。
[0082]
根据本发明的组合物可包含至少一种本领域技术人员已知的、且在化妆品或皮肤学级化妆品领域可接受的、生理学上可接受的助剂，该助剂选自油、蜡、硅酮弹性体、表面活性剂、共表面活性剂、增稠剂和/或胶凝剂、保湿剂、润肤剂、有机或无机防晒剂、光稳定剂、防腐剂、着剂、消光剂、张力剂、螯合剂、香料等和上述物质的混合物。
[0083]
根据本发明的组合物还可包含一种或多种额外的活性剂，其可选自但不限于脱糖剂(deglycating agent)、刺激胶原或弹性蛋白合成或防止其降解的试剂、刺激糖胺聚糖或
蛋白聚糖合成或防止其降解的试剂、促进细胞增殖的制剂、促着剂、抗氧化剂或抗自由基或抗污染剂、保湿剂、导出剂(draining agent)或解毒剂、抗炎剂、脱皮剂、舒缓剂和/或抗刺激剂、作用于微循环(抗黑眼圈)的试剂、增强皮肤防御系统的试剂、有利于增强屏障功能的制剂、刺激细胞代谢(细胞生长、产生对皮肤有用的生物分子、如胶原蛋白)的试剂、对抗心理应激产生的有害影响的试剂、分子伴侣(molecular chaperone)、限制与皮脂过度产生相关的不利影响的试剂、针对某些皮肤病理(比如特应性皮炎、酒渣鼻、愈合障碍)的试剂以及上述物质的组合。
[0084]
非常特别地，在根据本发明的应用和组合物中，可根据本发明的方法得到的对汉黄芩素和黄芩素进行富集并标准化的黄芩属植物根部水解物是碾碎的黄芩根的水解物。
[0085]
在下文中，仅以说明性的方式，通过本发明所述组合物的以下实施例对本发明进行说明，本发明所述组合物包含对前述代谢物进行富集并标准化的黄芩属植物根部水解物。
[0086]
配方a(乳霜)
[0087]
(重量百分比)
[0088][0089]
配方b(凝胶)
[0090]
(重量百分比)
[0091][0092]
仅作为说明性的方式，还通过之前在本发明的说明书中提到的以下试验(试验1至
7)，在下文中对本发明进行说明。
[0093]
对人类进行的体内研究的初步结果也可以说明根据本发明对汉黄芩素和黄芩素进行富集并标准化的黄芩根水解物在皮肤方面的用途。
[0094]
试验1：筛选和测定能够限制il-6型促炎细胞因子分泌的试剂中汉黄芩素与黄芩素的重量比
[0095]
在实验中，对从一名17岁女性患者的乳房整形术中分离出的原代人成纤维细胞(正常人皮肤成纤维细胞缩写为“nhdf”)进行了试验。将这些nhdf在完全dmem培养基(含有4.5g/l葡萄糖和10％胎牛血清(svf/fcs))中进行培养，然后在37℃和10％co2的环境中进行保存。在d-2天，成纤维细胞以1
×
104细胞/cm2的密度接种到6孔板中。在d0天，成纤维细胞受到诱导早熟性衰老的应激压力(150mm过氧化氢(h2o2)，2小时)，然后在37℃和10％co2的环境中孵育72小时，以稳定衰老。在d+3天，这些由所述应激压力诱导的衰老成纤维细胞(“应激诱导的早熟性衰老成纤维细胞”缩写为“sips-fibro”)在合成来源的不同重量比的汉黄芩素与黄芩素(缩写为“w/b”)存在下孵育24小时。在d+4天，收集培养物上清液，以对促炎细胞因子il-6进行elisa测定(“r amp;d system kit,ref.d6050”)。然后，将所得结果根据每种条件下的细胞数量进行标准化，并进行平行三份的统计分析。结果如下表1所示，特别地，用相对于衰老对照组的抑制il-6分泌的百分比进行表示。
[0096]
表1
[0097][0098]
结果表明，在过氧化氢应激诱导的衰老状态下，汉黄芩素与黄芩素的比值0.2和0.4(主要是比值0.2)是限制成纤维细胞中il-6分泌的两个最有效的重量比。
[0099]
试验2：对本发明所述黄芩水解物在加速老化条件下的稳定性的研究，并在28天的时间内观察其物理化学和感官特性
[0100]
在实验中，将干物质含量为2％、在ph 4.5的条件下稳定的本发明所述黄芩根水解物(批号37582)两份各5g置于两个装有接头塞的玻璃管中。然后将这些玻璃管在+43℃的烘箱中放置28天。定期监测以下参数：外观、ph、汉黄芩素和黄芩素的hplc分析。结果如下表2所示。
[0101]
表2
[0102][0103]
在28天研究结束时(d
28
)，表2中的结果表明，本发明所述黄芩水解物的物理化学和感官特性不受影响，外观和颜不变，且汉黄芩素和黄芩素的水平恒定。
[0104]
试验3：测定和比较本发明所述黄芩水解物和非水解黄芩提取物在限制参与皮肤细胞外基质蛋白水解的金属蛋白酶mmp-1的过表达方面的能力
[0105]
在实验中，除了在本例中使用金属蛋白酶mmp-1(“abcam kit,ref.abl00603”)进行elisa测定外，在与上述试验1相同的条件下进行试验。同样，将所得结果根据每种条件下的细胞数量进行标准化，并进行平行三份的统计分析。结果如下表3所示，特别地，用相对于衰老对照组的抑制mmp-1分泌的百分比进行表示。这样，使得能够在相同浓度下比较根据本发明的黄芩根水解物(批号37582)和上述“天然提取物”(即在其组成中具有以下含量的非水解提取物(批号37377)：1228ppm的汉黄芩苷(即1.22mg/g)、153ppm的汉黄芩素(即0.15mg/g)、5120ppm的黄芩苷(即5.12mg/g)和358ppm的黄芩素(即0.35mg/g))之间的生物学表现。
[0106]
表3
[0107][0108]
表3中的结果表明，根据本发明的黄芩水解物与同一植物的天然提取物所观察到的结果相比具有明显更优的、甚至是完全相反的生物学表现。事实上，根据本发明的黄芩水解物(对汉黄芩素和黄芩素进行富集并对这两种代谢物进行标准化，汉黄芩素与黄芩素的重量比为0.25)表现出部分抑制皮肤金属蛋白酶(其对于皮肤具有不利的蛋白水解作用)分泌的能力，而未水解的提取物在相同的浓度下表现为对所述金属蛋白酶分泌的轻微促进剂。
[0109]
试验4：测定和证明根据本发明的黄芩水解物抑制sa-β半乳糖苷酶活性的能力
[0110]
在实验中，对从一名17岁患者的乳房整形术中分离出的原代人成纤维细胞(正常人皮肤成纤维细胞缩写为“nhdf”)进行了试验。将这些nhdf在完全dmem培养基(含有4.5g/l
葡萄糖和10％fcs)中进行培养，然后在37℃和10％co2的环境中进行保存。在d-2天，将成纤维细胞以1
×
104细胞/cm2的密度接种到6孔板中。在d0天，成纤维细胞受到诱导早熟性衰老的应激压力(150mm过氧化氢(h2o2)，2小时)，然后在37℃和10％co2的环境中、存在或不存在根据本发明的黄芩水解物(批号37582)的情况下孵育72小时。在d+3天，使用c12fdg探针(“invitrogen,ref.d2893”)通过流式细胞术测量sa-β-半乳糖苷酶的活性，并将衰老对照组的结果作为100％sa-β-半乳糖苷酶活性的对照。然后，将所得结果进行平行三份的统计分析，结果如下表4所示。
[0111]
表4
[0112][0113]
表4中的结果表明，根据本发明的黄芩水解物具有以剂量依赖性的方式降低sa-β-半乳糖苷酶活性的能力，此外，当使用不常见的极低浓度的水解物(0.05％)时，仍表现出显著的结果(-38％)。
[0114]
试验5：测定和证明根据本发明的黄芩水解物与谷胱甘肽的表达发生相互作用的能力
[0115]
在实验中，对从一名17岁患者的乳房整形术中分离出的nhdf原代人成纤维细胞进行了试验。将这些nhdf在补充有4.5g/l葡萄糖和10％fcs的dmem培养基中进行培养，然后在37℃和10％co2的环境中进行保存。在d-2天，将成纤维细胞以3000细胞/cm2(对照条件)和8000细胞/cm2(衰老条件)的密度接种在150cm2孔的瓶中。在d0天，nhdf受到诱导早熟性衰老的应激压力(150mm过氧化氢(h2o2)，2小时)，然后在37℃和10％co2的环境中、存在或不存在根据本发明的黄芩水解物(批号37582)的情况下孵育72小时。在d+3天，通过对瓶进行刮取来回收细胞，然后对细胞进行离心。之后，将干颗粒冷冻在干冰中，以便使用“safas-xenius”型分光光度仪通过荧光分光光度法进行分析。结果如下表5所示。
[0116]
表5
[0117]
[0118]
表5中的结果表明，根据本发明的黄芩水解物通过使成纤维细胞较少刺激其内源的保护性谷胱甘肽的合成或再生，能够减少应激压力对成纤维细胞的影响。
[0119]
试验6：测定和证明根据本发明的黄芩水解物限制细胞质ros产生的能力
[0120]
在实验中，对从一名17岁患者的乳房整形术中分离出的nhdf原代人成纤维细胞进行了试验。将这些nhdf在补充有4.5g/l葡萄糖和10％fcs的dmem培养基中进行培养，然后在37℃和10％co2的环境中进行保存。在d-2天，将成纤维细胞以1
×
104细胞/cm2的密度接种到6孔板中。在d0天，nhdf受到诱导早熟性衰老的应激压力(150mm过氧化氢(h2o2)，2小时)，然后在37℃和10％co2的环境中孵育72小时，以稳定衰老。在d+3天，这些由所述应激压力诱导的衰老成纤维细胞(“应激诱导的早熟性衰老成纤维细胞”缩写为“sips-fibro”)在存在或不存在根据本发明的黄芩水解物(批号37582)的情况下孵育24小时。在d+4天，通过流式细胞术(参比探针：cmh2dcfda)用荧光标记物对细胞的细胞质中存在的活性氧物质(以下称为“细胞质ros”)进行测定。结果如下表6所示。
[0121]
表6
[0122][0123]
表6中的结果表明，根据本发明的黄芩水解物具有以剂量依赖性的方式减少衰老细胞产生细胞内氧化物质(细胞质ros)的能力。
[0124]
试验7：测定和证明根据本发明的黄芩水解物限制外泌体分泌的能力
[0125]
在实验中，除了在本例中将成纤维细胞以8000细胞/cm2的密度接种在150cm2孔的瓶中以外，在与上述试验6相同的条件下进行试验。在d+4天，这些由相同应激压力诱导的衰老成纤维细胞(“应激诱导的早熟性衰老成纤维细胞”缩写为“sips-fibro”)在存在或不存在根据本发明的黄芩水解物(批号37582)的情况下孵育48小时。在d+6天，从上清液中分离得到外泌体，并使用“sbi kit,ref.exocet96a-1”进行定量测定。以相同的方式将所得结果根据相同细胞数量进行标准化。结果如下表7所示，特别地，用相对于衰老对照组的抑制外泌体分泌的百分比进行表示。
[0126]
表7
[0127]
[0128]
表7中的结果表明，根据本发明的黄芩水解物具有减少衰老细胞分泌外泌体的能力。
