一种生物碱化合物及其应用的制作方法
1.本发明属生物医药和食品技术领域，具体涉及一种从冠突散囊菌中提取分离的化合物及其在制备脂肪肝疾病药物、或者具有缓解脂肪肝的功能食品中的应用。
背景技术：
2.微生物在药物开发中发挥了十分重要的作用，如青霉素、链霉素、阿维菌素、洛伐他汀等等。从1928年弗莱明发现青霉素开始，青霉素作为一种救命药物进入了人类的生活，第二次世界大战，青霉素实现了产业化，人们利用遗传学方法不断改进培养基和发酵条件，使微生物按着人们要求的合成路线大量地生产青霉素。微生物为人类的健康和药物的开发做出了重要的贡献。
3.非酒精性脂肪肝是一种无过量饮酒史、肝实质细胞脂肪变性和脂肪堆积为特征的临床病理综合征。它与高血脂症及胰岛素抵抗密切相关，可进一步发展为脂肪性肝炎、肝硬化和肝细胞癌等。目前为止还没有批准非酒精性脂肪肝的药物，该领域药物研发工作十分活跃，具有广阔的应用前景。
4.茯砖茶属于六大茶类中黑茶的一种，在微生物的作用下，这种发酵茶发生了深度的生理生化变化，从而形成了独特的风味。
技术实现要素：
5.本发明从冠突散囊菌中提取分离出一种生物碱性化合物，其在制备脂肪肝疾病药物，或具有缓解脂肪肝的功能食品。
6.本发明首先提供一种化合物，其结构式如下；。
7.进而，本发明还提供所述化合物及其类似物、衍生物、前药、代谢物及其活性盐,其中代表性的酸加成盐包括但不限于乙酸盐、己二酸盐、海藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、二葡糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、富马酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐(异硫代硫酸盐，isothionate)、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、 2-萘磺酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、盐、新戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、磷酸盐、谷氨酸盐、碳酸氢盐、对甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。同样，碱性含氮基团可用以下物质季铵化：低级烷基卤化物如甲基、乙基、丙基和丁基的氯化物、溴化物和碘化
物；硫酸二烷基酯如硫酸二甲酯、二乙酯、二丁酯和二戊酯；长链卤化物如癸基、十二烷基、十四烷基和十八烷基的氯化物、溴化物和碘化物；芳基烷基卤化物如苄基溴和苯乙基溴等。
8.可将本发明的化合物形成药学上可接受的酸加成盐的酸实例包括无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸，以及有机酸如草酸、马来酸、琥珀酸和柠檬酸。
9.本发明提供的化合物及其类似物、衍生物、前药、代谢物及其活性盐在制备脂肪肝疾病药物、以及作为食品添加剂用于开发缓解脂肪肝以制备功能食品中的应用。
10.本发明还提供冠突散囊菌（eurotium cristatum）sxhbtbu1934，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：cgmcc no.21026。
11.进一步提供利用所述的冠突散囊菌（eurotium cristatum）sxhbtbu1934制备如下式化合物的方法，将所述的冠突散囊菌发酵培养，在发酵产物中提取所述化合物：。
12.优选地，将所述的冠突散囊菌（eurotium cristatum）sxhbtbu1934接种到灭菌的含有茶叶、大米、玉米、糙米、小麦、橘子皮、柚子皮的培养基上，在25-32
°
c静置发酵培养7-30天；然后在发酵产物中提取所述化合物。
13.更具体地，取发酵后的产物用乙醇浸泡过夜，抽滤后用旋转蒸发仪蒸干，再用乙酸乙酯：去离子水进行萃取，萃取三次得到有机层继续蒸干，称重后溶解到二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中，以重量比为发酵粗提物：柱层析硅胶（100-200目）=1：1.3—1.7拌样品，进行减压柱层析分离；柱层析用正己烷、二氯甲烷不同配比的有机溶剂体系洗脱，体积比为2:98的正己烷:二氯甲烷，获得样品；利用凝胶sephadex lh-20柱谱进行分离，洗脱剂为正己烷：二氯己烷（体积比为2：1），得到馏分3；优选地，还利用反相高效液相谱进行纯化，谱柱为agilent反相c18谱柱，流动相为40%乙腈的水溶液-100%乙腈（时间为20分钟），得到纯的所述化合物。
14.附图说明
15.图1 基于钙调蛋白基因序列构建的系统发育树。
16.图2是化合物的反相高效液相谱图。
17.图3是化合物的质谱图。
18.图4是化合物的核磁共振氢谱图。
19.图5是化合物的核磁共振碳谱图。
20.图6化合物在hepg2细胞模型中对脂质堆积的半抑制浓度。
21.生物材料保藏信息：本发明中的冠突散囊菌（eurotium cristatum）sxhbtbu1934，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为cgmcc，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中科院微生物研究所，保藏时间为：2020年12月21日，保藏号为：cgmcc no.21026。
22.具体实施方式
23.下面通过具体实施例来进一步阐述本发明，以期对本发明有更好的理解，但并不构成对本发明的限制。
24.实施例11.真菌的分离根据文献（杨瑞娟，王桥美，彭文书，季爱兵，张文杰，严亮，8 种市售“金花”茶中微生物的分离鉴定，热带农业科学，2019,39（10），81-88）的方法，从陕西省西安市新咸西区市售茯茶中分离到冠突散囊菌（eurotium cristatum）sxhbtbu1934。
25.具体过程如下：菌株分离：分离菌株的来源：所用茯砖茶购买于陕西省西安市新咸西区市场。
26.采用的培养基：麦芽提取物琼脂培养基（mea，每升培养基）：麦芽浸粉（malt extract）30. 0 g，蛋白胨（peptone）5. 0 g，琼脂（agar）15. 0 g， ph 6.0；沙氏葡萄糖琼脂培养基（sda，每升培养基）：蛋白胨（peptone）5. 0 g，胰蛋白胨（tryptone），葡萄糖（glucose）40. 0 g，琼脂（agar）15. 0 g，ph 4.0
ꢀ‑ꢀ
6.0（调到6.0就行，不能太低）；培养基灭菌放置不烫手背时（温度约为40
°
c左右），同时加入氯霉素和链霉素至终浓度为0.2 mg/ml（提前配置好，用0.22
µ
m微孔滤膜过滤，-20℃存储），混匀后倒平板，用于抑制细菌生长。
27.分离方法：称取10g茯砖茶，加入100ml无菌水，浸泡10分钟，震摇使茶叶分散开。取200 μl的悬液（3个稀释度10-3
、10-4
、10-5
），涂布在分离培养基mea和sda上，倒置于28
°
c培养。培养第二天后，观察平板真菌菌落出菌情况，并及时挑出，随后每天观察一次，出现新真菌菌落及时挑取。
28.菌株鉴定：菌株在mea平皿培养基上培养7天后，菌落近似于圆形，中心有凸起，呈现棕褐，颜从中心向外颜变浅，由褐变为棕、金黄到浅黄，菌落有少量液滴渗出，菌丝向四周延伸，菌丝形态明显，边缘较为整齐；菌落背面光滑无脊，随着培养时间延长，产生的素使培养基呈现黑褐。
29.从生长7天的培养皿上用接种针切取约1
ꢁ
cm2菌体于离心管中，加入800
ꢁ
μl dna提取试剂，加入一颗钢珠（便于细胞破碎），将离心管对称置于scientz-48高通量组织研磨器中，破碎菌体细胞，获得待测菌株基因组dna,并对其进行pcr扩增。采用真菌通用引物mdad1
（5
’‑
gccgactctttgactgaagagc-3’）和cmdq1（5
’‑
gcatcatgagctggacgaattc-3’）扩增钙调蛋白基因序列。
30.pcr扩增体系（50
ꢁ
μl）：10
×
buffer 5
ꢁ
μl，2.5 mmdntp5
ꢁ
μl，25mm mgcl25
ꢁ
μl，模板dna 5
ꢁ
μl，引物its4和its5各0.5
ꢁ
μl，taq dna聚合酶0.5
ꢁ
μl，ddh2o34.5
ꢁ
μl。反应程序：94
ꢁ
℃预变性4 min，94
ꢁ
℃变性1
ꢁ
min，55 ℃退火4 min，72
ꢁ
℃延伸1.5 min，共37个循环，72
ꢁ
℃延伸10 min，最后于25
ꢁ
℃下保存。
31.菌株钙调蛋白基因序列与nrrl4222相似度为100%，因此鉴定菌种为冠突散囊菌（eurotium cristatum），根据钙调蛋白基因序列进行构建系统发育树如图1所示。该菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：cgmcc no.21026，保藏时间为：2020年12月21日。
32.真菌的发酵培养将经活化的冠突散囊菌制成孢子悬浮液，再接种到灭菌的茶叶（茶叶重量30%蒸馏水）、大米（加大米重量100%的蒸馏水）、玉米（加玉米重量100%的蒸馏水）、糙米（加糙米重量100%的蒸馏水）、小麦（加小麦重量100%的蒸馏水）、橘子皮（加橘子皮重量40%的蒸馏水）、柚子皮（加柚子皮重量40%的蒸馏水）等任何适合冠突散囊菌生长的培养基上，在25-32
°
c（本实施例中28
°
c）静置发酵培养7-30天（本实施例中培养19天）。
33.活性化合物的制备发酵后的产物利用甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷、乙醚、超临界萃取等方法（但不限于以上方法）进行提取，获得提取物。
34.具体方法如下：上述茶叶、大米、玉米、糙米、小麦、橘子皮、柚子皮等培养基上发酵7-30天（本实施例中培养19天）。各种培养基都用液相谱分析过，都产这个化合物发酵产物（包括菌和培养基）加入乙醇浸泡过夜，抽滤后用旋转蒸发仪蒸干，再用乙酸乙酯：去离子水=1：1进行萃取，萃取三次得到有机层继续蒸干，称重后溶解到二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中，以重量比为发酵粗提物：柱层析硅胶（100-200目）=1：1.5拌样品，待有机溶剂挥干后进行减压柱层析分离。
35.柱层析用正己烷、二氯甲烷不同配比的有机溶剂体系洗脱，体积比分别为100%正己烷（馏分1）、1:99（正己烷:二氯甲烷，获得样品a，馏分2）、2:98（正己烷:二氯甲烷，获得样品，馏分3）、3:97（正己烷:二氯甲烷，获得样品，馏分4）、4:96（正己烷:二氯甲烷，获得样品，馏分5）、5:95（正己烷:二氯甲烷，获得样品，馏分6）、6:94（正己烷:二氯甲烷，获得样品，馏分7）、8:92（正己烷:二氯甲烷，获得样品，馏分8）、10:90（正己烷:二氯甲烷，获得样品，馏分9）进行洗脱，得到极性从小到大的8个馏分。
36.样品b利用凝胶sephadex lh-20柱谱进行分离，洗脱剂为正己烷：二氯己烷（体积比为2：1），每10ml收集1个馏分，根据高效液相谱分析结果进行合并后，得到5个馏分。
37.其中馏分3利用反相高效液相谱进行纯化，谱柱为agilent反相c18谱柱，流动相为40%乙腈的水溶液-100%乙腈（时间为20分钟），得到一种化合物。
38.化合物的结构鉴定采用hplc对制得的该化合物进行纯度鉴定（图2），纯度大于98%的样品利用质谱和核磁共振技术进行结构鉴定，核磁共振用bruker avance drx-500核磁共振仪测定；质谱利用沃特世waters g2-xs质谱仪测定。
39.该目标化合物的质谱图见图3，其正离子模式的高分辨准分子离子峰为[m+h]
+
m/z408.2289。
[0040]
该目标化合物的核磁共振氢谱图如图4，具体数据δh(cdcl3) ：9.65 (s)，7.47 (s)，7.22 (s)，7.19 (d, j = 8.0 hz)，7.08 (dd, j = 8.0, 8.0 hz)，6.99 (d, j = 8.0 hz)，6.48 (d, j = 12.5 hz)，6.07, (dd, j = 17.5, 10.5 hz)，5.17 (d, j = 10.5 hz)，5.15 (d, j = 17.5 hz)，4.1129 (m)，3.24 (d, j= 14.5 hz)，3.01 (d, j= 4.5 hz)，2.92 (m)，1.60 (d, j= 7.0 hz)，1.55 (s, )，1.51 (s)，1.40 (s)。
[0041]
该目标化合物的核磁共振碳谱图如图5，具体数据δ
c (cdcl3) ：19.2，21，25，27.5，27.5，29.8，33.7，39.3，51.8，60.4，64.4，103.2，112.7，112.9，117.8，121.1，122.2，122.7，124，126.3，134.2，144.3，144.6，160.1，165.8；最终确定该目标化合物的分子结构式如下：。
[0042]
4.化合物在hepg2模型上对脂肪累计的影响体外脂肪变性细胞模型因其影响因素少、实验条件可控而得到广泛应用于非酒精性脂肪肝病变过程中的肝细胞脂质沉积，多以肝癌细胞株hepg2为研究对象，通过施加不同比例、浓度的油酸和棕榈酸混合物诱导建造模型。肝内脂质沉积及脂肪变性是指肝细胞内甘油三酯过量堆积，因此肝细胞内脂质堆积情况为评价抗非酒精性脂肪肝活性较敏感的指标。
[0043]
本实验为在体外模拟非酒精性脂肪肝病发生过程，采用油酸（oa）诱导人肝癌hepg2细胞建立非酒精性脂肪肝细胞模型。应用bodipy荧光法检测化合物对hepg2细胞内脂质堆积的影响，同时采用比法测定化合物对细胞活性的影响，从而评价化合物的抗非酒精性脂肪肝活性。
[0044]
hepg2细胞常规培养方式，即用含10%胎牛血清、双抗(100 u/ml青霉素与100 u/ml链霉素)的dmem培养基，置于37
ꢀ°
c、5% co2培养箱中培养。当细胞密度达到80%时，以1: 3的比例传代培养。当细胞呈对数增长时铺板，细胞96孔铺板（每孔100
µ
g），37℃，过夜培养。
[0045]
细胞培养过夜后，弃去上清，加入含0.25mm油酸的培养液（90
µ
g）孵育24h，造模成功后模型组换成常规细胞培养液。
[0046]
给药组：油酸诱导成功的模型组加入不同浓度待测化合物10μl/孔（浓度分别为：0.0001
µ
g/ml，0.001
µ
g/ml，0.01
µ
g/ml，0.1
µ
g/ml，1
µ
g/ml，10
µ
g/ml，100
µ
g/ml，1000
µ
g/ml），孵育24 h。
[0047]
正常对照组（未用油酸诱导的细胞）和模型对照组（油酸诱导成功的模型组不加药物作为对照组）加入生理盐水10μl/孔。
[0048]
油红o染方法如下：细胞给药培养24h后弃去上清，用pbs缓冲液清洗2-3次，加入4%多聚甲醛溶液固定15-20 min。弃去固定液，加入油红o工作液50 μl/孔，室温放置1 h。弃去染液，用pbs清洗3-5次，洗去多余的杂质和沉淀。显微镜下观察hepg2细胞形态及脂滴分
布情况，并拍照记录实验结果。
[0049]
计算方法：抑制率（%）=实验结果如图6所示。经计算，化合物在hepg2细胞模型中对脂质堆积的半抑制浓度ic
50
为0.052
µ
g/ml。
[0050]
因此，本发明从冠突散囊菌中提取分离出一种生物碱性类的新结构化合物，该化合物在体外细胞模型中降低了hepg2细胞内脂质沉积，可用于开发非酒精性脂肪肝疾病药物。
