一种膜蛋白原位合成亲和生物谱柱及其制备方法和应用
1.本发明涉及生物谱领域，具体地说，是一种采用cell-free蛋白表达和共价固定化亲和谱技术，建立新的原位合成膜蛋白亲和谱方法。
背景技术：
2.膜蛋白负责外部物质和信息的交换，并行使细胞间接触、表面识别、信号转导、酶活性和转运等多种功能，是目前最有潜力的潜在药物靶点体。据估计，60％的药物靶标是膜蛋白。但由于膜蛋白的丰度低、结构复杂，基于膜蛋白的药物发现相对困难。至今，只有1％具有三维结构的蛋白被成功解析。体外纯化和模拟天然构象是靶向膜蛋白的药物筛选与配体相互作用分析的瓶颈。
3.脂质双分子层环境是膜蛋白维持其天然构象和生理活性所必需的。膜蛋白生物谱技术，如细胞膜谱(cmc)和细胞膜亲和谱(cmac)被广泛应用于膜蛋白的研究中。cmc直接提取细胞膜固定在硅胶上作为谱固定相，是筛选膜受体活性成分的有效方法。将固定相修饰技术和蛋白过表达策略与cmc相结合，可以实现针对特定蛋白的特异性筛选。cmac直接从细胞膜获得靶标膜蛋白或随后重组到固定化人工膜中，将其固定在固定相上，已广泛应用于药物发现过程的多个阶段。近年来，含有靶蛋白的cmac柱已被扩展到表征候选先导药物与靶蛋白结合的类型以及结合过程。然而，cmc或cmac发展至今仍存在一些局限性：1.直接获取细胞膜作为膜蛋白来源，蛋白的特异性和丰度低，不利于对膜蛋白亲和成分的准确筛选和相互作用分析；2.在细胞膜或重构的蛋白-脂质结构固定到固定相载体上的过程中，膜蛋白的朝向是随机的，活性结合位点的暴露是不可控的；3.制备足够数量的重组膜蛋白是一项昂贵、繁琐且耗时的工作。
4.cell-free表达(cfe)技术为膜蛋白的表达提供了一个理想的途径。其原理是以靶蛋白的dna或mrna为模板，在细胞提取物氨基酸、rna聚合酶和能量物质的存在下，实现蛋白的体外表达。cfe突破了活细胞的生理限制，大大提高了蛋白合成的效率和产量，同时减少了蛋白的错误折叠和聚集。cfe特别适合应用于膜蛋白的合成，通过在表达系统中提供人工仿生膜，膜蛋白可以在合成过程中直接表达、共翻译并插入到磷脂膜中。更重要的是，可以观察到该蛋白质在合成过程中在仿生膜上呈现矢量插入。cfe已被用于蛋白的高通量表达、蛋白药物的筛选和合成。如蛋白原位阵列可通过cfe快速有效地合成蛋白并应用于芯片上的蛋白-蛋白相互作用网络的研究。cfe是一种实用的方法，可以获得足够多的、朝向一致的功能性膜蛋白。而到目前为止，还没有在硅胶固定相上实现基于cfe制备膜蛋白生物谱固定相。
技术实现要素：
5.本发明的目的在于提供一种新的原位合成膜蛋白亲和生物谱柱及其制备方法和应用。本发明的谱柱结合cell-free表达(cfe)和3-巯基丙基三甲氧基硅烷(mpts)修饰生物亲和谱的优点，实现硅胶-脂质体载体上膜蛋白的原位合成和单向插入。可应用于复
杂体系中靶向特定膜蛋白的潜在活性成分筛选，以及膜蛋白与其配体相互作用的表征。
6.为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
7.本发明的第一方面，提供一种原位合成膜蛋白亲和生物谱柱，所述膜蛋白亲和生物谱柱是在硅胶-脂质体载体上原位合成膜蛋白；其制备方法为：采用mpts修饰硅胶与脂质体真空涡旋混合制备空载固定相，再将膜蛋白的cdna和附着脂质体的硅胶同时加入表达体系中合成膜蛋白，得到膜蛋白插入式固定相；将制备好的固定相装入谱柱中，获得原位合成膜蛋白亲和谱柱。
8.本发明的谱柱综合了cfe和mpts修饰生物亲和谱的优点。首次实现脂质体固定化硅胶载体中膜蛋白的原位合成和单向插入。可应用于靶向膜蛋白的复杂体系活性成分筛选和平衡解离常数的测定，并为膜蛋白固定化亲和谱或其他生物固相材料的快速制备提供新的技术手段。
9.本发明所述的原位合成膜蛋白亲和谱柱无需复杂的细胞培养和蛋白纯化过程，一步可快速制备出含有单一且稳定含量的目标膜蛋白的生物谱固定相。所述的原位合成膜蛋白技术通过在cdna上构建标签，可实现表征膜蛋白在脂质体膜上的单向插入。
10.进一步的，所述的原位合成膜蛋白亲和谱柱的制备方法包含以下步骤：
11.a)二油酰磷脂酰胆碱(dopc)、二油酸磷脂酰乙醇胺(dope)、nbd-二油酰磷脂酰甘油(nbd-dopg)以摩尔比80:20:1溶解于氯仿/甲醇(1:1，v/v)，终浓度为20mg/ml，真空旋蒸；将薄脂膜悬浮于磷酸盐缓冲液，得到20mg/ml的脂质混合物，超声10分钟形成脂质体囊泡，然后用脂质体挤压机挤压形成直径小于100nm的囊泡；
12.b)采用mpts修饰硅胶(使用前120℃活化)与脂质体涡旋混合、4℃过夜孵育制备空载固定相；将膜蛋白的cdna和包裹脂质体的硅胶同时加入表达体系中，在37℃，300rpm振荡下合成膜蛋白；离心并洗涤得到膜蛋白原位合成的生物固定相；
13.c)将制备好的固定相用装柱机装入微柱柱芯中，即得到所述的原位合成膜蛋白亲和生物谱柱。
14.进一步的，所述的膜蛋白为pdgfrβ(血小板衍生生长因子受体β，platelet derived growth factor receptor-β),genebank编号：nm_002609.4。
15.可适用于大部分膜蛋白，例如tgfβr，egfr以及g蛋白偶联受体(gpcrs)家族蛋白等。
16.进一步的，所述的步骤b中3000
×
g离心并洗涤3次得到膜蛋白原位合成的插入式固定相。
17.10.进一步的，所述的步骤c采用sp-403k装柱器对微柱(400μm，i.d)进行填充。更进一步的，是将制备好的固定相5mg溶于500μl pbs中，置于样品瓶中，以15rpm的恒定转速进行磁力搅拌；采用高压氮气作为压力源，在5mpa压力下填充入内径为400μm的毛细管谱柱中。
18.本发明的第二方面，提供一种如上所述的原位合成膜蛋白亲和谱柱在靶向膜蛋白的复杂体系活性成分筛选中的应用。
19.进一步的，所述的膜蛋白为pdgfrβ，所述的活性成分为靶向pdgfrβ逆转肝纤维化的活性化合物。
20.更进一步的，所述的原位合成膜蛋白亲和谱柱在筛选肝纤维化化合物中的
应用。
21.本发明的第三方面，提供一种如上所述的原位合成膜蛋白亲和谱柱在配体与膜蛋白特定区域亲和力测定中的应用。
22.相对于现有技术，本发明优点在于：
23.1、本发明采用cell-free蛋白表达和共价固定化亲和谱技术，构建新的原位合成膜蛋白生物谱柱。本发明制备的谱柱首次实现将单一的具有天然四级结构的膜蛋白单向插入键合脂质体的固定相上。
24.2、原位合成膜蛋白亲和谱柱的制备不需要培养细胞或制备重组蛋白；可快速合成单一的、高纯的、含量稳定可控的膜蛋白；且膜蛋白在固定相上可保持天然的跨膜结构和一致的朝向；灵活的cdna构建为药物结合位点的分析提供了可能性。
25.3、原位合成膜蛋白亲和谱柱可应用于靶向膜蛋白的复杂体系活性成分筛选、配体与膜蛋白特定区域亲和力的测定。
26.4、原位合成膜蛋白亲和谱固定相的制备方法适用于大部分膜蛋白，可应用于靶向膜蛋白的先导化合物筛选和与活性组分间的平衡解离常数测定，可为膜蛋白亲和生物谱或其他生物固定相的快速制备提供一种实用的方法。
附图说明
27.图1为cell-free原位合成膜蛋白pdgfrβ亲和生物谱柱的制备及其应用的模式图。
28.图2为pdgfrβ微柱的有效性、特异性和蛋白朝向的评价结果。其中，a为pdgf-bb和地塞米松在空载柱上的保留行为；b为pdgf-bb和地塞米松在pdgfrβ柱上的保留行为；c为flag和his标签抗体在pdgfrβ柱上的保留行为。
29.图3为pdgfrβ-offline-uplc/ms系统从丹参和五味子提取物中筛选靶向pdgfrβ的亲和组分结果。其中，a为丹参和五味子提取物在pdgfrβ柱上的保留行为谱图；b为丹参和五味子提取物在pdgfrβ柱上有保留和无保留组分的质谱结果；c为丹酚酸b和戈米辛d标准品在pdgfrβ柱的保留行为谱图。
30.图4为丹酚酸b、戈米辛d与pdgfrβ相互作用的亲和力分析结果。其中，a为前沿谱法测定丹酚酸b与pdgfrβ的亲和力结果；b为前沿谱法测定戈米辛d与pdgfrβ的亲和力结果。dxms为地塞米松，sal b为丹酚酸b、gom d为戈米辛d。
具体实施方式
31.下面结合实施例和附图对本发明做进一步详细说明。所述是对本发明的解释而不是限定。
32.实施例1：
33.肝纤维化是肝病终末期许多复杂疾病的基础，也是一个可逆的病理过程。而pdgfrβ是肝纤维化药物发展的重要靶点之一。本发明制备的原位合成膜蛋白亲和谱柱可应用于筛选靶向pdgfrβ逆转肝纤维化的活性化合物，为肝纤维化提供特异性高、疗效好的先导化合物。
34.原位合成pdgfrβ亲和谱柱的制备，包含以下步骤：
35.1)脂质体和质粒的制备
36.25ml烧瓶中，dopc、dope、nbd-dopg以摩尔比80:20:1溶解于氯仿/甲醇(1:1，v/v)，终浓度为20mg/ml。溶剂通过真空蒸馏蒸发。然后将薄脂膜悬浮于磷酸盐缓冲液，得到20mg/ml的脂质混合物，经400w超声作用10分钟形成脂质体囊泡，然后用脂质体挤压器挤压3-4次，形成直径小于100nm的脂质囊泡。
37.构建pdgfrβ质粒。将pdgfrβ克隆到pet28质粒载体，命名为pet28-pdgfrβ，在n端添加flag标签，c端添加融合荧光“cherry”和6his标签。
38.2)原位合成pdgfrβ亲和固定相的制备
39.采用mpts修饰硅胶(使用前120℃活化)与脂质体涡旋混合制备空载固定相，4℃孵育过夜。将构建的pet28-pdgfrβ质粒和硅胶-脂质体同时加入到表达体系中，在37℃、300rpm的摇床振荡条件下合成pdgfrβ。3000
×
g离心并洗涤3次得到pdgfrβ插入式固定相。
40.3)原位合成pdgfrβ亲和生物谱柱的制备
41.采用sp-403k装柱器对微柱(400μm，i.d)进行填充。将制备好的固定相5mg溶于500μl pbs中，置于样品瓶中，以15rpm的恒定转速进行磁力搅拌。采用高压氮气作为压力源，在5mpa压力下填充入内径为400μm的毛细管谱柱中。
42.4)原位合成pdgfrβ亲和谱柱的效果验证
43.本发明选取pdgfrβ细胞外结合的配体pdgf-bb作为阳性对照药物，地塞米松作为阴性对照药物，用于验证原位合成pdgfrβ亲和生物谱柱的有效性与选择性。
44.pdgfrβ微柱搭载于agilent 1200系列，配有微升泵和紫外检测器。流动相为1mm pbs(ph 7.4)，流速10μl/min，柱温37℃。检测波长为210～280nm。进样量为0.1μl。谱数据由chemstation b.04.03收集，并导入origin 8.0制作图。
45.检测结果如图2所示：其中，a为pdgf-bb和地塞米松在空载谱柱上的保留行为；b为pdgf-bb和地塞米松在pdgfrβ柱上的保留行为；c为flag和6his标签抗体在pdgfrβ柱上的保留行为。
46.上述结果表明pdgf-bb在pdgfrβ柱上表现出较强的保留行为，在35.4min时达到峰值，在阴性对照柱上没有保留，而地塞米松在两者上都没有保留；此外，flag标签的抗体保留在pdgfrβ柱上，而6his标签的抗体没有保留。说明表达的pdgfrβ不仅具有识别和结合配体的活性，且呈现n端朝外单向插入脂质双层膜的状态，确保制备的pdgfrβ亲和生物谱柱具有良好的筛选活性。
47.实施例2：
48.到目前为止，大多数开发的pdgfrβ抑制剂是激酶抑制剂，特异性较差。作用于pdgfrβ胞外区配体结合域的药物有望获得更高的特异性和更低的毒性。丹参、五味子是临床具有一定抗肝纤维化作用的中药。本发明制备的原位合成膜蛋白亲和谱柱可应用于从丹参、五味子提取物中筛选靶向pdgfrβ胞外区配体结合域的潜在活性成分。原位合成pdgfrβ亲和谱固定相的制备方法同实施例1。
49.本发明选取丹参和五味子提取物，用于原位合成pdgfrβ亲和谱柱筛选靶向pdgfrβ的抗肝纤维化潜在活性成分的应用。
50.pdgfrβ微柱装载于agilent 1200系列，配有微升泵和紫外检测器。流动相为1mm pbs(ph 7.4)，流速10μl/min，柱温37℃。检测波长为210～280nm。进样量为0.1μl。谱数据
由chemstation b.04.03收集，并导入origin 8.0制作图。
51.每0.5min将丹参和五味子各组分收集到96孔板中，分别收集无保留组分和有保留组分，样品氮气吹干后，用20μl甲醇重新溶解样品，引入agilent 1290uplc-qtof/ms进行分析。谱柱为xbridgetm c18(100
×
2.1mm i.d.，2.5μm，waters，ireland)，流动相为溶剂a(0.1％甲酸)和溶剂b(乙腈)，流速为0.8ml
·
min-1
，采用线性梯度洗脱。
52.检测结果如图3所示：其中，a为丹参和五味子提取物在pdgfrβ柱上的谱结果；b为在pdgfrβ柱上有保留和无保留成分的质谱结果；c为丹酚酸b和戈米辛d标准品在pdgfrβ柱的保留行为谱结果。
53.上述结果表明原位合成pdgfrβ亲和生物谱柱成功应用于丹参和五味子提取物中筛选靶向于pdgfrβ胞外域的潜在活性成分，筛选到的亲和组分分别为丹酚酸b和戈米辛d。
54.实施例3
55.前沿谱主要应用于研究蛋白质与配体之间的相互作用。该方法是将待测化合物配成不同浓度梯度的溶液作为流动相注入生物谱柱中，直至出现突破曲线。化合物与蛋白之间的结合作用表现为达到突破曲线的时间随浓度的降低而增加。如果化合物与蛋白之间不存在特异性结合作用，则无论配体浓度如何，突破时间都保持不变。本发明制备的原位合成膜蛋白亲和生物谱柱可应用于潜在活性成分与pdgfrβ的亲和力测定。原位合成pdgfrβ亲和谱固定相的制备方法和谱分析方法同实施例1和2。
56.本发明选取丹酚酸b和戈米辛d，用原位合成pdgfrβ亲和生物谱柱测定化合物与pdgfrβ相的亲和力大小。
57.将丹酚酸b和戈米辛d溶于dmso至50mm作为储备液，并用pbs稀释至100、50、25、10、5、1μm的梯度浓度，得到谱流动相。微模式下流速为10μl/min。先用1mm的pbs平衡谱柱，然后将一定浓度的化合物的流动相通过谱柱，形成稳定的突破曲线。在两种不同浓度之间，用pbs冲洗系统直至紫外吸收恢复至基线。同时用填充空载固定相的谱柱作为对照柱，以消除非特异性相互作用，获得死时间t0。当非特异性相互作用与特异性相互作用相比可以忽略不计时，捕获的化合物总量(定义为q)和配体浓度(定义为[l])可以形成等式，计算kd值。
[0058]
检测结果如图4所示：其中，a为丹酚酸b在pdgfrβ柱上的前沿谱亲和力测定结果；b为戈米辛d在pdgfrβ柱上的前沿谱亲和力测定结果。
[0059]
上述结果表明丹酚酸b和戈米辛d与pdgfrβ具有典型的单位点相互作用模式，kd值分别为13.44μm和7.39μm。进一步说明原位合成pdgfrβ亲和生物谱柱可提供具有生物活性的朝向一致的pdgfrβ，用于分析化合物与蛋白之间的亲和力大小。
[0060]
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本技术权利要求所限定的范围内。
技术特征：
1.一种原位合成膜蛋白亲和生物谱柱，其特征在于，所述膜蛋白亲和生物谱柱是在硅胶-脂质体载体上原位合成膜蛋白；其制备方法为：采用mpts修饰硅胶与脂质体真空涡旋混合制备空载固定相，再将膜蛋白的cdna和附着脂质体的硅胶同时加入cell-free表达体系中合成膜蛋白，得到膜蛋白插入式固定相；将制备好的固定相装入谱柱中，获得原位合成膜蛋白亲和谱柱。2.根据权利要求1所述的原位合成膜蛋白亲和生物谱柱，其特征在于，所述的原位合成膜蛋白亲和谱柱的制备方法包含以下步骤：a)dopc、dope、nbd-dopg以摩尔比80:20:1溶解于1:1(v/v)的氯仿/甲醇，终浓度为20mg/ml，真空旋蒸；将薄脂膜悬浮于磷酸盐缓冲液，得到20mg/ml的脂质混合物，超声10分钟形成脂质体囊泡，然后用脂质体挤压机挤压形成直径小于100nm的囊泡；b)采用mpts修饰硅胶与脂质体涡旋混合、4℃过夜孵育制备空载固定相；将膜蛋白的cdna和包裹脂质体的硅胶同时加入cell-free表达体系中，在37℃，300rpm振荡下合成膜蛋白；离心并洗涤得到膜蛋白原位合成的生物固定相；c)将制备好的固定相用装柱机装入微柱柱芯中，即得到所述的原位合成膜蛋白亲和生物谱柱。3.根据权利要求1所述的原位合成膜蛋白亲和生物谱柱，其特征在于，所述的膜蛋白为pdgfrβ。4.根据权利要求2所述的原位合成膜蛋白亲和生物谱柱，其特征在于，所述的步骤b中3000
×
g离心并洗涤3次得到膜蛋白原位合成的插入式固定相。5.根据权利要求2所述的原位合成膜蛋白亲和生物谱柱，其特征在于，所述的步骤c采用sp-403k装柱器对微柱(400μm，i.d)进行填充。6.根据权利要求5所述的原位合成膜蛋白亲和生物谱柱，其特征在于，是将制备好的固定相5mg溶于500μl pbs中，置于样品瓶中，以15rpm的恒定转速进行磁力搅拌；采用高压氮气作为压力源，在5mpa压力下填充入内径为400μm的毛细管谱柱中。7.一种如权利要求1所述的原位合成膜蛋白亲和谱柱的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：a)dopc、dope、nbd-dopg以摩尔比80:20:1溶解于1:1(v/v)的氯仿/甲醇，终浓度为20mg/ml，真空旋蒸；将薄脂膜悬浮于磷酸盐缓冲液，得到20mg/ml的脂质混合物，超声10分钟形成脂质体囊泡，然后用脂质体挤压机挤压形成直径小于100nm的囊泡；b)采用mpts修饰硅胶与脂质体涡旋混合、4℃过夜孵育制备空载固定相；将膜蛋白的cdna和包裹脂质体的硅胶同时加入表达体系中，在37℃，300rpm振荡下合成膜蛋白；离心并洗涤得到膜蛋白原位合成的生物固定相；c)将制备好的固定相用装柱机装入微柱柱芯中，即得到所述的原位合成膜蛋白亲和生物谱柱。8.一种如权利要求1-6任一所述的原位合成膜蛋白亲和谱柱在靶向膜蛋白的复杂体系活性成分筛选中的应用。9.一种如权利要求1-6任一所述的原位合成膜蛋白亲和谱柱在配体与膜蛋白特定区域亲和力测定中的应用。
技术总结
本发明涉及生物谱领域，具体是一种原位合成膜蛋白亲和生物谱柱及其制备方法和应用，所述方法采用cell-free蛋白表达和共价固定化亲和谱技术，构建新的原位合成膜蛋白生物谱柱。本发明制备的谱柱首次实现将单一的具有天然四级结构的膜蛋白单向插入键合脂质体的固定相上。本发明不需要培养细胞或制备重组蛋白；可快速合成单一的、高纯的、含量稳定可控的膜蛋白；且膜蛋白在固定相上可保持天然的跨膜结构和一致的朝向；灵活的cDA构建为药物结合位点的分析提供了可能性。本发明可应用于靶向膜蛋白的先导化合物筛选和平衡解离常数测定，为膜蛋白固定化亲和生物谱或其他生物固相材料的快速制备提供一种实用的方法。物固相材料的快速制备提供一种实用的方法。
