一种基于微孔膜的单细胞/单颗粒捕获与分离装置及方法
1.本发明涉及分析化学的微流控领域，特别涉及一种基于微孔膜的单细胞/单颗粒捕获与分离装置及方法。
背景技术：
2.单细胞/单颗粒分析是当前科学前沿研究的热点之一。如何高效生成单细胞/单颗粒液滴阵列是一大挑战。液滴是指一相液体被与其互不相溶的另一相或者多相液体隔离形成的非连续流体。其中，构成液滴，不连续的一相被称为分散相，间隔液滴的液体被称为连续相。在微流控领域，最常见的液滴体系以水溶液为分散相，矿物油或者氟油为连续相，其中的液滴体积通常为皮升至纳升级。目前，已有的单细胞/单颗粒液滴生成技术有基于泊松分布的随机液滴生成技术与基于封闭式微流控芯片的主被动捕获单细胞/单颗粒液滴生成技术。在随机单细胞液滴生成技术中，细胞在液滴中的分布是随机的，因此可能出现空液滴或者多个细胞在同一液滴中；为了尽量避免多细胞液滴出现，通常该方法生成的液滴中平均每个液滴的细胞含量不到0.1个细胞，即仅有少数液滴含有单个细胞，大多数液滴中不含有细胞。主被动单细胞捕获液滴生成技术通常能够确保大多数液滴中均有单个细胞，但该技术通常在封闭式微流控芯片中实现，例如基于quake阀的单细胞液滴生成技术。
3.在传统方法中，通过将细胞自然沉降在培养皿底部，然后利用毛细管探针吸取的方法可以捕获单细胞并生成单细胞液滴。然而，与随机液滴生成技术类似，该方法仍然存在因多个细胞位置接近而同时被吸取，进而产生多细胞液滴的可能性。此外，由于细胞形态多样，该方法通常采用人工判读目标细胞，因而难以实现完全自动化。
技术实现要素：
4.本发明提供了一种基于微孔膜的单细胞/单颗粒捕获与分离装置及方法，可以用于单细胞、单微球、单磁珠等多种单细胞/单颗粒的捕获、分离与单细胞/单颗粒液滴阵列的高通量自动化生成。
5.通过采用微孔膜预先捕获单细胞/单颗粒的方法，本发明解决了传统方法中容易生成多颗粒液滴与自动化困难两个痛点。而通过采用序控液滴阵列(sequential operation droplet array,soda)技术实现单细胞/单颗粒液滴阵列的生成，则不仅实现了单细胞/单颗粒液滴的微型化，使单细胞/单颗粒液滴体积从常规的微升级降低到皮升至纳升级，还实现了单细胞/单颗粒液滴生成的高通量、自动化，使得大规模单细胞/单颗粒液滴阵列的生成成为可能。
6.本发明提供的方案如下：
7.一种基于微孔膜的单细胞/单颗粒捕获与分离装置，包括：用于操作皮升至纳升级的液体超微量液体操作系统；用于捕获单细胞/单颗粒形成单细胞/单颗粒阵列的单细胞/单颗粒阵列化捕获系统；以及用于接纳单细胞/单颗粒的单细胞/单颗粒容器；
8.所述单细胞/单颗粒阵列化捕获系统包括：
9.具有至少一个第一腔室和至少一个第二腔室的液池；
10.设置在液池内将第一腔室和第二腔室分隔开的微孔膜；
11.所述第一腔室和第二腔室具有能够产生压差的位置关系，或者包括能够在第一腔室和第二腔室产生压差的气压控制器。
12.作为优选，所述液体超微量液体操作系统包括：
13.用于吸取、转移或释放(打出)单细胞/单颗粒的毛细管探针；
14.对毛细管探针提供动力的超微量液体泵。
15.本发明通过采用微孔膜预先捕获单细胞/单颗粒，形成单细胞/单颗粒阵列，然后通过毛细管探针吸取单细胞/单颗粒，最后将单细胞/单颗粒注射到单细胞/单颗粒容器中，进而分离单细胞/单颗粒。
16.进一步的，超微量液体泵可以是但不限于注射泵、气动压力泵、蠕动泵、隔膜泵、压电泵、电渗流泵等。优选的，超微量液体泵是注射泵。
17.进一步的，毛细管探针可以由毛细管拉制而成，也可以由注塑工艺批量生产。优选的，毛细管探针由石英毛细管拉制而成。
18.进一步的，毛细管探针尖端孔径在0.1μm～1mm之间。优选的，毛细管探针尖端孔径在1μm～200μm之间。更优选的，根据待转移单细胞/单颗粒尺寸确定适合的毛细管探针尖端孔径。
19.进一步的，微孔膜(4)表面具有规则排列成阵列的微通孔，微通孔直径在0.1μm～1mm之间，孔深度在0.1μm～1mm之间，通孔形状可以是但不仅限于圆柱形、圆台形、方台形与水滴形等。优选的，微通孔直径为1μm～200μm，孔深度为1μm～200μm，通孔形状为圆柱形。
20.进一步的，微孔膜材质可以是但不仅限于su-8光胶、二氧化硅、氮化硅等。
21.进一步的，微孔膜可以但不一定要附着在不锈钢片、硅片等基片上，以提高膜的机械强度。
22.进一步的，微孔膜表面可以经过低吸附处理，能够避免单细胞/单颗粒吸附在微孔膜表面。
23.进一步的，所述液池为上部开口的结构，该液池内壁设有绕内壁设置的支撑件；所述微孔膜四周与所述环形支撑件密封固定；液池中，环形支撑件和微孔膜上方为所述第一腔室，下方为所述第二腔室。
24.进一步的，所述第二腔室内设有液体出口；还包括液流控制器，该控制器具有设置在所述第一腔室内、且沿腔室内壁相对设置的入口a与出入口b。作为优选，所述液流控制器为带有过滤器的隔膜泵。
25.进一步的，所述液池内还包括第三腔室，该第三腔室与所述液体出口连通；当第三腔室为密闭结构时，所述气压控制器可通过调整第三腔室内的压力实现对第一腔室和第二腔室压差的调整。
26.进一步的，液池中装有单细胞/单颗粒载液。液池包含上腔室与下腔室两个腔室，在安装微孔膜后，上、下两个腔室被分隔开来，因而可以在上腔室与下腔室之间形成压强差。
27.进一步的，单细胞/单颗粒容器可以是但不仅限于液滴芯片、标准孔板、塑料离心管、载玻片等容器。优选的，单细胞/单颗粒容器是液滴芯片或标准孔板。
28.一种单细胞/单颗粒捕获与分离方法，利用上述任一项技术方案所述的装置，包括如下步骤：
29.i、在液池中添加空白载液，并安装微孔膜；
30.ii、控制液池的第一腔室(或上腔室)的压强略高于第二腔室(或下腔室)的压强；
31.iii、在液池第一腔室中加入含有单细胞/单颗粒的液体；在第一、第二腔室压强差的驱动下，单细胞/单颗粒流向其附近的微孔膜并被微孔膜捕获，构成单细胞/单颗粒阵列；
32.iv、在第一腔室中产生液流，将未能被微孔膜捕获的单细胞/单颗粒洗去；
33.v、用毛细管探针吸取被微孔膜捕获的单细胞/单颗粒，然后将毛细管探针转移至单细胞/单颗粒容器上方，打出被吸取的单细胞/单颗粒，使单细胞/单颗粒转移至单细胞/单颗粒容器中；
34.vi、重复步骤iv和v，直至将所需的单细胞/单颗粒全部转移至单细胞/单颗粒容器中，完成单细胞/单颗粒捕获与分离。
35.进一步的，在步骤i中，空白载液需浸没微孔膜。
36.进一步的，在步骤ii中，第一腔室(上腔室)与第二腔室(下腔室)之间的压强差的来源可以是但不仅限于液位差、气压差、流动液体产生的压强差等。优选的，第一腔室(上腔室)与第二腔室(下腔室)之间的压强差来源于液位差或气压差。
37.进一步的，在步骤ii中，第一腔室(上腔室)与第二腔室(下腔室)之间的压强差范围为0.001～100000pa。优选的，范围为0.01～10000pa。
38.优选的，在步骤iii中，可以通过轻柔吹打等方式引入一定流体流动，扩展尚未被捕获的单细胞/单颗粒运动范围，从而提高单细胞/单颗粒被微孔膜捕获的概率。
39.进一步的，在步骤iv中，液流的来源可以是但不仅限于移液手动吹打产生的液流与带有过滤器的隔膜泵产生的液流。优选的，液流为带有过滤器的隔膜泵产生的单向液流。
40.进一步的，在步骤v中，毛细管探针吸取微孔膜上的单细胞/单颗粒时，毛细管探针尖端与微孔膜的距离为0～5mm，吸取体积为0～100μl，吸取流速为0～10ml/s；优选的，距离为0～0.5mm，吸取体积为0～10μl，吸取流速为0～1ml/s；更优选的，距离为0～0.1mm，吸取体积为0～1μl，吸取流速为0～100μl/s。
41.进一步的，在步骤v中，毛细管探针打出单细胞/单颗粒时，注射体积为1～200倍吸取体积，注射流速为0～10ml/s；优选的，注射体积为1～50倍吸取体积，注射流速为0～1ml/s；更优选的，注射体积为1～10倍吸取体积，注射流速为0～100μl/s。
42.进一步的，在步骤v中，毛细管探针与单细胞/单颗粒容器之间的相对移动可以由人手工操作，也可以由计算机控制的自动平移台自动完成。优选的，该相对移动是由计算机控制的自动平移台自动完成的。
43.本发明的装置和操作方法，除了可以应用于单细胞或单颗粒的捕获与分离实验，得到包裹单细胞或单颗粒的液滴之外，还可以应用于连续相中单液滴的捕获与分离。
44.本发明的优点在于：
45.与传统自然沉降方法比较，本发明通过微孔膜预先捕获单细胞/单颗粒为单细胞/单颗粒阵列，可以从根本上避免两个单细胞/单颗粒之间距离过近的问题，使得毛细管探针每次吸取得到的均是单细胞/单颗粒，从而有效提高了单细胞/单颗粒分离的可靠性。这在
单细胞分析、单克隆制备等领域具有重要意义。
46.与随机液滴生成技术比较，本发明能够大规模、高概率地生成单细胞/单颗粒液滴，且与已有的序控液滴阵列技术高度兼容，有效解决了该技术难以高概率地生成单细胞/单颗粒液滴的问题，为后续将该技术应用于单细胞分析打下了坚实的基础。
47.与主被动捕获式单细胞液滴生成技术比较，本发明有效解决了单细胞液滴被限制在封闭芯片中而难以展开后续进一步操作的问题，即在开放式环境中可直接寻址的单细胞液滴阵列有效提高了单细胞分析的灵活性与可及性。
48.本发明装置易于构建，操作方便，可靠性好。
49.基于以上优点，本发明在单细胞分析、单克隆制备、单细胞相互作用研究等领域具有广泛的应用前景。
附图说明
50.图1是一种基于微孔膜的单细胞/单颗粒捕获与分离装置示意图。
51.图2是实施例1的结构说明图。
52.图3是实施例3的结构说明图。
具体实施方式
53.下面将对本发明进行实例阐述。
54.实施例1
55.该实施例将本发明用于分离得到单磁珠。
56.如图1和图2所示，一种基于微孔膜的单磁珠捕获与分离装置，包括：
57.i.超微量液体操作系统，该系统包括精密注射泵1和毛细管探针2。该系统用于操作皮升至纳升级的液体。
58.ii.磁珠阵列化捕获系统，该系统包括液池3、带有不锈钢边框的微孔膜4。该系统用于捕获磁珠5形成磁珠阵列。
59.iii.标准1536孔板作为单颗粒容器。
60.液池为开口结构，包括第一腔室、第二腔室和第三腔室，图中第一腔室为上腔室8，第二腔室为下腔室9，第三腔室为侧腔室10。利用微孔膜4将上腔室8和下腔室9分隔开。同时液池内壁设有绕内壁设置的支撑件，实际使用时，微孔膜四周被紧密粘贴在不锈钢边框上，而不锈钢边框与液池中的支撑件密封固定。下腔室9与侧腔室10之间设有出液口。
61.在该实施例中，磁珠的尺寸在20～30μm之间。
62.在该实施例中，超微量液体操作系统固定于手动三位平移台上，使得毛细管探针可以在微孔膜与标准1536孔板上精确定位。
63.在该实施例中，毛细管探针2由石英毛细管拉制而成，毛细管尖端孔径为50～60μm。
64.在该实施例中，带有不锈钢边框的微孔膜4(简写为微孔膜4)的主体部分材质是厚度为20μm的su8光胶，其四周与不锈钢边框紧密粘附。微孔膜表面具有正交排列的微通孔，微通孔直径为～8μm，通孔形状为圆台形。不锈钢边框仅为微孔膜提供支撑作用，中央有孔洞，使微孔膜上的所有微通孔暴露在外，不被遮挡。
65.在该实施例中，液池3中装有磷酸盐缓冲溶液(pbs)6作为空白载液。
66.在该实施例中，按照如下步骤操作：
67.a.在液池3中添加pbs6至确保能够浸没微孔膜4，然后安装微孔膜4。
68.b.在液池3的上腔室8中加入一定量pbs6，使其高于下腔室9液面10mm，以产生捕获磁珠所需的压强差。
69.c.在液池3上腔室中加入含有磁珠5的溶液。在液池3上、下腔室压强差的驱动下，磁珠5被微孔膜4捕获，构成单颗粒阵列。通过人工用移液轻柔吹打等方式引入一定扰动，可以扩展尚未被捕获的磁珠5的运动范围，从而提高磁珠5被捕获的概率。
70.d.通过人工用移液在上腔室8中产生液流，将未能被微孔膜4捕获的磁珠5洗去。
71.e.人工操作手动三维平移台，使毛细管探针2吸取被微孔膜4捕获的磁珠5，然后将毛细管转移至标准1536孔板7的目标孔上方，打出磁珠5，使磁珠转移至目标孔中。
72.f.重复步骤iv和v，直至将所需的磁珠5全部转移至1536孔板7中。
73.在步骤e中，毛细管探针2吸取微孔膜4上的磁珠5时，毛细管探针2尖端与微孔膜的距离为0.05mm，吸取体积为200nl，吸取流速为1μl/s；毛细管探针2打出磁珠时，注射体积为1μl，注射流速为1μl/s。
74.本实施例中，通过手动操作96次，可成功将96个单磁珠分离到1536孔板中，分离成功率为100％。
75.实施例2
76.该实施例将本发明用于分离得到连续相中的单液滴。
77.本实施例的装置及其操作方法与实施例1类似，但操作目标由磁珠改为直径60μm的荧光素钠水溶液液滴；空白载液(连续相)为矿物油；微孔膜的微通孔直径为15μm；液面差由10mm改为3mm。
78.本实施例中，通过手动操作96次，可成功将95个单液滴分离到1536孔板中，分离成功率为～99％
79.实施例3
80.如图3所示，该实施例将本发明用于单细胞液滴阵列的生成。
81.一种基于微孔膜的单细胞捕获与单细胞液滴阵列生成装置，包括：
82.i.超微量液体操作系统，该系统包括精密注射泵1和毛细管探针2。该系统用于操作皮升至纳升级的液体。
83.ii.单细胞阵列化捕获系统，该系统包括液池3、微孔膜4、气压控制器15与液流控制器。该系统用于捕获单细胞5a形成单细胞阵列。
84.iii.液滴芯片7a。
85.在该实施例中，细胞尺寸为10～15μm。
86.在该实施例中，超微量液体操作系统固定于由计算机程序控制的电动三维平移台上，使得毛细管探针可以在微孔膜4与液滴芯片7a上精确定位。
87.在该实施例中，毛细管探针2由石英毛细管拉制而成，尖端孔径为40～60μm。为了生成液滴，毛细管表面经过低表面能处理。
88.在该实施例中，微孔膜4材质为厚度为2μm的二氧化硅，并且附着在硅基片上以提高膜的机械强度。微孔膜4表面具有正六边形排列的微通孔阵列，微通孔直径为6μm，通孔形
状为圆柱形。微孔膜4整体经过低吸附处理，能够避免细胞5a粘附在微孔膜4表面。
89.在该实施例中，液池3中装有pbs6作为空白载液。
90.在该实施例中，液流控制器具有两个出入口，即出入口a13与出入口b14。
91.在该实施例中，按照如下步骤操作：
92.(a)在液池3中添加pbs至确保能够浸没微孔膜4，然后安装微孔膜4。
93.(b)打开气压控制器，使液池3的下腔室9内的气压相对大气压为-100pa。
94.(c)在液池3上腔室8中加入含有细胞5a的pbs6。在液池3上、下腔室压强差的驱动下，细胞5a被微孔膜4捕获，构成单细胞阵列。打开液流控制器，在出入口a13与出入口b14之间产生一定往复液流，可以扩展尚未被捕获的细胞5a的运动范围，从而提高细胞5a被微孔膜4捕获的概率。
95.(d)操作液流控制器，在出入口a13与出入口b14之间形成单向液流，将未能被微孔膜4捕获的细胞5a洗去。
96.(e)用毛细管探针2吸取被微孔膜4捕获的单细胞5a，然后将毛细管转移至液滴芯片7a上方，打出单细胞5a，使单细胞转移至液滴芯片7a中生成液滴12。
97.(f)重复步骤iv和v，直至将所需的单细胞5a全部转移至液滴芯片7a中。
98.(g)在液滴芯片中盖矿物油11，避免生成的液滴在后续操作中蒸发。
99.在该实施例的步骤(e)中，毛细管探针2吸取微孔膜4上的单细胞5a时，毛细管探针2尖端与微孔膜的距离为0.05mm，吸取体积为50nl，吸取流速为1μl/s；毛细管探针2打出单细胞时，注射体积为150nl，注射流速为μl/s。
100.本实施例中，程序自动操作96次，可成功将96个单细胞5a转移到液滴芯片7a上，产生96个单细胞液滴，单细胞液滴生成成功率为100％。
101.实施例4
102.该实施例将本发明用于生成单细胞+单磁珠液滴，以便于后续单细胞mrna测序分析的进行。
103.本实施例的装置及其操作方法与实施例3类似，但在单细胞液滴生成后，本实施例采用相同方法继续向单细胞液滴中转入单个磁珠，以生成单细胞+单磁珠液滴。
104.本实施例中，程序自动操作96次，可成功将96个单细胞5a转移到液滴芯片7a上；然后继续操作96次，向96个单细胞液滴中转入单个磁珠，最终产生95个单细胞单磁珠液滴，单细胞单磁珠液滴生成成功率为～99％。
技术特征：
1.一种基于微孔膜的单细胞/单颗粒捕获与分离装置，其特征在于，包括：用于操作皮升至纳升级的液体超微量液体操作系统；用于捕获单细胞/单颗粒形成单细胞/单颗粒阵列的单细胞/单颗粒阵列化捕获系统；以及用于接纳单细胞/单颗粒的单细胞/单颗粒容器；所述单细胞/单颗粒阵列化捕获系统包括：具有至少一个第一腔室和至少一个第二腔室的液池；设置在液池内将第一腔室和第二腔室分隔开的微孔膜；所述第一腔室和第二腔室具有能够产生压差的位置关系，或者包括能够在第一腔室和第二腔室产生压差的气压控制器。2.根据权利要求1所述的基于微孔膜的单细胞/单颗粒捕获与分离装置，其特征在于，所述液体超微量液体操作系统包括：用于吸取、转移或释放单细胞/单颗粒的毛细管探针；对毛细管探针提供动力的超微量液体泵。3.根据权利要求1所述的基于微孔膜的单细胞/单颗粒捕获与分离装置，其特征在于，所述液池为上部开口的结构，该液池内壁设有绕内壁设置的支撑件；所述微孔膜四周与所述环形支撑件密封固定；液池中，环形支撑件和微孔膜上方为所述第一腔室，下方为所述第二腔室。4.根据权利要求3所述的基于微孔膜的单细胞/单颗粒捕获与分离装置，其特征在于，所述第二腔室内设有液体出口；还包括液流控制器，该控制器具有设置在所述第一腔室内、且沿腔室内壁相对设置的入口a与出入口b。5.根据权利要求4所述的基于微孔膜的单细胞/单颗粒捕获与分离装置，其特征在于，所述液池内还包括第三腔室，该第三腔室与所述液体出口连通；当第三腔室为密闭结构时，所述气压控制器可通过调整第三腔室内的压力实现对第一腔室和第二腔室压差的调整。6.根据权利要求2所述的基于微孔膜的单细胞/单颗粒捕获与分离装置，其特征在于，毛细管探针尖端孔径在0.1μm～1mm之间；微通孔直径在0.1μm～1mm之间；孔深度在0.1μm～1mm之间。7.一种单细胞/单颗粒捕获与分离方法，其特征在于，利用权利要求1～6任一项所述的装置，包括如下步骤：i、在液池中添加空白载液，并安装微孔膜；ii、控制液池的第一腔室的压强略高于第二腔室的压强；iii、在液池第一腔室中加入含有单细胞/单颗粒的液体；在第一、第二腔室压强差的驱动下，单细胞/单颗粒流向其附近的微孔膜并被微孔膜捕获，构成单细胞/单颗粒阵列；iv、在第一腔室中产生液流，将未能被微孔膜捕获的单细胞/单颗粒洗去；v、用毛细管探针吸取被微孔膜捕获的单细胞/单颗粒，然后将毛细管探针转移至单细胞/单颗粒容器上方，打出被吸取的单细胞/单颗粒，使单细胞/单颗粒转移至单细胞/单颗粒容器中；vi、重复步骤iv和v，直至将所需的单细胞/单颗粒全部转移至单细胞/单颗粒容器中，完成单细胞/单颗粒捕获与分离。8.根据权利要求7所述的单细胞/单颗粒捕获与分离方法，其特征在于，第一腔室与第二腔室之间的压强差范围为0.001～100000pa；在步骤v中，吸取微孔膜上的单细胞/单颗粒
时，毛细管探针尖端与微孔膜的距离为0～5mm，吸取体积为0～100μl，吸取流速为0～10ml/s；毛细管探针打出单细胞/单颗粒时，注射体积为1～200倍吸取体积，注射流速为0～10ml/s。9.根据权利要求7所述的单细胞/单颗粒捕获与分离方法，其特征在于，步骤iii中，可选择的通过轻柔吹打引入一定流体流动，扩展尚未被捕获的单细胞/单颗粒运动范围，提高单细胞/单颗粒被微孔膜捕获的概率。10.根据权利要求7所述的单细胞/单颗粒捕获与分离方法，其特征在于，单细胞/单颗粒尺寸为0.1μm～1mm。
技术总结
本发明公开了一种基于微孔膜的单细胞/单颗粒捕获与分离装置，包括：用于操作皮升至纳升级的液体超微量液体操作系统；用于捕获单细胞/单颗粒形成单细胞/单颗粒阵列的单细胞/单颗粒阵列化捕获系统；以及用于接纳单细胞/单颗粒的单细胞/单颗粒容器；所述单细胞/单颗粒阵列化捕获系统包括：具有至少一个第一腔室和至少一个第二腔室的液池；设置在液池内将第一腔室和第二腔室分隔开的微孔膜；所述第一腔室和第二腔室具有能够产生压差的位置关系，或者包括能够在第一腔室和第二腔室产生压差的气压控制器。本发明装置易于构建，操作方便，可靠性好。性好。性好。
