一种烟曲霉半乳甘露聚糖模拟肽的制作方法
transplantation:a study from the surveillance des aspergilloses invasives en france and soci
é
t
é
francophone de greffe de moelle et de th
é
rapie cellulaire[j].biol blood marrow transplant,2019,25(2):354-361.
[0011]
[7]lortholary o,gangneux j p,sitbon k,et al.epidemiological trends in invasive aspergillosis in france:the saif network(2005-2007)[j].clin microbiol infect,2011,17(12):1882-1889.
[0012]
[8]fukuda t,boeckh m,carter r a,et al.risks and outcomes of invasive fungal infections in recipients of allogeneic hematopoietic stem cell transplants after nonmyeloablative conditioning[j].blood,2003,102(3):827-833.
[0013]
[9]obayashi t,yoshida m,mori t,et al.plasma(1
‑‑
》3)-beta-d-glucan measurement in diagnosis of invasive deep mycosis and fungal febrile episodes[j].lancet,1995,345(8941):17-20.
[0014]
[10]stynen d,sarfati j,goris a,et al.rat monoclonal antibodies against aspergillus galactomannan[j].infect immun,1992,60(6):2237-2245.
[0015]
[11]fontaine t,latg
é
j p.galactomannan produced by aspergillus fumigatus:an update on the structure,biosynthesis and biological functions of an emblematic fungal biomarker[j].j fungi(basel),2020,6(4).
[0016]
[12]latg
é
j p,kobayashi h,debeaupuis j p,et al.chemical and immunological characterization of the extracellular galactomannan of aspergillus fumigatus.[j].infection and immunity,1994,62(12):5424.
[0017]
[13]patterson t f,thompson g r,denning d w,et al.executive summary:practice guidelines for the diagnosis and management of aspergillosis:2016 update by the infectious diseases society of america[j].clin infect dis,2016,63(4):433-442.
[0018]
[14]maertens j,theunissen k,verbeken e,et al.prospective clinical evaluation of lower cut-offs for galactomannan detection in adult neutropenic cancer patients and haematological stem cell transplant recipients[j].br j haematol,2004,126(6):852-860.
[0019]
[15]maertens j,theunissen k,verhoef g,et al.galactomannan and computed tomography-based preemptive antifungal therapy in neutropenic patients at high risk for invasive fungal infection:a prospective feasibility study[j].clin infect dis,2005,41(9):1242-1250.
[0020]
[16]pfeiffer c d,fine j p,safdar n.diagnosis of invasive aspergillosis using a galactomannan assay:
[0021]
a meta-analysis[j].clin infect dis,2006,42(10):1417-1427.
技术实现要素：
[0022]
本发明所要解决的技术问题是提供一种曲霉半乳甘露聚糖模拟肽，该模拟肽所制备的试剂用于诊断侵袭性曲霉病具有高特异性、高灵敏度的优点。
[0023]
本发明解决上述问题的技术方案如下：
[0024]
一种曲霉半乳甘露聚糖模拟肽，其特征在于，该模拟肽的氨基酸序列为ser ala ala thr met arg gly asp gln ser val arg ile phe gly gly(seq id no.1)。
[0025]
上述模拟肽可按seq id no.1所示序列采用多肽合成仪合成得到。
[0026]
上述seq id no.1所示模拟肽虽然可与商业化抗半乳甘露聚糖大鼠单克隆抗体特异性结合，但是其仅由16个氨基酸组成，属于分子量小的半抗原，免疫原性不理想，在免疫动物过程难以诱导有效的免疫应答，产生相对应的抗体，因此建立侵袭性曲霉病抗原检测体系存在一定的困难。
[0027]
为解决上述难题，本发明进一步提供一种模拟烟曲霉半乳甘露聚糖表位的抗原，该抗原由牛血清白蛋白(bovine serum albumin，bsa)与seq id no.1所示模拟肽依次偶联构成。所述的抗原可用于制备诊断侵袭性曲霉病的试剂。
[0028]
由于本发明所述的模拟肽能很好地模拟半乳甘露聚糖表位，因此可解决天然半乳甘露聚糖抗原提取、纯化及合成困难等问题。更进一步地，本发明将所述的模拟肽与牛血清白蛋白偶联构成模拟半乳甘露聚糖表位的抗原。利用本领域常规的技术手段，所述的抗原可制备成特异性高、灵敏度高的侵袭性曲霉病血清学抗原检测试剂。
附图说明
[0029]
图1为本发明所述模拟肽与抗半乳甘露聚糖大鼠单克隆抗体结合的特异性曲线图。
[0030]
图2为本发明所述模拟肽偶联bsa的偶联物与兔抗烟曲霉多克隆抗体结合的灵敏度曲线图。
具体实施方式
[0031]
下述多肽及偶联物委托上海吉尔多肽有限公司按seq id no.1所示序列合成。
[0032]
实施例1
[0033]
1.酶联免疫吸附法检测半乳甘露聚糖模拟肽与抗半乳甘露聚糖大鼠单克隆抗体的结合
[0034]
往包被抗半乳甘露聚糖大鼠单克隆抗体的板条中加入稀释至不同浓度(50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0μg/ml)的半乳甘露聚糖模拟肽，100μl/孔，37℃孵育1h，0.1％pbst洗板5次。加入辣根过氧化物酶标记的抗半乳甘露聚糖大鼠单克隆抗体，100μl/孔，37℃孵育40min。0.1％pbst洗涤10次。tmb显液避光显10min，1m h2so4终止显，酶标仪检测od450值。酶联免疫吸附实验结果显示：seq.id no.1所示半乳甘露聚糖模拟肽(以下简称sp2)能与商业化抗半乳甘露聚糖大鼠单克隆抗体发生特异性结合(图1)。
[0035]
2.半乳甘露聚糖模拟肽的抗原性预测
[0036]
经dnastar及bepipred linear epitope prediction 2.0生物信息学工具预测，核心序列sp2为碱性亲水性多肽，二级结构以β折叠及α螺旋为主，β转角结构位于第5～8氨基酸残基处，其表面可及性、柔韧性、抗原指数均大于0，经预测其可能b细胞表位为第5～12氨基酸残基处(表1)。在mhc ii类抗原表位，选取hla-dr的6个表位(drb1*0101、0301、0401、0701、1101和1501)进行syfpeithi在线预测，结果显示sp2具有与mhc ii分子的结合位点，
提示存在th细胞表位，可辅助b细胞的免疫应答(表2)。
[0037]
表1半乳甘露聚糖模拟肽的抗原性指标预测
[0038][0039]
注：以上抗原预测指标均为均值。pi：等电点；hydrophilicity：亲水性；surface probability：表面可及性；antigenic index：抗原指数；flexibility：柔韧性。其中加粗划线部分为dnastar及bepipred linear epitope prediction 2.0预测的b细胞抗原表位。
[0040]
表2半乳甘露聚糖模拟肽sp2的th细胞表位预测
[0041][0042][0043]
注：黑体划线加粗部分为锚定氨基酸。分值越高，具有th细胞表位的可能性越大。
[0044]
实施例2
[0045]
曲霉半乳甘露聚糖模拟肽sp2与大分子载体蛋白bsa偶联，以提高模拟肽的免疫原性，以引起有效免疫应答产生高特异性的抗体，可用于ia的血清学检测。所述抗原(以下简称bsa-sp2)由模拟半乳甘露聚糖抗原表位的sp2及大分子载体蛋白bsa组成。
[0046]
1、兔抗烟曲霉多克隆抗体的制备
[0047]
利用烟曲霉粗提抗原多次皮下免疫新西兰兔，获取烟曲霉粗提抗原免疫兔血清，经辛酸-硫酸铵法纯化得到相应的兔多克隆抗体。兔抗烟曲霉多克隆抗体同样具有半乳甘露聚糖结合表位。
[0048]
2、酶联免疫吸附法检测bsa-sp2与兔抗烟曲霉多克隆抗体结合的灵敏度
[0049]
取bsa-sp2包被，包被浓度为1μg/ml，4℃包被过夜。0.25％酪蛋白封闭液，4度封闭过夜。加入稀释至不同浓度(200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39、0.2、0μg/ml)的兔抗烟曲霉多克隆抗体，相同浓度的正常兔多克隆抗体作为阴性对照。100μl/孔，37℃孵育1h。加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔igg 1:2000，100μl/孔，37℃孵育40min。0.1％pbst洗板10次后拍干。tmb显液避光显10min，1m h2so4终止显，酶标仪检测
od450值。酶联免疫吸附实验结果显示：bsa-sp2可与兔抗烟曲霉多克隆抗体呈剂量依赖性结合，以bsa-sp2检测兔抗烟曲霉多克隆抗体的最低检测值为0.2μg/ml(图2)，说明bsa-sp2同样可模拟半乳甘露聚糖抗原表位。
技术特征：
1.一种烟曲霉半乳甘露聚糖模拟肽，该模拟肽的氨基酸序列为ser ala ala thr met arg gly asp gln ser val arg ile phe gly gly。2.一种模拟烟曲霉半乳甘露聚糖表位的抗原，该抗原由牛血清白蛋白与权利要求1所述模拟肽依次偶联构成。3.权利要求2所述的抗原在制备诊断侵袭性曲霉病试剂中的应用。
技术总结
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种烟曲霉半乳甘露聚糖模拟肽，该模拟肽的核心序列为：Ser-Ala-Ala-Thr-Met-Arg-Gly-Asp-Gln-Ser-Val-Arg-Ile-Phe-Gly-Gly(SEQ IDO.1)。本发明所述的半乳甘露聚糖模拟肽能分别与两种不同的抗烟曲霉抗体特异性结合，因此可制成侵袭性曲霉感染的诊断试剂。此可制成侵袭性曲霉感染的诊断试剂。
