大鼠线粒体基因aC（aCC）位点特异性碱基编辑及其应用
大鼠线粒体基因ac(acc)位点特异性碱基编辑及其应用
技术领域
1.本发明涉及动物基因遗传修饰，具体涉及一种大鼠线粒体基因ac(acc)位点特异性的碱基编辑工具及其应用。
背景技术：
2.线粒体是唯一拥有自己遗传物质(线粒体dna，mtdna)的细胞器。mtdna突变与人类多种系统性疾病相关。目前为止，已报道人类疾病相关的mtdna突变超过390种，并且数量还在不断增加。但是，临床目前仍没有针对mtdna突变所致疾病的特异物。因此，迫切需求包含精确的人类mtdna变异的动物模型来揭示这类疾病的病理生理学过程并开发针对这些疾病的方法。由于传统ddcbe工具的识别靶点只局限于tc位点，严重地限制了ddcbe工具的应用。因此，开发能够识别非tc(ac/cc/gc)位点的ddcbe工具，对于建立对应的mtdna突变动物模型，服务于基础和临床研究至关重要。
技术实现要素：
3.本发明的目的之一是开发一种实现大鼠mtdna ac(acc)位点c
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a的编辑工具。
4.根据本发明的第一方面内容，提供一种大鼠mtdna ac(acc)位点c
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a的编辑工具，包括：
5.根据目标mtdna突变位点，在其上下游各选定一个tale识别靶点，tale识别靶点序列之间的间隔为7-18bp；
6.筛选能够高效率的定位到目标ac(acc)位点使其发生c
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a转变的ddcbe组合，从而在大鼠线粒体基因组中引入突变。
7.本发明针对传统ddcbe只能实现tc位点编辑的局限性，通过优化ddcbe组合，扩展其在大鼠中的识别位点，从而提供了一种能够实现ac(acc)位点特异性编辑的ddcbe工具。
8.其中所述特异性的ddcbe组合被共注射以实现大鼠线粒体目标ac位点碱基c
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a的突变。
9.根据本发明，大鼠mtdna ac(acc)位点特异性ddcbe组合为：
10.rat ac(acc)left tale-g1333c(l1333c)和rat ac(acc)right tale-g1333n(r1333n)
11.根据本发明，可以实现大鼠mtdna ac(acc)位点碱基c
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a的突变。
12.根据本发明的第二方面，提供了上述编辑工具在大鼠受精卵中进行mtdna g007a的突变应用。
13.根据本发明的另一方面，还提供了一种试剂盒，包括上述碱基编辑工具或系统。
14.根据本发明方法制备的mtdna g007a f0雌性突变大鼠，与野生型雄性大鼠交配，在子代大鼠中能够检测到mtdna g007a突变。
15.根据本发明建立的mtdna g007a突变大鼠，通过行为学和心脏功能分析，证明
mtdna g007a突变大鼠模型能够模拟人mtdna g583a突变的临床表型。
附图说明
16.图1人和大鼠线粒体致病突变ac(acc)位点同源比对；
17.图2不同ddcbe组合在c6细胞中对ac(acc)位点编辑效率的比较；
18.图3mtdna g007a f0突变大鼠的组织突变情况鉴定；
19.图4mtdna g007a f1突变大鼠的组织突变情况分析；
20.图5mtdna g007a f1突变大鼠的运动行为分析；以及
21.图6mtdna g007a f1突变大鼠的心脏功能检测。
具体实施方式
22.首先，根据临床中人源致病性mtdna ac(acc)突变位点g583、g1606、g12147和g12315/6，确定其分别对应大鼠中mtdna位点g007、g1030、g11547和g11714/5(见图1)。根据大鼠的ac(acc)位点，设计tale的识别序列。ddcbe定点线粒体编辑是利用一对tale识别位点将融合的碱基编辑工具定位到靶点位置，实现目标碱基的突变是本发明的关键之处。本发明如下选择设计tale识别靶点：
23.根据tale的识别原则，在靶点上下游分别选定一个tale识别位点，两个tale识别位点中间间隔序列为7-18bp，需要包含的目标突变碱基g，同时在间隔序列中尽量避免目标碱基外的碱基g。
24.利用两个融合tale识别位点的ddcbe定位于相应的目标突变序列位置，并使目标突变g编辑变为a，从而在大鼠线粒体基因中引入突变；
25.上述所述的tale识别序列位于目标突变碱基上下游的3-15bp序列位置；
26.针对大鼠mtdna g583位点，本发明选定下面两条tale左右识别靶点：
27.左侧识别靶点：
28.tccacatacaccaa(seq id no.1)
29.右侧识别靶点：
30.ttatttcgtttcgtgac(seq id no.2)
31.针对大鼠mtdna g1606位点，本发明选定下面两条tale左右识别靶点：
32.左侧识别靶点：
33.ggaaagtgtgcttggaat(seq id no.3)
34.右侧识别靶点：
35.ttagtgtttcgtagac(seq id no.4)
36.针对大鼠mtdna g12147位点，本发明选定下面两条tale左右识别靶点：
37.左侧识别靶点：
38.ggcctaacaatatgt(seq id no.5)
39.右侧识别靶点：
40.tttgtaatctgacac(seq id no.6)
41.针对大鼠mtdna g12315/6位点，本发明选定下面两条tale左右识别靶点：
42.左侧识别靶点：
43.ggtcttaggaaccaaa(seq id no.7)
44.右侧识别靶点：
45.gtttattttcatta(seq id no.8)
46.针对上述选定的tale靶点序列，构建不同的ddcbe，对应不同的ddcbe如下：
47.rat g007a left tale-g1333c(seq id no.9)；
48.rat g007a right tale-g1333n(seq id no.10)；
49.rat g007a left tale-g1397c(seq id no.11)；
50.rat g007a right tale-g1397n(seq id no.12)；
51.rat g007a left tale-g1333n(seq id no.13)；
52.rat g007a right tale-g1333c(seq id no.14)；
53.rat g007a left tale-g1397n(seq id no.15)；
54.rat g007a right tale-g1397c(seq id no.16)；
55.rat g1030a left tale-g1333c(seq id no.17)；
56.rat g1030a right tale-g1333n(seq id no.18)；
57.rat g1030a left tale-g1397c(seq id no.19)；
58.rat g1030a right tale-g1397n(seq id no.20)；
59.rat g1030a left tale-g1333n(seq id no.21)；
60.rat g1030a right tale-g1333c(seq id no.22)；
61.rat g1030a left tale-g1397n(seq id no.23)；
62.rat g1030a right tale-g1397c(seq id no.24)；
63.rat g11547a left tale-g1333c(seq id no.25)；
64.rat g11547a right tale-g1333n(seq id no.26)；
65.rat g11547a left tale-g1397c(seq id no.27)；
66.rat g11547a right tale-g1397n(seq id no.28)；
67.rat g11547a left tale-g1333n(seq id no.29)；
68.rat g11547a right tale-g1333c(seq id no.30)；
69.rat g11547a left tale-g1397n(seq id no.31)；
70.rat g11547a right tale-g1397c(seq id no.32)；
71.rat g11714/5a left tale-g1333c(seq id no.33)；
72.rat g11714/5a right tale-g1333n(seq id no.31)；
73.rat g11714/5a left tale-g1397c(seq id no.32)；
74.rat g11714/5a right tale-g1397n(seq id no.33)；
75.rat g11714/5a left tale-g1333n(seq id no.34)；
76.rat g11714/5a right tale-g1333c(seq id no.35)；
77.rat g11714/5a left tale-g1397n(seq id no.36)；
78.rat g11714/5a right tale-g1397c(seq id no.37)；
79.将ddcbe分别导入pb转座子表达载体，用于大鼠mtdna ac(acc)位点的突变。
80.实施例1
81.在大鼠细胞系上进行ddcbe介导的mtdna ac(acc)位点c
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a突变。按常规操
作，进行细胞系的基因编辑(通过电转或脂质体转染)，以脂质体转染为例。
82.(1)以c6细胞为例，本发明进行真核生物细胞的培养与转染：c6细胞接种培养于添加10％fbs的dmem高糖培养液中(gemini),其中含penicillin(100u/ml)和streptomycin(100μg/ml)。
83.(2)在转染前分至6孔板中，待密度达到70％-80％时进行转染。
84.ddcbe系统质粒组合如下：
85.a:rat g007a left tale-g1333c/rat g007a right tale-g1333n(l1333c+r1333n)；
86.b:rat g007a left tale-g1397c/rat g007a right tale-g1397n(l1397c+r1397n)；
87.c:rat g007a left tale-g1333n/rat g007a right tale-g1333c(l1333n+r l1333c)；
88.d:rat g007a left tale-g1397n/rat g007a right tale-g1397c(l1397n+r l1397c)；
89.e:rat g1030a left tale-g1333c/rat g1030a right tale-g1333n(l1333c+r1333n)；
90.f:rat g1030a left tale-g1397c/rat g1030a right tale-g1397n(l1397c+r1397n)；
91.g:rat g1030a left tale-g1333n/rat g1030a right tale-g1333c(l1333n+r l1333c)；
92.h:rat g1030a left tale-g1397n/rat g1030a right tale-g1397c(l1397n+r l1397c)；
93.i:rat g11547a left tale-g1333c/rat g11547a right tale-g1333n(l1333c+r1333n)；
94.j:rat g11547a left tale-g1397c/rat g11547a right tale-g1397n(l1397c+r1397n)；
95.k:rat g11547a left tale-g1333n/rat g11547a right tale-g1333c(l1333n+r l1333c)；
96.l:rat g11547a left tale-g1397n/rat g11547a right tale-g1397c(l1397n+r l1397c)；
97.m:rat g11714/5a left tale-g1333c/rat g11714/5a right tale-g1333n(l1333c+r1333n)；
98.n:rat g11714/5a left tale-g1397c/rat g11714/5a right tale-g1397n(l1397c+r1397n)；
99.o:rat g11714/5a left tale-g1333n/rat g11714/5a right tale-g1333c(l1333n+r l1333c)；
100.p:rat g11714/5a left tale-g1397n/rat g11714/5a right tale-g1397c(l1397n+r l1397c)；
101.(3)转染以脂质体转染为例。按照lipofectamine
tm
2000 transfection reagent
(invitrogen,11668-019)的操作手册，以a组合为例，将1μg rat g007a left tale-g1333c(l1333c)质粒与1μg rat g007a right tale-g1333n(r1333n)质粒混匀，共转染至每孔细胞中，6-8小时后换液，72小时后收取细胞。
102.(4)基因型分析
103.a、收取部分细胞在裂解液(10μm tris-hcl,0.4m nacl,2μm edta,1％sds)中用100μg/ml蛋白酶k裂解消化后，酚-氯仿抽提后溶解到50μl去离子水中。
104.b、使用引物g007-fwd(aggcatctggttcttacttcagg)，g007-rev(ttattaaggtttagggctaagcatagtgg)；g1030-fwd(gcggtactttatatccatctagagg)，g1030-rev(gtttttaggtagctcgtttggtttc)；g11547-fwd(accttcccacacacgagaatta)，g11547-rev(gggtgcatgaattagcagttct)；g11714/5-fwd(tgaatctaacaacaggaaatcaaattc)，g11714/5-rev(gatataattcctactccttctcatccaat)；进行pcr扩增，用axyprep pcr cleanup试剂盒(axygen，ap-pcr-250g)纯化获得pcr回收产物，pcr反应体系为：
105.300-400ng基因组dna
106.25μl 2
×
buffer
107.1μl dntp
108.2μl fwd(20μm)
109.2μl rev(20μm)
110.1μl dna polymerase(vazyme,p505-d3)
111.补水至50μl体系。
112.c、获得的pcr回收产物连接到克隆载体-blunt cloning kit(transgen,cb 101)，连接反应体系为：
113.2μl pcr产物
114.1μl-blunt cloning vector
115.轻轻混合，室温(20-37℃)反应5分钟。反应结束后，将离心管置于冰上。
116.连接产物转化dh5感受态细胞(transgen,cd201)。
117.d、挑取克隆，用通用引物m13-f测序靶基因突变，测序结果如下(斜体、加粗、灰、下划线表示突变碱基)：
118.g007靶点突变情况：
119.wt：aatgtag
120.mut：aatatag
121.g1030靶点突变情况：
122.wt：acagtgt
123.mut：acaatgt
124.g11547靶点突变情况：
125.wt：gtagttt
126.mut：gtaattt
127.g11714/5靶点突变情况：
128.wt：cttggtgc
g1333n组合，通过显微注射的方式，可以实现大鼠mtdna g007 ac位点的c
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a突变。
155.(4)通过将获得的g007a雌性突变大鼠与野生型雄性大鼠进行杂交，对子代大鼠进行基因组dna提取、pcr和测序分析，发现突变能够稳定的遗传到子代大鼠中(见图4)。表明我们获得了能够稳定遗传的mtdna g007a突变大鼠。
156.(5)线粒体基因g007a点突变f1大鼠行为学分析
157.对获得的线粒体基因g007a点突变f1大鼠，进行行为学方法检测，判定g007a大鼠的肌肉功能指标。进而验证该突变是否会导致线粒体功能缺陷，进而影响肌肉组织的功能。
158.开放旷场实验：该实验在80cm
×
80cm
×
50cm的黑箱体中进行。使用supermaze数字跟踪系统记录大鼠自发活动5分钟。大鼠的运动轨迹通过supermaze软件进行分析。
159.开放旷场的实验结果显示g007a突变导致大鼠的运动距离和平均速度显著下降，如图5所示。
160.(6)线粒体基因g007a点突变f1大鼠心脏功能评价
161.对获得的线粒体基因g007a点突变f1大鼠，用心脏超声检测分析突变大鼠的心脏结构和功能相关参数。
162.m型超声心动检查：采用异氟烷麻醉大鼠，使用小动物微超声成像系统(vevo 3100)进行超声心动图观察。记录至少三个连续心动周期，然后进行参数测量和计算。
163.心脏结构和功能评价结果显示，与野生大鼠相比，g007a突变大鼠表现出扩张型心肌病表型，左心室变大，左心室收缩功能下降，如图6所示。
技术特征：
1.一种大鼠线粒体基因ac(acc)位点的编辑工具，包括：选定一对tale识别靶点序列，其中目标位点ac(acc)位于tale识别靶点序列中间位置，tale识别靶点序列之间的间隔为7-18bp；筛选能够高效率的定位到目标ac(acc)位点使其发生c
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a转变的ddcbe组合，从而在线粒体基因组中引入突变。2.根据权利要求1所述的编辑工具，其中大鼠线粒体基因ac(acc)位点特异性的ddcbe组合为：mts-n-1366aa-rvdarray-c-g1333c-ugi和mts-n-1366aa-rvdarray-c-g1333n-ugi。3.权利要求1所述的编辑工具在大鼠中实现线粒体基因ac(acc)位点c
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a的突变的应用。4.根据权利要求1所述的编辑工具在大鼠细胞系c6进行线粒体基因ac(acc)位点c
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a突变的应用。5.根据权利要求1所述的编辑工具在大鼠受精卵注射制备大鼠线粒体基因ac(acc)位点c
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a突变模型的应用。6.根据权利要求1所述的编辑工具制备的线粒体基因突变大鼠模型，其获得的突变能够稳定地母系遗传。7.根据权利要求1所述的编辑工具制备的g007a大鼠模型，具有人类线粒体g583a突变临床表型，应用于线粒体肌病的研究。
技术总结
大鼠线粒体基因aC(aCC)位点特异性碱基编辑及其应用。本发明利用DdCBE碱基编辑技术，针对aC(aCC)位点，在其两侧设计TALE识别靶点序列，通过筛选四种DdCBE组合方式，鉴定出具有aC(aCC)位点特异性的DdCBE组合(L1333C+R1333)；通过大鼠受精卵显微注射，能够实现大鼠线粒体基因第007位aC靶点C
