聚醚醚酮在作为DA合成载体中的应用的制作方法
聚醚醚酮在作为dna合成载体中的应用
技术领域
1.本发明属于生物材料技术领域，具体涉及聚醚醚酮在作为dna合成载体中的应 用。
背景技术：
2.目前，dna的化学合成主要有固相合成法和液相合成法；固相合成法通常采用亚 磷酸酰胺三脂法进行dna合成。基于固相亚磷酸酰胺三脂法的dna化学合成具体为： 第一步，连接在固相载体上，5’端羟基被二甲氧基三苯甲基(dmt)保护的核苷酸(通常 包含在一个合成柱内)通过加入三而去保护，从而获得游离的5'-羟基端，以供 下一步合成反应，使dna链在原有基础上增加一个单体。第二步，将亚磷酰胺单体 与四氮唑活化剂混合进入合成柱，形成亚磷酸酰胺四唑活性中间体(其5'端仍受dmt 保护，3'端被活化)。第三步，在序列中与先前连接在固相载体上核苷的5'-羟基发生 偶联反应、形成亚磷酸三酯，从而使合成序列链向前延长一个碱基。第四步，采用碘 的四氢呋喃溶液将不稳定，易被酸、碱水解亚磷酸酯键，转化为稳定的五价磷酸酯键。 经过上述同样的循环步骤，即可得到存储所需的dna文本样品。简而言之，基于固 相亚磷酸酰胺三脂法的dna化学合成由四个反应步骤构成一个循环完成一个单体的 合成，也就是说每增加一个循环，即在固体载体上不断增长的寡核苷酸链上增加一个 碱基。
3.文献报道中关于dna合成载体的报道主要集中在控孔玻璃(cpg)、聚苯乙烯、以及 改性玻璃和改性硅片，由此可见对于dna合成载体的种类选择存在较大的局限性。
技术实现要素：
4.为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种新的dna合成载 体。
5.为了达到上述目的，本发明采用如下技术手段：
6.聚醚醚酮在作为dna合成载体中的应用，其中，所述聚醚醚酮为经化学修饰的聚 醚醚酮，具有以下式i所示的结构式：
[0007][0008]
式中，n为200-500之间的整数，linker的结构如下：
[0009][0010]
r为烷基、苯基或取代的苯基。
[0011]
优选地，所述经化学修饰的聚醚醚酮的制备方法包括以下步骤：
[0012]
s1，羟基修饰：以二甲基亚砜为溶剂，硼氢化钠为还原剂，在100-140℃下与聚 醚醚酮反应3h，通过硼氢化钠将聚醚醚酮中的醛基还原得到羟基修饰的聚醚醚酮，以 便进一步修饰得到目标产物；
[0013]
s2，异氰酸酯基团修饰：以甲苯为溶剂，三乙烯二胺为碱，将步骤s1所得的羟 基修饰的聚醚醚酮与4，4-二环己基甲烷二异氰酸酯在室温下氮气氛围中反应3天， 通过羟基与其中一个异氰酸酯基反应，得到异氰酸酯基团修饰的聚醚醚酮，以便进一 步修饰得到目标产物；
[0014]
s3，氨基修饰：在室温条件下，将步骤s2所得的经异氰酸酯基团修饰的聚醚醚 酮与氢氧化钠在1，4-二氧六环中反应，通过氢氧化钠与异氰酸酯基作用，脱去二氧 化碳得到氨基修饰的聚醚醚酮，以便进一步修饰得到目标产物；
[0015]
s4，linker接枝：在室温下，将步骤s3所得的经氨基修饰的聚醚醚酮与linker 在含有2-(7-氮杂苯并三氮唑)-n,n,n’,n
’‑
四甲基脲六氟磷酸酯、n,n-二异丙基乙胺 的乙腈溶液中反应过夜，得到linker接枝的聚醚醚酮。
[0016]
优选地，步骤s1中，所述聚醚醚酮的表面积为200cm2。
[0017]
优选地，步骤s1中，聚醚醚酮、硼氢化钠与二甲基亚砜按质量体积比如下：聚 醚醚酮：硼氢化钠：二甲基亚砜＝0.5g:0.1g:50ml。
[0018]
优选地，步骤s2中，三乙烯二胺、羟基修饰的聚醚醚酮、4，4-二环己基甲烷二 异氰酸酯与甲苯按质量体积比如下：羟基修饰的聚醚醚酮：三乙烯二胺：4，4-二环己 基甲烷二异氰酸酯：甲苯＝0.5g:2.15mg:1ml:19ml。
[0019]
优选地，步骤s3中，经异氰酸酯基团修饰的聚醚醚酮、氢氧化钠与1，4-二氧六 环按质量比如下：经异氰酸酯基团修饰的聚醚醚酮：氢氧化钠：1，4-二氧六环＝0.5:1:1。
[0020]
优选地，步骤s4中，经氨基修饰的聚醚醚酮、linker、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-n,n, n’,n
’‑
四甲基脲六氟磷酸酯、n,n-二异丙基乙胺和乙腈按质量体积比如下：经氨基修 饰的聚醚醚酮：linker：2-(7-氮杂苯并三氮唑)-n,n,n’,n
’‑
四甲基脲六氟磷酸酯：n,n
‑ꢀ
二异丙基乙胺：乙腈＝500mg:200mg:160mg:400ul。
[0021]
一种dna的合成方法，包括利用所述的经化学修饰的聚醚醚酮作为dna合成载 体进行dna合成的步骤。
[0022]
具体如下：采用abi 8909dna合成仪，将经化学修饰的聚醚醚酮置于鲁尔接头 中，设置tca法亚磷酰胺合成程序，进行自动dna合成。
[0023]
其中，合成程序如下：
[0024][0025][0026]
本发明的有益效果
[0027]
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
[0028]
本发明所提供的经化学修饰的聚醚醚酮可以作为dna合成载体用于dna合成， 丰富了dna合成载体材料的种类。本发明所提供的dna合成载体为经化学修饰的聚 醚醚酮，所用聚醚醚酮廉价易得，制备方法简单。并且本发明所提供的dna合成载 体的可设计性强，可
述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实 施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开 的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明 的精神或范围。
[0039]
除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术 人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并 入。
[0040]
那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的 发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
[0041]
1,4-二氧六环、三乙烯二胺、n,n-二异丙基乙胺、二甲基亚砜、硼氢化钠、4,4
‑ꢀ
二环己基甲烷二异氰酸酯、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-n,n,n’,n
’‑
四甲基脲六氟磷酸酯、 氢氧化钠、二甲苯、dna合成用脱帽剂、活化剂、氧化剂、盖帽剂及a、t、g、c 单体一般采用市售产品，都能从市场上方便得到。
[0042]
实施例1
[0043]
本实施例在于提供经化学修饰的聚醚醚酮，具有以下式i所示的结构式：
[0044][0045]
式中，r为苯基(-ph)，n为400
[0046]
本实施例还提供经化学修饰的聚醚醚酮的制备方法，该方法包括以下步骤：
[0047]
s1，制备羟基修饰的聚醚醚酮：在20ml的圆底瓶中加入10ml二甲基亚砜(dsmo) 和0.05g硼氢化钠(nabh4)，在120℃的条件下加热至完全溶解，而后将聚醚醚酮 (peek)材料(0.5g，200cm2)完全浸没于120℃的反应溶液中反应3小时。待反应 结束后，将peek材料从圆底瓶中取出，依次用甲醇、去离子水、0.5mol/l盐酸、去 离子水、乙醇分别冲洗三次，冲洗结束后将peek材料微孔板置于真空状态在60℃的 条件下干燥3小时，即可达到相应的羟基修饰的聚醚醚酮(peek)材料，反应过程如下 式i所示：
[0048][0049]
s2，制备异氰酸酯基团修饰的聚醚醚酮：在氮气条件下，在密闭的反应容器中加 入10ml二甲苯(dimethylbenzene)、0.5ml 4,4-二环己基甲烷二异氰酸酯(hmdi) 和1.08g三乙烯二胺(dabco)充分搅拌溶解完全，将步骤s1所得的羟基修饰的聚 醚醚酮完全浸没于搅拌后的反应溶液中，于室温下浸泡3天。反应结束后，将聚醚醚 酮材料样品在氮气条件下用二甲苯和1,4-二氧六环溶剂分别冲洗3次，即可得到异氰 酸酯基团修饰的聚醚醚酮(peek-nco)。反应过程如下式ii所示：
[0050][0051]
s3，制备氨基修饰的聚醚醚酮：在室温条件下，将步骤s2所得的经异氰酸酯基 团修饰的聚醚醚酮浸没于0.5mol/l氢氧化钠(naoh)溶液和1,4-二氧六环(1,4-dioxane) 体积比1：1的混合溶液中，浸泡5小时。待反应完成后，用去离子水和1,4-二氧六环 溶液分别冲洗三次。将冲洗后的材料置于真空状态下干燥3小时，即可得到相应的氨 基修饰的聚醚醚酮(peek-nh2)。反应过程如下式iii所示：
[0052][0053]
s4，制备linker接枝的聚醚醚酮：在室温下，在20ml的圆底瓶中分别加入100mg linker、80mg 2-(7-氮杂苯并三氮唑)-n,n,n’,n
’‑
四甲基脲六氟磷酸酯(hatu)、200ul n,n-二异丙基乙胺(n,n-diisopropylethylamine)和10ml乙腈(ch3cn)，摇匀。将步 骤s3所得的经氨基修饰的聚醚醚酮置于圆底瓶中，搅拌过夜。反应完成后，将材料 取出分别用乙腈和1,4-二氧六环冲洗三次，晾干，即可达到相应的linker接枝修饰后 的聚醚醚酮(peek-linker)材料。反应过程如下式iv所示：
[0054][0055]
实施例2
[0056]
本实施例在于提供实施例1所得的经化学修饰的聚醚醚酮在作为dna合成载体 中的应用：
[0057]
(1)dna的合成：采用abi 8909dna合成仪，将实施例1所得的经化学修饰 的聚醚醚酮置于鲁尔接头中，设置tca法亚磷酰胺合成程序，进行自动dna合成。
[0058]
其中，合成程序如下表1所示：
[0059]
表1，合成程序1
[0060]
[0061][0062]
(2)合成dna的后处理及质检
[0063]
合成结束后的peek材料从abi 8909dna合成仪上取出，放置于500μl氨水中 进行脱保护和切割处理，70℃下2小时后取出。将氨水溶液吸出，加入1.5ml冰乙醇 溶液，加入50μl醋酸钠(3m溶度)，待合成产物析出后，进行6000g离心，弃上清。 加入80％乙醇水溶液，震荡清洗沉淀物。再次离心后，重复清洗一遍。最终沉淀于60℃ 干燥5分钟。干燥好的合成产物用10mm triscl溶液溶解，用nanodrop仪测得浓度为 15ng/μl，产物共120pmol。其page变性胶电泳法质检和hplc质检结果分别如图1 和图2所示。
[0064]
对比例1
[0065]
对比例1与实施例2相比，区别在于对比例1采用现有载体多空玻璃珠(cpg) 材料进行dna合成，其合成产物用安捷伦2100生物分析质检结果如图3所示。
[0066]
对比例2
[0067]
对比例2与实施例1相比，区别在于对比例2采用未修饰的peek材料进行dna 合成，结果如图3所示(未修饰的peek材料，不能做为dna合成的载体)。
[0068]
对比例3
[0069]
对比例3与实施例1相比，区别在于对比例2采用聚苯硫醚(pps)材料进行dna 合成，结果如图3所示(聚苯硫醚材料，不能做为dna合成的载体)。
[0070]
由图2可知，未修饰的peek材料和聚苯硫醚材料均不能作伪dna合成的载体。
[0071]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术 人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书 所限定的范围。
技术特征：
1.聚醚醚酮在作为dna合成载体中的应用，其特征在于，所述聚醚醚酮为经化学修饰的聚醚醚酮，具有以下式i所示的结构式：式中，n为200-500之间的整数。2.根据权利要求1所述聚醚醚酮在作为dna合成载体中的的应用，其特征在于，所述经化学修饰的聚醚醚酮的制备方法包括以下步骤：s1，羟基修饰：以二甲基亚砜为溶剂，硼氢化钠为还原剂，在100-140℃下与聚醚醚酮反应3h得到羟基修饰的聚醚醚酮；s2，异氰酸酯基团修饰：在室温下，以甲苯为溶剂，三乙烯二胺为碱，将步骤s1所得的羟基修饰的聚醚醚酮与4，4-二环己基甲烷二异氰酸酯在氮气氛围中反应3天，得到异氰酸酯基团修饰的聚醚醚酮；s3，氨基修饰：在室温条件下，将步骤s2所得的经异氰酸酯基团修饰的聚醚醚酮与氢氧化钠在1，4-二氧六环中反应得到氨基修饰的聚醚醚酮；s4，linker接枝：在室温下，将步骤s3所得的经氨基修饰的聚醚醚酮与linker在含有2-(7-氮杂苯并三氮唑)-n,n,n’,n
’‑
四甲基脲六氟磷酸酯、n,n-二异丙基乙胺的乙腈溶液中反应过夜，得到linker接枝的聚醚醚酮。3.根据权利要求2所述聚醚醚酮在作为dna合成载体中的的应用，其特征在于，步骤s1中，聚醚醚酮的表面积为200cm2。4.根据权利要求2所述聚醚醚酮在作为dna合成载体中的的应用，其特征在于，步骤s1中，所述聚醚醚酮、硼氢化钠和二甲基亚砜按质量体积比如下：聚醚醚酮：硼氢化钠：二甲基亚砜＝0.5g:0.1g:50ml。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤s2中，所述羟基修饰的聚醚醚酮、三乙烯二胺、4，4-二环己基甲烷二异氰酸酯与甲苯按质量体积比如下：羟基修饰的聚醚醚酮：三乙烯二胺：4，4-二环己基甲烷二异氰酸酯：甲苯＝0.5g:2.15mg:1ml:19ml。6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤s3中，所述经异氰酸酯基团修饰的聚醚醚酮、氢氧化钠与1，4-二氧六环按质量比如下：经异氰酸酯基团修饰的聚醚醚酮：氢氧化钠：1，4-二氧六环＝0.5:1:1。7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤s4中，经氨基修饰的聚醚醚酮、linker、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-n,n,n’,n
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四甲基脲六氟磷所述酸酯、n,n-二异丙基乙胺和乙腈按质量体积比如下：经氨基修饰的聚醚醚酮：linker：2-(7-氮杂苯并三氮唑)-n,n,n’,n
’‑
四甲基脲六氟磷酸酯：n,n-二异丙基乙胺：乙腈＝500mg:200mg:160mg:400ul。8.一种dna的合成方法，其特征在于，包括利用权利要求1所述的经化学修饰的聚醚醚酮作为载体进行dna合成的步骤。
9.根据权利要求7所述的dna的合成方法，其特征在于，所述方法具体如下：将所述经化学修饰的聚醚醚酮置于dna合成仪的鲁尔接头中，设置tca法亚磷酰胺合成程序，进行自动dna合成。
技术总结
本发明公开了聚醚醚酮在作为DA合成载体中的应用，所述聚醚醚酮为经化学修饰的聚醚醚酮，具有以下式I所示的结构式：式中，n为200-500之间的整数。本发明所提供的经化学修饰的聚醚醚酮可以作为DA合成载体用于DA合成，丰富了DA合成载体材料的种类。本发明所提供的DA合成载体为经化学修饰的聚醚醚酮，所用聚醚醚酮廉价易得，制备方法简单。制备方法简单。
