一株降解四溴双酚A的嗜麦芽窄食单胞菌及其应用的制作方法
一株降解四溴双酚a的嗜麦芽窄食单胞菌及其应用
技术领域
1.本发明涉及微生物领域，更具体地，涉及嗜麦芽窄食单胞菌在降解四溴双酚a中的应用。
背景技术：
2.四溴双酚a(tetrabromobisphenol a，tbbpa)是一种溴代芳香族化合物，由双酚a(bpa)溴化合成，为灰白粉末，是溴代阻燃剂的典型代表，阻燃剂常用于电器、家具、纺织等材料中的添加型阻燃剂，应用非常广泛。当含tbbpa的产品在生产、使用以及废弃回收处理过程中，tbbpa从这些产品中逃逸挥发并进入周围环境中，在室温下具有热稳定性和亲脂性强的特点，熔点184℃，沸点为316℃，240℃左右开始分解。可溶于甲醇、乙醇和丙酮等有机溶剂，亦可溶于氧氧化钠水溶液。但微溶于水，由于其低水溶性、高脂溶性的特点，极易在土壤、河流底泥及污泥等环境样品中累积。
3.目前已发现tbbpa在全球各种环境介质、生物体及人体内被广泛检出。相关毒理研究表明，tbbpa对动植物细胞具有毒性，特别对动物显示出包括甲状腺激素干扰、神经毒性、肝脏和肾脏毒性、免疫毒性、雌雄性干扰等广泛的致毒效应。
4.tbbpa具有疏水性和持久性的特点，目前污染物环境修复可以用非生物方式和生物方式。生物降解也是天然环境中去除有机污染物一种重要途径，是利用生物对环境污染物的吸收、代谢和降解等功能，加速去除环境中污染物的过程。因其能耗低、效率高、工艺过程简单并无二次污染等优点而被广泛而深入的研究，成为污染环境修复很有前途的方法。
技术实现要素：
5.本技术提供了一种嗜麦芽窄食单胞菌在四溴双酚a污染土壤或水体治理中的应用。
6.本发明提供的菌株表现出比较强的去除低浓度tbbpa的性能，可用于tbbpa污染的水体和土壤的生物修复。
附图说明
7.图1是嗜麦芽窄食单胞菌(stenotrophomonas maltophilia.)在mha培养基上的形态图。
8.图2是嗜麦芽窄食单胞菌(stenotrophomonas maltophilia.)在无机盐培养基上的形态图。
9.图3是嗜麦芽窄食单胞菌(stenotrophomonas maltophilia.)在显微镜(10*100)下的形态。
10.图4示出了菌株mpeb0011984 16s rdna序列系统发育树。
11.图5示出了不同ph值下培养16h的菌株od值。
12.图6示出了菌体添加量对tbbpa降解率的影响。
13.图7示出了tbbpa的初始浓度对tbbpa降解率的影响。
14.本发明提供的去除tbbpa的菌，属于黄单胞菌目的黄单胞菌科，为嗜麦芽窄食单胞菌stenotrophomonas maltophilia mpeb0011984，分类学名称为stenotrophomonas maltophilia，于2022年6月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏号为：gdmcc no：62558；保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
具体实施方式
15.下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
16.本发明提供了一株嗜麦芽窄食单胞菌(stenotrophomonas maltophilia.)，该菌分离自广东清远电子厂周边土壤。
17.mhb培养基：酪蛋白水解物17.5g，牛肉浸粉5.0g，淀粉1.5g，无菌水定容至1l，调节ph至7.2，固体培养基(mha)在mhb的基础上加琼脂15g。
18.无机盐液体培养基成分为：葡萄糖3g；nacl-0.2g；cacl
2-0.015g；(nh4)so
4-1g；mgso
4.
7h2o-0.2g；feso
4-0.01g；mnso
4-0.01g；k2hp04-3g；kh2p0
4-1.5g；加水到1l。无机盐固体培养基：每升液体培养基中加琼脂15-20g。
19.首先用无机盐培养基(msl)对沉积物进行富集培养，本发明的嗜麦芽窄食单胞菌的分离方法包括如下步骤：
20.取5g土壤加入装有30ml无机盐培养基的50ml离心管中，添加tbbpa至10mg/l，放置摇床，25℃，120rpm培养7天后。按体积比为10％比例转接至新的浓度为30mg/l无机盐培养基中，培养7天后转入tbbpa的50mg/l的无机盐培养液中，培养7天后再次转接至浓度更高的tbbpa溶液中，直至tbbpa的浓度为100mg/l，获得稳定的无泥tbbpa降解混菌体系。取1ml上述的无泥tcep降解混菌体系，稀释10倍后用无机盐培养基进行梯度稀释后，在100mg/l tbbpa的msl平板上涂布，将涂布后的平板放置25℃培养。待菌落长出后，挑取单菌。将纯化的单菌落在mhb溶液中培养，25℃培养过夜，取菌液与50％的甘油水溶液以1：1混合，-80℃条件下保藏。
21.经过分离纯化，筛选得到菌株，菌株编号为mpeb0011984。菌株mpeb0011984的特征描述如下：
22.形态：该菌株在mha(牛肉粉6g/l，可溶性淀粉1.5g/l，酸水解酪蛋白17.5g/l，琼脂17g/l，ph 7.3)平板上35℃培养24h观察菌落呈淡黄，表面光滑，有光泽(图1)；该菌株在无机盐平板上35℃，培养24h观察菌落呈透明，表面光滑，无光泽(图2)；菌株的个体呈杆状，两端钝圆，不规则分散排列(图3)；对该菌株进行革兰氏染，显示为革兰氏阴性菌。
23.16s分析：从本发明所述菌株纯培养物中提取基因组dna，利用通用软件27f和1492r进行扩增和测序，进一步通过mega软件构建系统进化树(图4)。结果显示该菌为嗜麦芽窄食单胞菌(stenotrophomonas maltophilia.)。
24.菌株抗生素抗性反应(表1)，结果显示菌株对氯霉素、头孢他啶、替加环素、环丙沙星、左氧氟沙星都敏感。
25.表1
26.抗生素抗性结果
氯霉素s头孢他啶s替加环素s环丙沙星s左氧氟沙星s
27.ph值对菌株生长的影响：将活化16h的细菌以6％的接种量加在ph＝3-11的溶液中的mhb中，所有样品分成3份，150rpm摇床培养16h。用分光光度计检测，培养基校零。ph在5-9时细菌生长差值较小，ph在4以下时细菌无法生长，如图5所示。
28.菌株对tbbpa的降解效果
29.菌悬液的制备：将甘油保存的菌株取1环至mha上划线培养1天，挑取单菌落于mhb溶液中，在35℃、160r/min中培养16小时，制备为种子液。在mhb培养基中按2％的接种量接入mpeb0011984的种子液，35℃，150rpm恒温摇床培养18h。8000r/min离心10min收集菌体，用超纯水洗涤菌体3次，将湿菌体作为生物吸附剂。
30.菌株的吸附能力计算：菌株对tbbpa的降解率r的计算方法：
[0031][0032]
其中，r为tbbpa的降解率，c0为tbbpa的初始浓度(mg/l)，ce为平衡时溶液中tbbpa的浓度(mg/l)。
[0033]
将tbbpa溶液配置成下表的浓度。将湿菌体以2％的体积比加入含tbbpa的无机盐溶液中。35℃、150rpm恒温摇床培养5d。离心取上清，测定tbbpa的降解率。检测方法为：hplc-1260高效液相谱检测(安捷伦公司，uv-vis检测器)。高效液相谱(hplc)测量tbbpa浓度的仪器条件见下表2：
[0034]
表2
[0035][0036]
菌体添加量的影响：在无机盐溶液中，菌株对初始浓度为20mg/l的tbbpa的降解率能达到100％。且添加量为2％和4％的情况下，其去除效果均为100％，如图6所示。因此选择添加量为2％的体积浓度。
[0037]
初始浓度的影响：菌株对初始浓度为20mg/l的tbbpa的降解率能达到100％。tbbpa浓度为60mg/l时，降解率也达到64％。有较好的降解效果。菌株对浓度在20mg/l以下的tbbpa的降解效率是最高的。
[0038]
因此，本发明提供的菌株在35℃、150rpm恒温摇床培养5d的情况下，对20mg/l以及以下浓度的tbbpa的降解率能达到100％，在tbbpa的浓度达到60mg/l时，其对tbbpa的降解率也达到60％以上。
[0039]
本领域技术人员应理解，以上实施例仅是示例性实施例，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以进行多种变化、替换以及改变。
技术特征：
1.嗜麦芽窄食单胞菌在四溴双酚a污染土壤或水体治理中的应用。
技术总结
本申请提供了一株降解四溴双酚A的嗜麦芽窄食单胞菌及其应用，提供了嗜麦芽窄食单胞菌在四溴双酚A污染土壤或水体治理中的应用。本发明提供的菌株表现出比较强的去除TBBPA的性能，可用于TBBPA污染的水体和土壤的生物修复。可用于TBBPA污染的水体和土壤的生物修复。可用于TBBPA污染的水体和土壤的生物修复。
