一种长双歧杆菌的高活菌数有氧发酵方法
1.本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种长双歧杆菌的高活菌数有氧发酵方法。
背景技术：
2.双歧杆菌是法国学者tissier首次从母乳喂养的婴儿粪便中分离得到的，经过国内外许多学者研究发现双歧杆菌可以促进人体发育，提高人体免疫力，减缓衰老和抗肿瘤等方面充当重要角，在维持肠道微生态平衡中起着至关重要的作用，并发挥多种益生效果。其中，长双歧杆菌是在婴儿粪便和成人的肠道微生物中发现先的最常见的双歧杆菌物种，在人体健康中也发挥着重要作用，例如调节肠道平衡、便秘、降低胆固醇、抑制肠道中病原菌的生长等的生理功能。
3.虽然长双歧杆菌菌体及代谢产物已广泛应用于各个领域，包括食品、保健品、化妆品等，但由于长双歧杆菌对氧极为敏感，在有氧条件下容易失活，很难进行有氧发酵。要实现其大规模发酵培养，就需要严格控制环境中的含氧量，这就大大提高了工业化规模发酵双歧杆菌制品的困难，并且人体内的长双歧杆菌必须要达到一定数量之后，才能发挥其益生作用，产品中的长双歧杆菌在活菌数必须达到在106cfu/ml以上。因此，如何提高产品中长双歧杆菌活菌数，确保其能够人体肠道内定殖从而发挥益生作用成为目前较为重要的待解决的问题。
4.其中，一些研究人员针对上述问题进行了研究，例如专利cn102021162a公开了一种高活性双歧杆菌菌粉的制备方法，该专利制成的双歧杆菌菌粉活菌含量高，并且耐胃酸和胆盐能力强，可以有效定殖肠道发挥疗效，其中长双歧杆菌的发酵液可达1.5
×
10
10
cfu/ml。但是，其发酵培养控制条件是在厌氧状态下进行的，大大提高了工业生产的成本，加大了操作和工业化大规模发酵的难度。而专利cn1114354公开了一种双歧杆菌在中药培养基有氧发酵的方法，改变双歧杆菌过去的厌氧发酵为有氧发酵，菌株生长正常，减少了工业生产的投资，降低了生产成本。但是，其操作太过繁琐，费时，经过有氧发酵后，活菌数仍然较低，仅为108cfu/ml。
技术实现要素：
5.本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种长双歧杆菌的高活菌数有氧发酵方法。
6.本发明的目的通过下述技术方案实现：
7.一种长双歧杆菌的高活菌数有氧发酵方法，是将长双歧杆菌活化后连续传代，取最后一次传代的菌液依次在液深15～20cm、10～15cm、6～12cm的培养基中进行如下发酵培养；
8.(1)接种到a培养基中，密封完全状态下，35～37℃发酵培养12～24h；
9.(2)接种到a培养基中，半密封状态下，35～37℃发酵培养12～24h；
10.(3)接种到b培养基中，35～37℃有氧发酵培养12～24h；
11.上述操作视为一轮有氧发酵，如此重复5～10轮；
12.其中，所述的a培养基为含有2.0～10.0g/l麦角硫因提取液、0.2～1.0g/l维生素c和0.05～0.5g/l l-半胱氨酸盐酸盐的mrs培养基；
13.所述的b培养基为含有2.0～10.0g/l麦角硫因提取液和0.2～1.0g/l维生素c的mrs培养基。
14.优选的，所述的长双歧杆菌的高活菌数有氧发酵方法是将长双歧杆菌活化后连续传代5～10代，取最后一次传代的菌液依次在液深16cm、13cm、10cm的培养基中进行所述发酵培养。
15.优选的，所述的密封完全状态是指：接种到装有a培养基的螺口试管中，拧紧盖子，并封加一层灭菌液体石蜡。
16.优选的，所述的半密封状态是指：接种到装有a培养基的螺口试管中，拧松盖子，不封加一层灭菌液体石蜡。
17.优选的，所述的a培养基为含有2.0～7.0g/l麦角硫因提取液、0.2～0.8g/l维生素c和0.05～0.5g/l l-半胱氨酸盐酸盐的mrs培养基。
18.进一步优选的，所述的a培养基为含有7.0g/l麦角硫因提取液、0.8g/l维生素c和0.5g/l l-半胱氨酸盐酸盐的mrs培养基。
19.最优选的，所述的a培养基配方如下：以1l体系计，其含有葡萄糖15.0～25.0g、蛋白胨2.0～15.0g、酵母浸粉2.0～14.0g、牛肉浸膏5.0～15.0g、l-半胱氨酸盐酸盐0.05～0.5g、磷酸氢二钾1.0～5.0g、无水乙酸钠2.0～10.0g、七水硫酸镁0.1～0.5g、柠檬酸氢二铵1.0～5.0g、吐温80 0.5～1.5ml、麦角硫因提取液2.0～10.0g维生素c 0.2～1.0g，ph6.4～7.2。
20.优选的，所述的b培养基为含有2.0～7.0g/l麦角硫因提取液和0.2～0.8g/l维生素c的mrs培养基。
21.进一步优选的，所述的b培养基为含有7.0g/l麦角硫因提取液和0.8g/l维生素c的mrs培养基。
22.最优选的，所述的b培养基配方如下：以1l体系计，其含有葡萄糖15.0～25.0g、蛋白胨2.0～15.0g、酵母浸粉2.0～14.0g、牛肉浸膏5～15g、磷酸氢二钾1.0～5.0g、无水乙酸钠2.0～10.0g、七水硫酸镁0.1～0.5g、柠檬酸氢二铵1.0～5.0g、吐温80 0.5～1.5ml、麦角硫因提取液2.0～10.0g、维生素c 0.2～1.0g，ph6.4～7.2。
23.优选的，所述的长双歧杆菌的高活菌数有氧发酵方法包括如下步骤：
24.步骤1：取最后一次传代的菌液按照5％的接种量接种到装有液深16cm a培养基的螺口试管中，拧紧盖子，并封加一层灭菌液体石蜡，密封完全状态下37℃发酵培养18h；
25.步骤2：按5％的接种量接种到装有液深16cm a培养基的螺口试管中，拧松盖子，不封加液体石蜡，半密封状态下35℃发酵培养18h；
26.步骤3：按5％的接种量接种到装有液深16cmb培养基的螺口试管中，37℃有氧发酵18h；
27.步骤4：按5％的接种量接种到装有液深13cm a培养基的螺口试管中，拧紧盖子，并封加一层灭菌液体石蜡，密封完全状态下37℃发酵培养18h；
28.步骤5：按5％的接种量接种到装有液深13cm a培养基的螺口试管中，拧松盖子，不封加液体石蜡，半密封状态下35℃发酵培养18h；
29.步骤6：按5％的接种量接种到装有液深13cm b培养基的螺口试管中，35℃有氧发酵18h；
30.步骤7：按5％的接种量接种到装有液深10cm a培养基的螺口试管中，拧紧盖子，并封加一层灭菌液体石蜡，密封完全状态下37℃发酵培养18h；
31.步骤8：按5％的接种量接种到装有液深10cma培养基的螺口试管中，拧松盖子，不封加液体石蜡，半密封状态下35℃发酵培养18h；
32.步骤9；按5％的接种量接种到装有液深10cmb培养基的螺口试管中，35℃有氧发酵18h。
33.优选的，所述的长双歧杆菌活化的操作为：取长双歧杆菌菌液在mrsc固体培养基平板上划线分离，厌氧培养24～48h，待平板上长出单菌落，将单菌落接种在mrsc液体培养基中厌氧培养24～48h；取菌液按2～10％的接种量进行传代，厌氧条件下，反复传代5～10代，得到活化的菌液。
34.进一步优选的，所述的长双歧杆菌活化的操作为：取长双歧杆菌菌液在mrsc固体培养基平板上划线分离，厌氧培养32h，待平板上长出单菌落，将单菌落接种在mrsc液体培养基中厌氧培养24h；取菌液按5％的接种量进行传代，厌氧条件下，反复传代6代，得到活化的菌液。
35.优选的，所述的麦角硫因提取液为灵芝的麦角硫因提取液。
36.进一步优选的，所述的麦角硫因提取液通过如下方法制备得到：
37.a.从灵芝种子液中吸取菌液至无菌含有玻璃珠psb培养基中，28
±
2℃，150
±
50r/min培养10
±
2天；
38.b.收取菌丝，冲洗，冷冻干燥36
±
5h；
39.b.准确称取干燥后菌丝体0.1g，研磨粉碎，加入三级水10ml，300
±
50w超声提取10
±
2min；提取后置于65
±
5℃水浴30
±
2min，使用过滤法收集上清液4ml，加入70％乙醇8ml和1％sds溶液2ml，4
±
1℃静置12
±
2h；将静置后溶液常温8000
±
100r/min，15
±
2min离心，取上清；使用氮吹仪，85
±
5℃，氮吹至4ml以下，使用三级水定容样品至4ml；
40.c.取出预处理后大孔树脂抽滤收集，向样品液中加入1g，置于摇床30
±
2℃，150
±
50r/min震荡4
±
2h，可得所述的麦角硫因提取液。
41.一种长双歧杆菌，通过上述方法制备得到。
42.上述长双歧杆菌在益生菌制品领域中的应用。
43.本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
44.(1)与现有的技术相比，本发明提供了一种长双歧杆菌的高活菌数有氧发酵方法，改变了长双歧杆菌传统厌氧发酵方式的同时，解决了长双歧杆菌在有氧发酵时活菌数低的问题。gb7101-2015《食品安全国家标准饮料》中规定的活菌饮料中活菌数要大于106cfu/ml，而通过本发明长双歧杆菌菌株在有氧条件下进行发酵，可达到10
10-10
11
cfu/ml之间，活菌数比国家标准至少高一万倍，可大幅度减少工业化发酵成本，简化生产流程。
45.(2)相对于传统的长双歧杆菌需要添加氮气、二氧化碳等惰性气体发酵而言，本发明方法无需添加额外的惰性气体；同时相对于现有的长双歧杆菌有氧发酵方法而言，操作
更简单，耗时更短，大大降低了生产成本，简化了工艺流程，有利于长双歧杆菌的大规模工业化发酵生产，具有巨大的商业化应用价值。
46.(3)通过本发明方法驯化的长双歧杆菌能够在常规有氧环境下生长，在常规培养条件下活菌高于109cfu/ml。在实际应用过程中，能够大幅降低对生产设备、产品包装和消费过程的厌氧需求，在益生菌制品领域具有广泛的应用前景。
附图说明
47.图1是实施例4获得的长双歧杆菌与空白对照组有氧发酵32h od
600
值的变化比较图。
具体实施方式
48.下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
49.下述实施例中采用的长双歧杆菌菌株购自加拿大拉曼公司，菌株编号为r175；
50.下述实施例中采用的麦角硫因提取液是从高产麦角硫因的灵芝菌株fq23(已在中国发明专利申请202010120380.8中公开)中提取所得，具体制备方法为：
51.(1)灵芝菌丝的培养：取灵芝种子液接种于含100ml psb培养基的250ml的三角瓶中，接种量为5％，置于摇床，28℃，150r/min培养10天。
52.(2)预处理大孔树脂：称取大孔树脂nka-9适量，使用无水乙醇浸泡4h以上。使用三级水冲洗大孔树脂至无明显醇味，同时静置后水呈澄清透明，抽滤收集大孔树脂，使用1mhcl浸泡大孔树脂4h以上。使用三级水冲洗大孔树脂至冲洗液ph呈中性，抽滤收集大孔树脂，使用1m naoh浸泡大孔树脂4h以上。使用三级水冲洗大孔树脂至冲洗液ph呈中性，抽滤收集大孔树脂，加入一级水，于4℃保存。
53.(3)灵芝菌丝体收集及处理：摇瓶培养10天后使用纱布过滤收集菌丝，并用50ml蒸馏水冲洗，将菌丝移至培养皿中，冷冻干燥36h。称取干燥后菌丝体0.1g(精确至万分之一)，研磨粉碎，加入三级水10ml，300w超声提取10min。提取后置于65℃水浴30min，使用过滤法收集上清液4ml，加入70％乙醇8ml和1％sds溶液2ml，4℃静置12h。
54.(4)将静置后溶液常温离心8000r/min，15min，取上清。使用氮吹仪，85℃，氮吹至4ml以下，使用三级水定容样品至4ml，取出预处理后大孔树脂抽滤收集，向样品液中加入1g，置于摇床30℃，150r/min震荡4h，可得提取纯化后提取液。
55.1、配置，分装100ml，加入20颗玻璃珠，115℃灭菌30min。从灵芝菌株平板上切取大小约为0.5
×
0.5cm的菌丝块，接种至psb培养基中，控制接种量为5％，置于摇床，28℃，150r/min培养4天，获得种子液。
56.2、从种子液中吸取菌液至新的已分装好的无玻璃珠psb培养基中，控制每个菌株设置3平行。
57.实施例1
58.(1)长双歧杆菌的培养：
59.菌株活化：在mrsc固体培养基平板上，将保存的长双歧杆菌菌液划线分离，厌氧培养32h，待平板上长出单菌落，将单菌落接种在mrsc液体培养基中并封加一层灭菌液体石
蜡，厌氧培养24h；按5％的接种量进行传代，厌氧条件下，反复传代6代，得到活化的菌液。
60.(2)培养基的配制：
61.a培养基：葡萄糖20.0g、蛋白胨10.0g、酵母浸粉5.0g、牛肉浸膏10.0g、l-半胱氨酸盐酸盐0.5g、磷酸氢二钾2.0g、无水乙酸钠5.0g、七水硫酸镁0.2g、柠檬酸氢二铵2.0g、吐温80 1.0ml、麦角硫因提取液2.0ml、维生素c 0.2g，加水定容至1000ml，调节ph6.8，121℃灭菌15min。
62.b培养基：葡萄糖20.0g、蛋白胨10.0g、酵母浸粉5.0g、牛肉浸膏10.0g、磷酸氢二钾2.0g、无水乙酸钠5.0g、七水硫酸镁0.2g、柠檬酸氢二铵2.0g、吐温80 1.0ml、麦角硫因提取液2.0ml、维生素c 0.2g，加水定容至1000ml，调节ph6.8，121℃灭菌15min。
63.(3)长双歧杆菌的有氧发酵：
64.步骤1：取最后一次传代的菌液按照5％的接种量接种到装有液深16cm a培养基的螺口试管中，拧紧盖子，并封加一层灭菌液体石蜡，密封完全状态下37℃发酵培养18h；
65.步骤2：按5％的接种量接种到装有液深16cm a培养基的螺口试管中，拧松盖子，不封加液体石蜡，半密封状态下35℃发酵培养18h；
66.步骤3：按5％的接种量接种到装有液深16cm b培养基的螺口试管中，37℃有氧发酵18h；
67.步骤4：按5％的接种量接种到装有液深13cm a培养基的螺口试管中，拧紧盖子，并封加一层灭菌液体石蜡，密封完全状态下37℃发酵培养18h；
68.步骤5：按5％的接种量接种到装有液深13cm a培养基的螺口试管中，拧松盖子，不封加液体石蜡，半密封状态下35℃发酵培养18h；
69.步骤6：按5％的接种量接种到装有液深13cm b培养基的螺口试管中，35℃有氧发酵18h；
70.步骤7：按5％的接种量接种到装有液深10cm a培养基的螺口试管中，拧紧盖子，并封加一层灭菌液体石蜡，密封完全状态下37℃发酵培养18h；
71.步骤8：按5％的接种量接种到装有液深10cm a培养基的螺口试管中，拧松盖子，不封加液体石蜡，半密封状态下35℃发酵培养18h；
72.步骤9；按5％的接种量接种到装有液深10cm b培养基的螺口试管中，35℃有氧发酵18h；
73.以上步骤1～9步视为一轮有氧发酵，如此驯化5轮。
74.发酵结束后，测量长双歧杆菌活菌数结果如表1所示。
75.取发酵结束后的长双歧杆菌，按5％接种量，接种到装有液深10cm的b培养基的螺口试管中，35℃有氧发酵18h；培养基中，37℃有氧发酵18h，测od
600
值。
76.实施例2
77.(1)长双歧杆菌的培养：
78.菌株活化：在mrsc固体培养基平板上，将保存的长双歧杆菌菌液划线分离，厌氧培养32h，待平板上长出单菌落，将单菌落接种在mrsc液体培养基中并封加一层灭菌液体石蜡，厌氧培养24h；按5％的接种量进行传代，厌氧条件下，反复传代6代，得到活化的菌液。
79.(2)培养基的配制：
80.a培养基：葡萄糖20.0g、蛋白胨10.0g、酵母浸粉5.0g、牛肉浸膏10.0g、l-半胱氨酸
盐酸盐0.5g、磷酸氢二钾2.0g、无水乙酸钠5.0g、七水硫酸镁0.2g、柠檬酸氢二铵2.0g、吐温80 1.0ml、麦角硫因提取液4.0ml，维生素c 0.5g，加水定容至1000ml，调节ph6.8，121℃灭菌15min。
81.b培养基：葡萄糖20.0g、蛋白胨10.0g、酵母浸粉5.0g、牛肉浸膏10.0g、磷酸氢二钾2.0g、无水乙酸钠5.0g、七水硫酸镁0.2g、柠檬酸氢二铵2.0g、吐温80 1.0ml、麦角硫因提取液4.0ml维生素c 0.5g，加水定容至1000ml，调节ph6.8，121℃灭菌15min。
82.(3)长双歧杆菌的有氧发酵：
83.步骤1：取最后一次传代的菌液按照5％的接种量接种到装有液深16cm a培养基的螺口试管中，拧紧盖子，并封加一层灭菌液体石蜡，密封完全状态下37℃发酵培养18h；
84.步骤2：按5％的接种量接种到装有液深16cm a培养基的螺口试管中，拧松盖子，不封加液体石蜡，半密封状态下35℃发酵培养18h；
85.步骤3：按5％的接种量接种到装有液深16cm b培养基的螺口试管中，37℃有氧发酵18h；
86.步骤4：按5％的接种量接种到装有液深13cm a培养基的螺口试管中，拧紧盖子，并封加一层灭菌液体石蜡，密封完全状态下37℃发酵培养18h；
87.步骤5：按5％的接种量接种到装有液深13cm a培养基的螺口试管中，拧松盖子，不封加液体石蜡，半密封状态下35℃发酵培养18h；
88.步骤6：按5％的接种量接种到装有液深13cm b培养基的螺口试管中，35℃有氧发酵18h；
89.步骤7：按5％的接种量接种到装有液深10cm a培养基的螺口试管中，拧紧盖子，并封加一层灭菌液体石蜡，密封完全状态下37℃发酵培养18h；
90.步骤8：按5％的接种量接种到装有液深10cm a培养基的螺口试管中，拧松盖子，不封加液体石蜡，半密封状态下35℃发酵培养18h；
91.步骤9；按5％的接种量接种到装有液深10cm b培养基的螺口试管中，35℃有氧发酵18h；
92.以上步骤1～9步视为一轮有氧发酵，如此驯化5轮。
93.发酵结束后，测量长双歧杆菌活菌数结果如表1所示。
94.取发酵结束后的长双歧杆菌，按5％接种量，接种到装有液深10cm的b培养基的螺口试管中，35℃有氧发酵18h；培养基中，37℃有氧发酵18h，测od
600
值。
95.实施例3
96.(1)长双歧杆菌的培养：
97.菌株活化：在mrsc固体培养基平板上，将保存的长双歧杆菌菌液划线分离，厌氧培养32h，待平板上长出单菌落，将单菌落接种在mrsc液体培养基中并封加一层灭菌液体石蜡，厌氧培养24h；按5％的接种量进行传代，厌氧条件下，反复传代6代，得到活化的菌液。
98.(2)培养基的配制：
99.a培养基：葡萄糖20.0g、蛋白胨10.0g、酵母浸粉5.0g、牛肉浸膏10.0g、l-半胱氨酸盐酸盐0.5g、磷酸氢二钾2.0g、无水乙酸钠5.0g、七水硫酸镁0.2g、柠檬酸氢二铵2.0g、吐温80 1.0ml、麦角硫因提取液6.0ml维生素c 0.8g，加水定容至1000ml，调节ph6.8，121℃灭菌15min。
100.b培养基：葡萄糖20.0g、蛋白胨10.0g、酵母浸粉5.0g、牛肉浸膏10.0g、磷酸氢二钾2.0g、无水乙酸钠5.0g、七水硫酸镁0.2g、柠檬酸氢二铵2.0g、吐温80 1.0ml、麦角硫因提取液6.0ml维生素c 0.8g，加水定容至1000ml，调节ph6.8，121℃灭菌15min。
101.(3)长双歧杆菌的有氧发酵：
102.步骤1：取最后一次传代的菌液按照5％的接种量接种到装有液深16cm a培养基的螺口试管中，拧紧盖子，并封加一层灭菌液体石蜡，密封完全状态下37℃发酵培养18h；
103.步骤2：按5％的接种量接种到装有液深16cm a培养基的螺口试管中，拧松盖子，不封加液体石蜡，半密封状态下35℃发酵培养18h；
104.步骤3：按5％的接种量接种到装有液深16cm b培养基的螺口试管中，37℃有氧发酵18h；
105.步骤4：按5％的接种量接种到装有液深13cm a培养基的螺口试管中，拧紧盖子，并封加一层灭菌液体石蜡，密封完全状态下37℃发酵培养18h；
106.步骤5：按5％的接种量接种到装有液深13cm a培养基的螺口试管中，拧松盖子，不封加液体石蜡，半密封状态下35℃发酵培养18h；
107.步骤6：按5％的接种量接种到装有液深13cm b培养基的螺口试管中，35℃有氧发酵18h；
108.步骤7：按5％的接种量接种到装有液深10cm a培养基的螺口试管中，拧紧盖子，并封加一层灭菌液体石蜡，密封完全状态下37℃发酵培养18h；
109.步骤8：按5％的接种量接种到装有液深10cm a培养基的螺口试管中，拧松盖子，不封加液体石蜡，半密封状态下35℃发酵培养18h；
110.步骤9；按5％的接种量接种到装有液深10cm b培养基的螺口试管中，35℃有氧发酵18h；
111.以上步骤1～9步视为一轮有氧发酵，如此驯化5轮。
112.发酵结束后，测量长双歧杆菌活菌数结果如表1所示。
113.取发酵结束后的长双歧杆菌，按5％接种量，接种到装有液深10cm的b培养基的螺口试管中，35℃有氧发酵18h；培养基中，37℃有氧发酵18h，测od
600
值。
114.实施例4
115.(1)长双歧杆菌的培养：
116.菌株活化：在mrsc固体培养基平板上，将保存的长双歧杆菌菌液划线分离，厌氧培养32h，待平板上长出单菌落，将单菌落接种在mrsc液体培养基中并封加一层灭菌液体石蜡，厌氧培养24h；按5％的接种量进行传代，厌氧条件下，反复传代6代，得到活化的菌液。
117.(2)培养基的配制：
118.a培养基：葡萄糖20.0g、蛋白胨10.0g、酵母浸粉5.0g、牛肉浸膏10.0g、l-半胱氨酸盐酸盐0.5g、磷酸氢二钾2.0g、无水乙酸钠5.0g、七水硫酸镁0.2g、柠檬酸氢二铵2g、吐温801.0ml、麦角硫因提取液7.0ml维生素c 0.8g，加水定容至1000ml，调节ph6.8，121℃灭菌15min。
119.b培养基：葡萄糖20.0g、蛋白胨10.0g、酵母浸粉5.0g、牛肉浸膏10.0g、磷酸氢二钾2.0g、无水乙酸钠5.0g、七水硫酸镁0.2g、柠檬酸氢二铵2.0g、吐温80 1.0ml、麦角硫因提取液7.0ml维生素c 0.8g，加水定容至1000ml，调节ph6.8，121℃灭菌15min。
120.(3)长双歧杆菌的有氧发酵：
121.步骤1：取最后一次传代的菌液按照5％的接种量接种到装有液深16cm a培养基的螺口试管中，拧紧盖子，并封加一层灭菌液体石蜡，密封完全状态下37℃发酵培养18h；
122.步骤2：按5％的接种量接种到装有液深16cm a培养基的螺口试管中，拧松盖子，不封加液体石蜡，半密封状态下35℃发酵培养18h；
123.步骤3：按5％的接种量接种到装有液深16cm b培养基的螺口试管中，37℃有氧发酵18h；
124.步骤4：按5％的接种量接种到装有液深13cm a培养基的螺口试管中，拧紧盖子，并封加一层灭菌液体石蜡，密封完全状态下37℃发酵培养18h；
125.步骤5：按5％的接种量接种到装有液深13cm a培养基的螺口试管中，拧松盖子，不封加液体石蜡，半密封状态下35℃发酵培养18h；
126.步骤6：按5％的接种量接种到装有液深13cm b培养基的螺口试管中，35℃有氧发酵18h；
127.步骤7：按5％的接种量接种到装有液深10cm a培养基的螺口试管中，拧紧盖子，并封加一层灭菌液体石蜡，密封完全状态下37℃发酵培养18h；
128.步骤8：按5％的接种量接种到装有液深10cm a培养基的螺口试管中，拧松盖子，不封加液体石蜡，半密封状态下35℃发酵培养18h；
129.步骤9；按5％的接种量接种到装有液深10cm b培养基的螺口试管中，35℃有氧发酵18h；
130.以上步骤1～9步视为一轮有氧发酵，如此驯化5轮。
131.发酵结束后，测量长双歧杆菌活菌数结果如表1所示。
132.取发酵结束后的长双歧杆菌，按5％接种量，接种到装有液深10cm的b培养基的螺口试管中，35℃有氧发酵18h；培养基中，37℃有氧发酵18h，测od
600
值。
133.取本实施例获得的长双歧杆菌，按2％接种量，接种到mrs培养基中，37℃有氧发酵，记录32h内od
600
值变化，结果如图1所示。对照组取的是原始长双歧杆菌，按2％接种量，接种到mrs培养基中，37℃有氧发酵。从图中可以看出本实验所得的驯化后的菌株在有氧发酵时生长明显优于空白对照组，且更快进入生长对数期。
134.对比例1
135.与实施例1相同，区别仅在于，a培养基和b培养基中只添加麦角硫因2.0g或者维生素0.2g。发酵结束后，测量长双歧杆菌活菌数。
136.对比例2
137.与实施例1相同，区别仅在于，a培养基和b培养基中只添加麦角硫因4.0g或者维生素0.5g。发酵结束后，测量长双歧杆菌活菌数。
138.对比例3
139.与实施例1相同，区别仅在于，a培养基和b培养基中只添加麦角硫因6.0g或者维生素0.8g。发酵结束后，测量长双歧杆菌活菌数。
140.对比例4
141.与实施例1相同，区别仅在于，a培养基和b培养基中只添加麦角硫因7.0g或者维生素0.8g。发酵结束后，测量长双歧杆菌活菌数。
142.对比例5
143.与实施例1相同，区别仅在于，a培养基和b培养基中未添加麦角硫因和维生素。发酵结束后，测量长双歧杆菌活菌数。
144.实施例1-4和对比例1-5的长双歧杆菌活菌数测量结果如下表1所示：
145.表1.长双歧杆菌活菌数测量结果
[0146][0147][0148]
实施例1-4和对比例1、5的长双歧杆菌有氧发酵18h od
600
值如下表2所示：
[0149]
表2.长双歧杆菌有氧发酵18h od
600
值
[0150][0151]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述的实施例
的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
技术特征：
1.一种长双歧杆菌的高活菌数有氧发酵方法，其特征在于：将长双歧杆菌活化后连续传代，取最后一次传代的菌液依次在液深15～20cm、10～15cm、6～12cm的培养基中进行如下发酵培养：(1)接种到a培养基中，密封完全状态下，35～37℃发酵培养12～24h；(2)接种到a培养基中，半密封状态下，35～37℃发酵培养12～24h；(3)接种到b培养基中，35～37℃有氧发酵培养12～24h；上述操作视为一轮有氧发酵，如此重复5～10轮；其中，所述的a培养基为含有2.0～10.0g/l麦角硫因提取液、0.2～1.0g/l维生素c和0.05～0.5g/l l-半胱氨酸盐酸盐的mrs培养基；所述的b培养基为含有2.0～10.0g/l麦角硫因提取液和0.2～1.0g/l维生素c的mrs培养基。2.根据权利要求1所述的长双歧杆菌的高活菌数有氧发酵方法，其特征在于：所述的长双歧杆菌的高活菌数有氧发酵方法是将长双歧杆菌活化后连续传代5～10代，取最后一次传代的菌液依次在液深16cm、13cm、10cm的培养基中进行所述发酵培养。3.根据权利要求1或2所述的长双歧杆菌的高活菌数有氧发酵方法，其特征在于：所述的密封完全状态是指：接种到装有a培养基的螺口试管中，拧紧盖子，并封加一层灭菌液体石蜡；所述的半密封状态是指：接种到装有a培养基的螺口试管中，拧松盖子，不封加一层灭菌液体石蜡。4.根据权利要求1或2所述的长双歧杆菌的高活菌数有氧发酵方法，其特征在于：所述的a培养基为含有2.0～7.0g/l麦角硫因提取液、0.2～0.8g/l维生素c和0.05～0.5g/l l-半胱氨酸盐酸盐的mrs培养基；所述的b培养基为含有2.0～7.0g/l麦角硫因提取液和0.2～0.8g/l维生素c的mrs培养基。5.根据权利要求1或2所述的长双歧杆菌的高活菌数有氧发酵方法，其特征在于：所述的长双歧杆菌的高活菌数有氧发酵方法包括如下步骤：步骤1：取最后一次传代的菌液按照5％的接种量接种到装有液深16cm a培养基的螺口试管中，拧紧盖子，并封加一层灭菌液体石蜡，密封完全状态下37℃发酵培养18h；步骤2：按5％的接种量接种到装有液深16cm a培养基的螺口试管中，拧松盖子，不封加液体石蜡，半密封状态下35℃发酵培养18h；步骤3：按5％的接种量接种到装有液深16cmb培养基的螺口试管中，37℃有氧发酵18h；步骤4：按5％的接种量接种到装有液深13cm a培养基的螺口试管中，拧紧盖子，并封加一层灭菌液体石蜡，密封完全状态下37℃发酵培养18h；步骤5：按5％的接种量接种到装有液深13cm a培养基的螺口试管中，拧松盖子，不封加液体石蜡，半密封状态下35℃发酵培养18h；步骤6：按5％的接种量接种到装有液深13cm b培养基的螺口试管中，35℃有氧发酵18h；步骤7：按5％的接种量接种到装有液深10cm a培养基的螺口试管中，拧紧盖子，并封加一层灭菌液体石蜡，密封完全状态下37℃发酵培养18h；
步骤8：按5％的接种量接种到装有液深10cma培养基的螺口试管中，拧松盖子，不封加液体石蜡，半密封状态下35℃发酵培养18h；步骤9；按5％的接种量接种到装有液深10cmb培养基的螺口试管中，35℃有氧发酵18h。6.根据权利要求1或2所述的长双歧杆菌的高活菌数有氧发酵方法，其特征在于：所述的长双歧杆菌活化的操作为：取长双歧杆菌菌液在mrsc固体培养基平板上划线分离，厌氧培养24～48h，待平板上长出单菌落，将单菌落接种在mrsc液体培养基中厌氧培养24～48h；取菌液按2～10％的接种量进行传代，厌氧条件下，反复传代5～10代，得到活化的菌液。7.根据权利要求1或2所述的长双歧杆菌的高活菌数有氧发酵方法，其特征在于：所述的麦角硫因提取液为灵芝的麦角硫因提取液。8.根据权利要求7所述的长双歧杆菌的高活菌数有氧发酵方法，其特征在于：所述的麦角硫因提取液通过如下方法制备得到：a.从灵芝种子液中吸取菌液至无菌含有玻璃珠psb培养基中，28
±
2℃，150
±
50r/min培养10
±
2天；b.收取菌丝，冲洗，冷冻干燥36
±
5h；b.准确称取干燥后菌丝体0.1g，研磨粉碎，加入三级水10ml，300
±
50w超声提取10
±
2min；提取后置于65
±
5℃水浴30
±
2min，使用过滤法收集上清液4ml，加入70％乙醇8ml和1％sds溶液2ml，4
±
1℃静置12
±
2h；将静置后溶液常温8000
±
100r/min，15
±
2min离心，取上清；使用氮吹仪，85
±
5℃，氮吹至4ml以下，使用三级水定容样品至4ml；c.取出预处理后大孔树脂抽滤收集，向样品液中加入1g，置于摇床30
±
2℃，150
±
50r/min震荡4
±
2h，可得所述的麦角硫因提取液。9.一种长双歧杆菌，其特征在于：通过权利要求1-8任一项中所述的方法制备得到。10.权利要求9中所述的长双歧杆菌在益生菌制品领域中的应用。
技术总结
本发明公开了一种长双歧杆菌的高活菌数有氧发酵方法。该方法在改变了长双歧杆菌传统厌氧发酵方式的同时，解决了长双歧杆菌在有氧发酵时活菌数低的问题。通过本发明长双歧杆菌菌株在有氧条件下进行发酵，可达到10
