一种适用于猕猴桃根组织单细胞测序的植物细胞核制备以及悬液优化方法与流程
1.本发明属于生物技术领域，涉及植物细胞核的制备方法，具体涉及一种猕猴桃根组织的细胞核制备方法及其在植物单细胞测序中的应用和使用方法。
背景技术：
2.单细胞测序技术通过测定单个细胞的转录组，以“单细胞分辨力”来解析生命现象背后的分子机制，是生命科学研究的尖端技术手段，得到了广泛应用。然而，由于细胞壁的存在，植物组织进行单细胞测序“困难重重”，必须先将植物细胞解离为原生质体才能进行单细胞测序。细胞壁的主要成分是纤维素等多糖类物质，这些大分子结构多变，化学性质稳定，是最难于降解的物质之一。因此，目前多数植物组织很难制备到满足单细胞测序要求的原生质体，极大的限制了植物单细胞测序研究。另外，制备原生质体对植物细胞造成非常大的改变，会诱发转录变化，导致测序结果可靠性严重降低，数据无法反映真实的生物学变化。
3.为了规避组织分离细胞困难以及解离过程造成的数据失真等问题，动物组织会采用单细胞核测序来开展实验，收到了非常好的效果。因此，借鉴动物组织中的方式，通过制备植物细胞核来开展植物单细胞测序是突破当前技术难题的有效手段。但当前植物组织制备细胞核的方法，都是应用于拟南芥的相关研究，不适用于猕猴桃根组织研究，猕猴桃根组织制备细胞核后，细胞核数量、细胞碎片比例等指标无法满足单细胞测序的要求，亟需开发一种新的适用于猕猴桃根组织植物单细胞测序研究的细胞核制备方法。
技术实现要素：
4.拟南芥虽然有成熟的细胞核制备技术方案，如《identification of open chromatin regions in plant genomes using atac-seq》与《isolation of plant root nuclei for single cell rna sequencing》中所述实验步骤，前者主要应用于拟南芥的基因组测序研究，后者主要应用于转录组测序研究，两种方法可以分别制备拟南芥叶和根组织的细胞核悬液。猕猴桃为大型落叶藤本，与拟南芥的组织相似性极低，细胞壁组成成分差异较大，且由于生长环境不同，组织和细胞的组成也有较大差异。使用拟南芥制备细胞核的方法无法制备满足单细胞测序的猕猴桃根组织细胞核悬液。
5.针对现有技术的空白和存在的不足，本发明在大量的深入研究和实验的基础上，提供了一种适用于单细胞测序的猕猴桃根组织细胞核的制备方法，及相应的裂解液配方和细胞核悬液优化方法(其中，本发明所述细胞核悬液优化方法，主要优化的内容为，去除猕猴桃根组织/细胞中沉积的草酸钙晶体、去除提取猕猴桃根组织过程中释放到悬液中的mrna、去除细胞核悬液中的组织碎片)。
6.本发明提供的适用于单细胞测序的猕猴桃根组织细胞核的制备方法，包括如下具体步骤：
7.1)配置kr裂解液：首先配置kr裂解液，并将配置好的溶液预冷。
8.2)破碎样本：将新鲜取材或者冻存的猕猴桃根组织样本转入离心管，加入所预冷的kr裂解液及钢珠，依照仪器操作说明置于破碎仪上对组织进行破碎。
9.3)裂解细胞：破碎后将离心管置于冰上孵育裂解。
10.4)筛网过滤：将步骤3)裂解后的组织裂解液转入离心管中，加入预冷的pbs。冰上静置1分钟。吸出组织裂解液，加入滤网中进行过滤。
11.5)筛网过滤：使用滤网对步骤4)中的过滤液再进行一次过滤。
12.6)离心收集沉淀：将步骤5)中的过滤液进行离心。丢弃上清，沉淀使用pbs进行重悬。
13.7)过滤：将步骤6)中的沉淀重悬液全部加入分选柱中进行过滤。
14.8)离心收集沉淀：将步骤7)中的过滤液进行离心，丢弃上清，沉淀使用100μlpbs进行重悬。
15.步骤(1)中，所述kr裂解液包含以下成份(终浓度)：
16.2％～3％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15～25mm柠檬酸钠、0.2～0.4％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)、0.2～0.4u/ml rnase inhibitor(重组型rnase抑制剂(鼠源)，accurate biology,ag11613)；优选地，为3％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、25mm柠檬酸钠、0.4％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)、0.4u/ml rnase inhibitor(重组型rnase抑制剂(鼠源)，accurate biology,ag11613)。
17.步骤(1)中，l-酒石酸常用作饮料和其他食品的酸味剂，在本发明中作用为中和组织和细胞破碎后释放的细胞内容物，稳定裂解液ph，保持细胞核完整；同时l-酒石酸作为裂解液中的还原剂，发挥保持rnase inhibitor(rna酶抑制剂)的活性的作用。
18.步骤(1)中，皂素主要作用是医药原料，同时也被用于防腐材料、乳化剂成分，在本发明中，皂素作为裂解液的成分发挥裂解细胞膜，释放细胞核的作用。
19.步骤(1)中，配置kr裂解液时需要先加入2％～3％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)，将溶液充分混匀并置于冰上预冷后再加入0.2～0.4u/ml rnase inhibitor。其目的是2％～3％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)可以保持0.2～0.4u/ml rnase inhibitor的活性。
20.步骤(1)中，所述预冷温度为0～5℃；优选地，为放置于4℃冰箱预冷。
21.步骤(2)中，所述离心管为 2.0ml maxyclear snaplock microcentrifuge tube，rnase-/dnase-free and nonpyrogenic(axygen,mct-200-c)(爱思进2.0ml无核酸酶透明离心管)。
22.步骤(2)中，破碎仪常用于核酸抽提工作，在本发明中的作用是通过钢珠充分破坏植物组织，辅助kr裂解液完成粗细胞核悬液的制备。
23.步骤(2)中，所述钢珠的直径为5mm。
24.步骤(2)中，所述破碎仪为万柏生物高通量组织破碎仪(onebio-48p)。
25.步骤(2)中，所述破碎的条件为1200～1300rpm，170～180s；优选地，为1200rpm，180s。
26.步骤(2)中，所述猕猴桃根可指任意品种猕猴桃的根尖组织，包括分生区、伸长区、
成熟区。
27.步骤(2)中，所述猕猴桃根组织，其鲜重为50～100mg；优选地，为100mg。
28.步骤(3)中，所述孵育的目的是在保持细胞核内信使rna(mrna)完整性的温度下，使用kr裂解液去除细胞核外的细胞膜等结构。
29.步骤(3)中，所述孵育的时间为7～8分钟；优选地，为7min。
30.步骤(4)中，所述滤网为falcon 40μm cell strainer(falcon,352340)，孔径40μm。
31.步骤(4)中，所述pbs为gibco pbs ph7.4(1
×
)(gibco,10010-031)。
32.步骤(4)中，所述离心管为corning centristar 15ml离心管(corning,430790)。
33.步骤(4)中，所述过滤全程在0～5℃操作；优选地，为放置冰上操作。
34.步骤(4)中冰上静置1分钟的目的是使大的组织块沉降至离心管底部，静置时间过短组织块沉降不完全，造成筛网过滤时筛网堵塞，导致细胞核损失；静置时间过长则存在mrna降解的风险，mrna的降解将直接导致实验的失败。组织块沉降的时间为1min可以确保沉降完全且无mrna降解的风险。
35.步骤(5)中，所述滤网为falcon 40μm cell strainer(falcon,352340)，孔径40μm。
36.步骤(6)中，所述离心的温度为4-6℃；优选地，为4℃。
37.步骤(6)中，所述离心的时间为10-15分钟；优选地，为10分钟。
38.步骤(6)中，所述离心的离心力为300～500
×
g，优选地，为300
×
g。
39.步骤(6)中，所述pbs为提前30min置于4℃冰箱中预冷后的pbs。
40.步骤(7)中，所述分选柱为miltenyi ms column(miltenyi,130-042-201)。
41.步骤(7)中，所述分选柱通常用于磁场下，通过带有磁珠的抗体结合目的细胞膜表面的特异性抗原，从而用于动物特定细胞类型的分选，在本发明中，在非磁场下，利用草酸钙晶体的针状形态特征和分选柱中纳米材料的堆叠的特点，体积小的细胞核可以伴随液流穿过分选柱，针状草酸钙晶体则会被留在分选柱中，无法伴随液流穿过，达到纯化细胞核的目的。
42.步骤(7)中，所述过滤全程在0～5℃操作；优选地，为放置冰上操作。
43.步骤(8)中，所述离心的温度为4-6℃；优选地，为4℃。
44.步骤(8)中，所述离心的时间为10-15分钟；优选地，为10分钟。
45.步骤(8)中，所述离心的离心力为300～500
×
g；优选地，为300
×
g。
46.步骤(8)中，所述pbs为冰上预冷后的pbs。
47.本发明还提供了由上述方法得到的适用于单细胞测序的猕猴桃根组织细胞核。
48.本发明还提供了所述猕猴桃根组织细胞核在单细胞测序中的应用。
49.在一个具体的实施方式中，本发明所述方法的具体步骤为：
50.1)配置kr裂解液。
51.依照以下成分配置裂解液：
52.2％～3％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15～25mm柠檬酸钠、0.2～0.4％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)、0.2～0.4u/ml rnase inhibitor(重组型rnase抑制剂(鼠源)，accurate biology,ag11613)。
53.将配置好的裂解液置于冰上进行预冷。
54.2)破碎样本。
55.将新鲜取材或者冻存的猕猴桃根组织样本转入2ml离心管(axygen,mct-200-c)中。加入步骤(1)中冰上预冷的裂解液1ml，加入打碎用的钢珠。将离心管置于打碎用夹板并拧紧扳手，调节仪器转速为1200～1300rpm，170～180秒。启动仪器进行组织破碎。
56.3)裂解细胞。
57.待仪器完全停止后，将离心管取出后插于冰中，静置孵育7分钟。
58.4)过滤。
59.用移液器将步骤(3)中的组织裂解液转移到一个新的15ml离心管(corning,430790)中。向离心管中加入9ml冰上预冷的pbs(gibco,10010-031)。于冰上静置1分钟。
60.使用移液器将裂解液逐次吸出，于40μm滤网(falcon,352340)进行过滤。过滤液收集到一新的50ml离心管(corning,430828)中。
61.5)过滤。
62.使用移液器，将步骤(4)中的过滤液逐次吸出，于40μm滤网(falcon,352340)进行过滤。将过滤液收集到一新的15ml离心管中。
63.6)离心收集沉淀。
64.将步骤(5)中的离心管置于离心机中，4℃下，300
×
g离心10分钟。
65.离心完成后，小心取出离心管，将上清小心的倒出，沉淀使用3ml冰上预冷的pbs进行重悬。
66.7)过滤。
67.将步骤(6)中的3ml重悬液全部加入ms column(miltenyi,130-042-201)中，将过滤液收集到一新的15ml离心管中，于冰上静置过滤，待液体完全过滤到15ml离心管中为止。
68.8)离心收集沉淀。
69.将步骤(7)中的离心管置于离心机中，4℃下，300
×
g离心10分钟。
70.离心完成后，小心取出离心管，将上清小心的倒出，沉淀使用100μl冰上预冷的pbs进行重悬
71.9)镜检计数。
72.取5μl步骤(8)中的重悬液，与dapi染液1:1进行混匀。使用血球计数板计数细胞核总量和浓度。
73.10)单细胞测序上机。
74.依照10x genomics试剂盒说明书操作，上机进行单细胞测序。
75.本发明还提供了一种kr裂解液，所述kr裂解液包含以下成份(终浓度)：2％～3％(v/v)l-酒石酸、15～25mm柠檬酸钠、0.2～0.4％(m/v)皂素、0.2～0.4u/ml重组型rnase抑制剂。
76.本发明还提供了一种试剂/试剂盒，其特征在于，其包含如上所述的kr裂解液。
77.本发明还提供了所述的kr裂解液或所述的试剂/试剂盒在制备适用于单细胞测序的猕猴桃根组织细胞核的方法、猕猴桃根组织细胞核转录组测序、猕猴桃根组织细胞核atac测序研究中的应用。
78.与现有技术相比，本发明取得的有益效果如下：
79.第一，填补了目前的技术空白：目前缺少适用于单细胞测序实验的猕猴桃根组织细胞核的制备方法，严重阻碍了单细胞测序技术在猕猴桃根组织研究中的应用。本发明提供的技术方案解决了这一问题，将有力的促进猕猴桃根组织单细胞测序研究的开展和广泛应用。
80.第二，猕猴桃根细胞核悬液质量提升。猕猴桃根组织中含有大量杂质、多糖等，裂解后的悬液中存在大量碎片、细胞内晶体等杂质，其质量完全无法满足10x genomics上机要求，严重阻碍了猕猴桃根组织的研究进程。而根据本发明技术方案制备得到的细胞核质量很高(样本质量从细胞核数量3
×
105个，碎片率大于70％，提升到2.26
×
106～4.12
×
106个，碎片率3～5％。)，细胞碎片、细胞内晶体等杂质基本被完全去除，可以顺利的开展后续的单细胞实验。
81.第三，成本低廉，耗时较短。本发明提供的技术方案使用的裂解液组分仅有4种，与现有技术中6～7种组分相比有着显著的减少；实验流程在30分钟内即可完成细胞核的制备。避免了蔗糖沉积等步骤，节约了试剂、耗材，降低了成本，同时大大缩短了时间，提高了效率，便于大量样本实验的开展。
附图说明
82.图1是细胞核镜检图。图示为经本发明技术方法制备得到的细胞核。图中可见细胞碎片、草酸钙晶体等杂质被完全去除，仅存在占比很低的小于细胞核的杂质。
83.图2是本发明实施例1～4单细胞转录组测序cdna质检结果(安捷伦4150生物分析仪)。
84.图3是组织中草酸钙针状晶体图示。
具体实施方式
85.下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
86.实施例1
87.1)配置裂解液。依照以下成分配置裂解液：
88.2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15mm柠檬酸钠、0.2％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)、0.2u/ml rnase inhibitor(重组型rnase抑制剂(鼠源)，accurate biology,ag11613)。将配置好的裂解液置于冰上进行预冷。
89.2)破碎样本。
90.将50mg猕猴桃根组织样本转入2ml离心管(axygen,mct-200-c)中。加入步骤(1)中冰上预冷的裂解液1ml，加入打碎用的钢珠。将离心管置于打碎用的夹板并拧紧扳手，调节仪器转速为1200rpm，170秒。启动仪器进行组织破碎。
91.3)裂解细胞。
92.待仪器完全停止后，将离心管取出后插于冰中，静置孵育7分钟。
93.4)过滤。
94.用移液器将步骤(3)中的组织裂解液转移到一个新的15ml离心管(corning,430790)中。向离心管中加入9ml冰上预冷的pbs(gibco,10010-031)。于冰上静置1分钟。
95.使用移液器将裂解液逐次吸出，于40μm滤网(falcon,352340)进行过滤。过滤液收集到一新的50ml离心管(corning,430828)中。
96.注意操作均应在冰上进行。
97.5)过滤。
98.使用移液器，将步骤(4)中的过滤液逐次吸出，于40μm滤网(falcon,352340)进行过滤。将过滤液收集到一新的15ml离心管中。
99.注意操作均应在冰上进行。
100.6)离心收集沉淀。
101.将步骤(5)中的离心管置于离心机中，4℃下，300
×
g离心10分钟。
102.离心完成后，小心取出离心管，将上清小心的倒出，沉淀使用3ml冰上预冷的pbs进行重悬。
103.7)过滤。
104.将步骤(6)中的3ml重悬液全部加入ms column(miltenyi,130-042-201)中，将过滤液收集到一新的15ml离心管中，于冰上静置过滤，待液体完全过滤到15ml离心管中为止。
105.8)离心收集沉淀。
106.将步骤(7)中的离心管置于离心机中，4℃下，300
×
g离心10分钟。
107.离心完成后，小心取出离心管，将上清小心的倒出，沉淀使用10ml冰上预冷的pbs进行重悬
108.9)洗涤沉淀
109.将步骤(8)中的离心管置于离心机中，4℃下，300
×
g离心10分钟。
110.离心完成后，小心取出离心管，将上清小心的倒出，沉淀使用100μl冰上预冷的pbs进行重悬。
111.10)质检、镜检计数。
112.吸取上清液使用nanodrop微量分光光度计和荧光分光光度计测量悬液中rna的浓度。
113.通过dapi染液，显微镜下镜检计算活细胞核浓度、结团比例、杂质比例：取5μl步骤(9)中的重悬液，与dapi染液1:1进行混匀，用移液器吸取10ul加到血球计数板的加样孔中计数，显微镜观察计数区的细胞核个数。荧光显示为细胞核。
114.11)单细胞测序上机。
115.依照10x genomics公司说明书：chromiumnext gem single cell 3’reagent kit v3.1，cg000204 rev c，进行单细胞测序操作。
116.结果及分析：结果见表1；活细胞比例、细胞结团比例、碎片比例和细胞浓度均能达到10x genomics公司单细胞测序要求(表1，图1)、cdna长度正常(图2)。文库构建结果显示冻存样本提取细胞核悬液进行单细胞转录组测序效果良好。
117.实施例2
118.1)配置裂解液。依照以下成分配置裂解液：
119.3％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、25mm柠檬酸钠、0.4％(m/v)
皂素(nanjing reagent,8047-15-2)、0.4u/ml rnase inhibitor(重组型rnase抑制剂(鼠源)，accurate biology,ag11613)。将配置好的裂解液置于冰上进行预冷。
120.2)破碎样本。
121.将50mg猕猴桃根组织样本转入2ml离心管(axygen,mct-200-c)中。加入步骤(1)中冰上预冷的裂解液1ml，加入打碎用的钢珠。将离心管置于打碎用夹板并拧紧扳手，调节仪器转速为1300rpm，180秒。启动仪器进行组织破碎。
122.3)裂解细胞。
123.待仪器完全停止后，将离心管取出后插于冰中，静置孵育8分钟。
124.4)过滤。
125.用移液器将步骤(3)中的组织裂解液转移到一个新的15ml离心管(corning,430790)中。向离心管中加入9ml冰上预冷的pbs(gibco,10010-031)。于冰上静置1分钟。
126.使用移液器将裂解液逐次吸出，于40μm滤网(falcon,352340)进行过滤。过滤液收集到一新的50ml离心管(corning,430828)中。
127.注意操作均应在冰上进行。
128.5)过滤。
129.使用移液器，将步骤(4)中的过滤液逐次吸出，于40μm滤网(falcon,352340)进行过滤。将过滤液收集到一新的15ml离心管中。
130.注意操作均应在冰上进行。
131.6)离心收集沉淀。
132.将步骤(5)中的离心管置于离心机中，4℃下，500
×
g离心10分钟。
133.离心完成后，小心取出离心管，将上清小心的倒出，沉淀使用3ml冰上预冷的pbs进行重悬。
134.7)过滤。
135.将步骤(6)中的3ml重悬液全部加入ms column(miltenyi,130-042-201)中，将过滤液收集到一新的15ml离心管中，于冰上静置过滤，待液体完全过滤到15ml离心管中为止。
136.8)离心收集沉淀。
137.将步骤(7)中的离心管置于离心机中，4℃下，500
×
g离心10分钟。
138.离心完成后，小心取出离心管，将上清小心的倒出，沉淀使用10ml冰上预冷的pbs进行重悬
139.9)洗涤沉淀
140.将步骤(8)中的离心管置于离心机中，4℃下，500
×
g离心10分钟。
141.离心完成后，小心取出离心管，将上清小心的倒出，沉淀使用100μl冰上预冷的pbs进行重悬。
142.10)质检、镜检计数。
143.吸取上清液使用nanodrop微量分光光度计和荧光分光光度计测量悬液中rna的浓度。
144.通过dapi染液，显微镜下镜检计算活细胞核浓度、结团比例、杂质比例：取5μl步骤(9)中的重悬液，与dapi染液1:1进行混匀，用移液器吸取10ul加到血球计数板的加样孔中计数，显微镜观察计数区的细胞核个数。荧光显示为细胞核。
145.11)单细胞测序上机。
146.依照10x genomics公司说明书：chromiumnext gem single cell 3’reagent kit v3.1，cg000204rev c，进行单细胞测序操作。
147.结果及分析：结果见表1；悬液中rna含量极低；活细胞比例、细胞结团比例、碎片比例和细胞浓度均能达到10x genomics公司单细胞测序要求、cdna长度正常，文库构建结果显示冻存样本提取细胞核悬液进行单细胞转录组测序效果良好(图2)。
148.实施例3
149.1)配置裂解液。依照以下成分配置裂解液：
150.2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15mm柠檬酸钠、0.2％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)、0.2u/ml rnase inhibitor(重组型rnase抑制剂(鼠源)，accurate biology,ag11613)。将配置好的裂解液置于冰上进行预冷。
151.2)破碎样本。
152.将50mg猕猴桃根组织样本转入2ml离心管(axygen,mct-200-c)中。加入步骤(1)中冰上预冷的裂解液1ml，加入打碎用的钢珠。将离心管置于打碎用夹板并拧紧扳手，调节仪器转速为1200rpm，170秒。启动仪器进行组织破碎。
153.3)裂解细胞。
154.待仪器完全停止后，将离心管取出后插于冰中，静置孵育7分钟。
155.4)过滤。
156.用移液器将步骤(3)中的组织裂解液转移到一个新的15ml离心管(corning,430790)中。向离心管中加入9ml冰上预冷的pbs(gibco,10010-031)。于冰上静置1分钟。
157.使用移液器将裂解液逐次吸出，于40μm滤网(falcon,352340)进行过滤。过滤液收集到一新的50ml离心管(corning,430828)中。
158.注意操作均应在冰上进行。
159.5)过滤。
160.使用移液器，将步骤(4)中的过滤液逐次吸出，于40μm滤网(falcon,352340)进行过滤。将过滤液收集到一新的15ml离心管中。
161.注意操作均应在冰上进行。
162.6)离心收集沉淀。
163.将步骤(5)中的离心管置于离心机中，4℃下，300
×
g离心10分钟。
164.离心完成后，小心取出离心管，将上清小心的倒出，沉淀使用3ml冰上预冷的pbs进行重悬。
165.7)过滤。
166.将步骤(6)中的3ml重悬液全部加入ms column(miltenyi,130-042-201)中，将过滤液收集到一新的15ml离心管中，于冰上静置过滤，待液体完全过滤到15ml离心管中为止。
167.8)离心收集沉淀。
168.将步骤(7)中的离心管置于离心机中，4℃下，300
×
g离心10分钟。
169.离心完成后，小心取出离心管，将上清小心的倒出，沉淀使用10ml冰上预冷的pbs进行重悬
170.9)洗涤沉淀
171.将步骤(8)中的离心管置于离心机中，4℃下，300
×
g离心10分钟。
172.离心完成后，小心取出离心管，将上清小心的倒出，沉淀使用100μl冰上预冷的pbs进行重悬。
173.10)质检、镜检计数。
174.吸取上清液使用nanodrop微量分光光度计和荧光分光光度计测量悬液中rna的浓度。
175.通过dapi染液，显微镜下镜检计算活细胞核浓度、结团比例、杂质比例：取5μl步骤(9)中的重悬液，与dapi染液1:1进行混匀，用移液器吸取10ul加到血球计数板的加样孔中计数，显微镜观察计数区的细胞核个数。荧光显示为细胞核。
176.11)单细胞测序上机。
177.依照10x genomics公司说明书：chromiumnext gem single cell 3’reagent kit v3.1，cg000204rev c，进行单细胞测序操作。
178.结果及分析：结果见表1；活细胞比例、细胞结团比例、碎片比例和细胞浓度均能达到10x genomics公司单细胞测序要求(表1，图1)、cdna长度正常(图2)。文库构建结果显示冻存样本提取细胞核悬液进行单细胞转录组测序效果良好。
179.实施例4
180.1)配置裂解液。依照以下成分配置裂解液：
181.3％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、25mm柠檬酸钠、0.4％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)、0.4u/ml rnase inhibitor(重组型rnase抑制剂(鼠源)，accurate biology,ag11613)。将配置好的裂解液置于冰上进行预冷。
182.2)破碎样本。
183.将100mg猕猴桃根组织样本转入2ml离心管(axygen,mct-200-c)中。加入步骤(1)中冰上预冷的裂解液1ml，加入打碎用的钢珠。将离心管置于打碎用夹板并拧紧扳手，调节仪器转速为1300rpm，180秒。启动仪器进行组织破碎。
184.3)裂解细胞。
185.待仪器完全停止后，将离心管取出后插于冰中，静置孵育8分钟。
186.4)过滤。
187.用移液器将步骤(3)中的组织裂解液转移到一个新的15ml离心管(corning,430790)中。向离心管中加入9ml冰上预冷的pbs(gibco,10010-031)。于冰上静置1分钟。
188.使用移液器将裂解液逐次吸出，于40μm滤网(falcon,352340)进行过滤。过滤液收集到一新的50ml离心管(corning,430828)中。
189.注意操作均应在冰上进行。
190.5)过滤。
191.使用移液器，将步骤(4)中的过滤液逐次吸出，于40μm滤网(falcon,352340)进行过滤。将过滤液收集到一新的15ml离心管中。
192.注意操作均应在冰上进行。
193.6)离心收集沉淀。
194.将步骤(5)中的离心管置于离心机中，4℃下，500
×
g离心10分钟。
195.离心完成后，小心取出离心管，将上清小心的倒出，沉淀使用3ml冰上预冷的pbs进
行重悬。
196.7)过滤。
197.将步骤(6)中的3ml重悬液全部加入ms column(miltenyi,130-042-201)中，将过滤液收集到一新的15ml离心管中，于冰上静置过滤，待液体完全过滤到15ml离心管中为止。
198.8)离心收集沉淀。
199.将步骤(7)中的离心管置于离心机中，4℃下，500
×
g离心10分钟。
200.离心完成后，小心取出离心管，将上清小心的倒出，沉淀使用10ml冰上预冷的pbs进行重悬
201.9)洗涤沉淀
202.将步骤(8)中的离心管置于离心机中，4℃下，500
×
g离心10分钟。
203.离心完成后，小心取出离心管，将上清小心的倒出，沉淀使用100μl冰上预冷的pbs进行重悬。
204.10)质检、镜检计数。
205.吸取上清液使用nanodrop微量分光光度计和荧光分光光度计测量悬液中rna的浓度。
206.通过dapi染液，显微镜下镜检计算活细胞核浓度、结团比例、杂质比例：取5μl步骤(9)中的重悬液，与dapi染液1:1进行混匀，用移液器吸取10ul加到血球计数板的加样孔中计数，显微镜观察计数区的细胞核个数。荧光显示为细胞核。
207.11)单细胞测序上机。
208.依照10x genomics公司说明书：chromiumnext gem single cell 3’reagent kit v3.1，cg000204 rev c，进行单细胞测序操作。
209.结果及分析：结果见表1；活细胞比例、细胞结团比例、碎片比例和细胞浓度均能达到10x genomics公司单细胞测序要求(表1，图1)、cdna长度正常(图2)。文库构建结果显示冻存样本提取细胞核悬液进行单细胞转录组测序效果良好。
210.对比实施例1
211.本实施例依照《identification of open chromatin regions in plant genomes using atac-seq》进行拟南芥叶片细胞核制备。
212.1)配置裂解液。
213.依照以下成分配置细胞核纯化缓冲液
214.20mm mops ph 7,40mm nacl,90mm kcl,2mm edta,0.5mm egta,0.5mm spermidine,0.2mm spermine,and 1
×
roche complete protease inhibitors.
215.依照以下成分配置细胞核提取液1：
216.0.25m sucrose,10mm tris
–
hcl ph 8,10mm mgcl2,1％triton x-100,and 1
×
roche complete protease inhibitors.
217.依照以下成分配置细胞核提取液2：
218.1.7m sucrose,10mm tris
–
hcl ph 8,2mm mgcl2,and 0.15％triton x-100,1
×
roche complete protease inhibitors.
219.将配置好的溶液置于冰上进行预冷。
220.2)破碎样本。
221.将50mg拟南芥叶片组织样本转入研钵中，倒入一定量液氮进行研磨，至组织全部变为粉末为止。期间注意添加液氮，以保持低温。
222.3)裂解细胞。
223.将研磨的粉末转入一个新的含有10ml冰上预冷的细胞核纯化缓冲液的研钵中。使用研棒将粉末搅拌重悬。
224.4)过滤。
225.用移液器将步骤(3)中的组织裂解液逐次吸出，于70μm滤网进行过滤，滤液收集到一个新的15ml离心管中。注意离心管应插于冰中。
226.5)离心收集沉淀。
227.将步骤(4)中的离心管，于离心机中以1200
×
g、4℃离心10分钟。
228.小心的取出离心管，将上清吸出弃去。
229.6)离心收集沉淀。
230.使用1ml预冷的细胞核提取液1将步骤(5)中的细胞核沉淀重悬。
231.将重悬液吸出，加入一个新的1.5ml离心管中。将离心管置于离心机中，以12000
×
g、4℃离心10分钟。
232.小心的取出离心管，将上清吸出弃去。
233.7)离心收集沉淀。
234.向一个新的1.5ml离心管中加入300μl细胞核提取液2。
235.使用300μl预冷的细胞核提取液2将步骤(6)中的细胞核沉淀重悬。将重悬液小心的加入到含有细胞核提取液2的离心管中，使溶液分层。
236.将离心管置于离心机中，以16000
×
g、4℃离心10分钟。
237.小心的取出离心管，将上清吸出弃去。
238.使用1ml预冷的细胞核纯化缓冲液重悬沉淀。
239.8)镜检计数。
240.通过dapi染液，显微镜下镜检计算细胞核浓度、结团比例、杂质比例：取5μl步骤(8)中的重悬液，与dapi染液1:1进行混匀，用移液器吸取10ul加到血球计数板的加样孔中计数，显微镜观察计数区的细胞核个数。荧光显示为细胞核。
241.9)结果及分析
242.结果显示细胞核数量为2
×
106个，碎片杂质占比28％。满足单细胞转录组测序对于样本的最低要求。
243.对比实施例2
244.本实施例依照《identification of open chromatin regions in plant genomes using atac-seq》进行猕猴桃叶片组织细胞核制备。其余操作步骤与对比实施例1相同。
245.结果见表2。
246.对比实施例3
247.本实施例依照《identification of open chromatin regions in plant genomes using atac-seq》进行猕猴桃根组织细胞核制备。其余操作步骤与对比实施例1相同。
248.结果见表2。
249.对比实施例4
250.本实施例依照依照《isolation of plant root nuclei for single cell rna sequencing》中植物组织细胞核提取试剂盒(cellytic
tm pn分离/提取试剂盒，sigma，编号为cellytpn1-1kt)进行拟南芥根组织细胞核制备。
251.1)准备裂解液
252.将500μlnib裂解液倒入新的、无菌且预冷藏的60mm培养皿中。
253.2)取材
254.将7日龄的拟南芥植物的根部用双面刀片切下，收集新鲜根部。
255.3)转移材料
256.用镊子将新鲜根部样品转移到60mm培养皿中，并将根全部浸入nib裂解液中。
257.4)组织切碎
258.将取到的根部样本用双面刀片切碎约5分钟。
259.5)组织裂解
260.在4℃环境中轻轻水平摇动孵育15分钟进行裂解。
261.6)过滤
262.在低温环境下，先使用500μlnib将40μm过滤器润湿，随后用一次性大口径吸头吸取根裂解后的核悬液，缓慢进行过滤，再使用500μlnib对过滤器进行冲洗，收集剩余细胞核。
263.7)筛网过滤
264.再将过滤后的核悬液用同步骤7的方法，使用30μm过滤器进行二次过滤，再使用500μlnib对过滤器进行冲洗，收集剩余细胞核，并去除碎片。
265.8)镜检计数
266.通过dapi染液，显微镜下镜检计算细胞核浓度、结团比例、杂质比例：取5μl步骤(8)中的重悬液，与dapi染液1:1进行混匀，用移液器吸取10ul加到血球计数板的加样孔中计数，显微镜观察计数区的细胞核个数。荧光显示为细胞核。
267.结果见表2
268.对比实施例5
269.本实施例依照依照《isolation of plant root nuclei for single cell rna sequencing》中植物组织细胞核提取试剂盒(cellytic
tm pn分离/提取试剂盒，sigma，编号为cellytpn1-1kt)进行猕猴桃叶片组织细胞核制备。其余操作步骤与对比实施例4相同。
270.结果见表2。
271.对比实施例6
272.本实施例依照依照《isolation of plant root nuclei for single cell rna sequencing》中植物组织细胞核提取试剂盒(cellytic
tm pn分离/提取试剂盒，sigma，编号为cellytpn1-1kt)进行猕猴桃根组织细胞核制备。其余操作步骤与对比实施例4相同。
273.结果见表2。
274.对比实施例7
275.本实施例使用st1缓冲液进行猕猴桃根组织细胞核制备。
276.1)配置st1缓冲液。依照以下成分配置缓冲液：
277.2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)。将配置好的缓冲液置于冰上进行预冷。
278.2)破碎样本。
279.将50mg猕猴桃根组织样本转入研钵中，倒入一定量液氮进行研磨，至组织全部变为粉末为止。期间注意添加液氮，以保持低温。
280.3)裂解细胞。
281.将研磨的粉末转入一个新的含有10ml冰上预冷的缓冲液的15ml离心管中。上下颠倒15次重悬。
282.4)镜检计数。
283.通过dapi染液，显微镜下镜检计算细胞核浓度、结团比例、杂质比例：取5μl步骤(3)中的细胞核悬液，与dapi染液1:1进行混匀，用移液器吸取10ul加到血球计数板的加样孔中计数，显微镜观察计数区的细胞核个数。荧光显示为细胞核。
284.5)参数测量。
285.使用ph计(mettler toledo fe28-cn，30595013)测量步骤(3)中缓冲液ph。
286.结果见表2。
287.对比实施例8
288.本实施例使用st2缓冲液成分为15mm柠檬酸钠进行猕猴桃根组织细胞核制备，其余操作步骤与对比实施例7相同。
289.结果见表2。
290.对比实施例9
291.本实施例使用st3缓冲液成分为2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、20mm tris-hcl(ph＝7.5)进行猕猴桃根组织细胞核制备，其余操作步骤与对比实施例7相同。
292.对比实施例10
293.本实施例使用st4缓冲液成分为15mm柠檬酸钠,20mm mops(3-(n-啉)丙磺酸,sigma-aldrich，1132-61-2)进行猕猴桃根组织细胞核制备，其余操作步骤与对比实施例7相同。
294.结果见表2。
295.对比实施例11
296.本实施例使用st缓冲液成分为2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15mm柠檬酸钠进行猕猴桃根组织细胞核制备，其余操作步骤与对比实施例7相同。
297.结果见表2。
298.对比实施例12
299.本实施例使用st5缓冲液成分为1.5％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、10mm柠檬酸钠进行猕猴桃根组织细胞核制备，其余操作与对比实施例7相同。
300.结果见表2。
301.对比实施例13
302.本实施例使用st6缓冲液成分为4％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、30mm柠檬酸钠进行猕猴桃根组织细胞核制备，其余操作与对比实施例7相同。
303.结果见表2。
304.对比实施例14
305.本实施例依照使用kr1裂解液进行猕猴桃根组织细胞核制备。
306.1)配置kr1裂解液。依照以下成分配置裂解液：
307.2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15mm柠檬酸钠、0.2％(m/v)sds(十二烷基硫酸钠，sigma,151-21-3)。将配置好的裂解液置于冰上进行预冷。
308.2)破碎样本。
309.将50mg猕猴桃根组织样本转入2ml离心管(axygen,mct-200-c)中。加入步骤(1)中冰上预冷的裂解液1ml，在裂解液中使用灭菌剪刀将猕猴桃根剪碎。
310.3)裂解细胞。
311.将离心管插于冰中，静置孵育8分钟。
312.4)镜检计数。
313.通过dapi染液，显微镜下镜检计算细胞核浓度、结团比例、杂质比例：取5μl步骤(3)中的裂解液，与dapi染液1:1进行混匀，用移液器吸取10ul加到血球计数板的加样孔中计数，显微镜观察计数区的细胞核个数。荧光显示为细胞核。
314.结果见表2。
315.对比实施例15
316.本实施例依照使用kr2裂解液组分为2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15mm柠檬酸钠、0.2％(m/v)脱氧胆酸钠(sigma,302-95-4)，进行猕猴桃根组织细胞核制备，其余操作步骤与对比实施例14相同。
317.结果见表2。
318.对比实施例16
319.本实施例依照使用kr3裂解液组分为2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15mm柠檬酸钠、0.2％(m/v)洋地黄皂苷(sigma,11024-24-1)，进行猕猴桃根组织细胞核制备，其余操作步骤与对比实施例14相同。
320.结果见表2。
321.对比实施例17
322.本实施例依照使用kr4裂解液组分为2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15mm柠檬酸钠、0.2％(v/v)triton x-100(4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇，sigma,9036-19-5)，进行猕猴桃根组织细胞核制备，其余操作步骤与对比实施例14相同。
323.结果见表2。
324.对比实施例18
325.本实施例依照使用kr5裂解液组分为2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15mm柠檬酸钠、0.2％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)，进行猕猴
桃根组织细胞核制备，其余操作步骤与对比实施例14相同。
326.结果见表2。
327.对比实施例19
328.本实施例依照使用kr6裂解液组分为2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15mm柠檬酸钠、0.1％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)，进行猕猴桃根组织细胞核制备，其余操作步骤与对比实施例14相同。
329.结果见表2。
330.对比实施例20
331.本实施例依照使用kr7裂解液组分为2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15mm柠檬酸钠、0.4％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)，进行猕猴桃根组织细胞核制备，其余操作步骤与对比实施例14相同。
332.结果见表2。
333.对比实施例21
334.本实施例依照使用双面刀片切碎猕猴桃根组织，kr5裂解液裂解。
335.1)配置kr5裂解液。依照以下成分配置裂解液：
336.2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15mm柠檬酸钠、0.2％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)。将配置好的裂解液置于冰上进行预冷
337.2)破碎样本。
338.将50mg猕猴桃根组织样本放置于冰上的培养皿中，使用双面刀片将根切为0.5mm的小段，转入2ml离心管(axygen,mct-200-c)中。加入步骤(1)中冰上预冷的裂解液1ml。
339.3)裂解细胞。
340.将离心管插于冰中，静置孵育8分钟。
341.4)镜检计数。
342.通过dapi染液，显微镜下镜检计算细胞核浓度、结团比例、杂质比例：取5μl步骤(3)中的裂解液，与dapi染液1:1进行混匀，用移液器吸取10ul加到血球计数板的加样孔中计数，显微镜观察计数区的细胞核个数。荧光显示为细胞核。
343.结果见表3。
344.对比实施例22
345.本实施例依照使用剪刀剪碎猕猴桃根组织，kr5裂解液裂解，操作与对比实施例17相同。
346.结果将表3。
347.对比实施例23
348.本实施例依照使用玻璃匀浆器匀浆破碎猕猴桃根组织，kr5裂解液裂解。
349.1)配置kr4裂解液。依照以下成分配置裂解液：
350.2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15mm柠檬酸钠、0.2％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)。将配置好的裂解液置于冰上进行预冷。
351.2)破碎样本。
352.将50mg猕猴桃根组织样本，转入1ml玻璃匀浆器(solarbio,ya0850)中，加入步骤(1)中冰上预冷的裂解液1ml，使用玻璃匀浆器捣20次破碎组织。将匀浆器中的液体转移至
2ml离心管(axygen,mct-200-c)中。
353.3)裂解细胞。
354.将离心管插于冰中，静置孵育8分钟。
355.4)镜检计数。
356.通过dapi染液，显微镜下镜检计算细胞核浓度、结团比例、杂质比例：取5μl步骤(3)中的裂解液，与dapi染液1:1进行混匀，用移液器吸取10ul加到血球计数板的加样孔中计数，显微镜观察计数区的细胞核个数。荧光显示为细胞核。
357.结果见表3。
358.对比实施例24
359.本实施例依照使用破碎仪破碎猕猴桃根组织，kr5裂解液裂解。
360.1)配置kr4裂解液。依照以下成分配置裂解液：
361.2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15mm柠檬酸钠、0.2％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)。将配置好的裂解液置于冰上进行预冷
362.2)破碎样本。
363.将50mg猕猴桃根组织样本，转入2ml离心管(axygen,mct-200-c)中。加入步骤(1)中冰上预冷的裂解液1ml。快速组织低温破碎匀浆仪(上海净信，jxfstprp-i-02)。加入打碎用的钢珠。将离心管置于打碎用夹板并拧紧扳手，调节仪器转速为1200rpm，180秒。启动仪器进行组织破碎。
364.3)裂解细胞。
365.将离心管插于冰中，静置孵育8分钟。
366.4)镜检计数。
367.通过dapi染液，显微镜下镜检计算细胞核浓度、结团比例、杂质比例：取5μl步骤(3)中的裂解液，与dapi染液1:1进行混匀，用移液器吸取10ul加到血球计数板的加样孔中计数，显微镜观察计数区的细胞核个数。荧光显示为细胞核。
368.结果见表3。
369.对比实施例25
370.本实施例依照使用液氮研磨破碎猕猴桃根组织，kr5裂解液裂解。
371.1)配置kr4裂解液。依照以下成分配置裂解液：
372.2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15mm柠檬酸钠、0.2％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)。将配置好的裂解液置于冰上进行预冷
373.2)破碎样本。
374.将50mg猕猴桃根组织样本转入研钵中，倒入一定量液氮进行研磨，至组织全部变为粉末为止。期间注意添加液氮，以保持低温，将研磨的粉末移至2ml离心管(axygen,mct-200-c)中，加入步骤(1)中冰上预冷的裂解液1ml。
375.3)裂解细胞。
376.将离心管插于冰中，静置孵育8分钟。
377.4)镜检计数。
378.通过dapi染液，显微镜下镜检计算细胞核浓度、结团比例、杂质比例：取5μl步骤(3)中的裂解液，与dapi染液1:1进行混匀，用移液器吸取10ul加到血球计数板的加样孔中
计数，显微镜观察计数区的细胞核个数。荧光显示为细胞核。
379.结果见表3。
380.对比实施例26
381.本实施例依照使用破碎仪破碎猕猴桃根组织，kr8裂解液裂解。
382.1)配置kr8裂解液。依照以下成分配置裂解液：
383.2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15mm柠檬酸钠、0.2％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)、0.1u/ml rnase inhibitor(重组型rnase抑制剂(鼠源)，accurate biology,ag11613)。将配置好的裂解液置于冰上进行预冷。
384.2)破碎样本。
385.将50mg猕猴桃根组织样本，转入2ml离心管(axygen,mct-200-c)中。加入步骤(1)中冰上预冷的裂解液1ml。万柏生物高通量组织研磨仪(onebio-48p)。加入打碎用的钢珠。将离心管置于打碎用夹板并拧紧扳手，调节仪器转速为1200rpm，180秒。启动仪器进行组织破碎。
386.3)裂解细胞。
387.将离心管插于冰中，静置孵育8分钟。
388.4)镜检计数。
389.通过dapi染液，显微镜下镜检计算细胞核浓度、结团比例、杂质比例：取5μl步骤(3)中的裂解液，与dapi染液1:1进行混匀，用移液器吸取10ul加到血球计数板的加样孔中计数，显微镜观察计数区的细胞核个数。荧光显示为细胞核。
390.5)rna质检。
391.使用植物总rna提取试剂盒(天根生化科技有限公司，dp432)抽提步骤3中细胞核总rna。使用agilent 2100生物分析仪质检rna。
392.结果见表4
393.对比实施例27
394.本实施例依照使用破碎仪破碎猕猴桃根组织，kr9裂解液裂解。
395.1)配置kr9裂解液。依照以下成分配置裂解液：
396.2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15mm柠檬酸钠、0.2％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)、0.4u/ml rnase inhibitor(重组型rnase抑制剂(鼠源)，accurate biology,ag11613)。将配置好的裂解液置于冰上进行预冷。
397.2)破碎样本。
398.将50mg猕猴桃根组织样本，转入2ml离心管(axygen,mct-200-c)中。加入步骤(1)中冰上预冷的裂解液1ml。快速组织低温破碎匀浆仪(上海净信，jxfstprp-i-02)。加入打碎用的钢珠。将离心管置于打碎用夹板并拧紧扳手，调节仪器转速为1200rpm，180秒。启动仪器进行组织破碎。
399.3)裂解细胞。
400.将离心管插于冰中，静置孵育8分钟。
401.4)镜检计数。
402.通过dapi染液，显微镜下镜检计算细胞核浓度、结团比例、杂质比例：取5μl步骤(3)中的裂解液，与dapi染液1:1进行混匀，用移液器吸取10ul加到血球计数板的加样孔中
计数，显微镜观察计数区的细胞核个数。荧光显示为细胞核。
403.5)rna质检。
404.使用植物总rna提取试剂盒(天根生化科技有限公司，dp432)抽提步骤3中细胞核总rna。使用agilent 2100生物分析仪质检rna。
405.结果见表4
406.对比实施例28
407.本实施例依照使用破碎仪破碎猕猴桃根组织，kr10裂解液裂解成分为2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15mm柠檬酸钠、0.2％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)、0.6u/mlrnase inhibitor(重组型rnase抑制剂(鼠源)，accurate biology,ag11613)。其余操作与对比实施例25相同。
408.结果见表5
409.对比实施例29
410.本实施例依照使用70μm(falcon,352350)筛网过滤两次细胞核悬液。
411.1)配置裂解液。依照以下成分配置裂解液：
412.2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15mm柠檬酸钠、0.2％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)、0.2u/ml rnase inhibitor(重组型rnase抑制剂(鼠源)，accurate biology,ag11613)。将配置好的裂解液置于冰上进行预冷。
413.2)破碎样本。
414.将50mg猕猴桃根组织样本转入2ml离心管(axygen,mct-200-c)中。加入步骤(1)中冰上预冷的裂解液1ml，加入打碎用的钢珠。将离心管置于打碎用夹板并拧紧扳手，调节仪器转速为1200rpm，180秒。启动仪器进行组织破碎。
415.3)裂解细胞。
416.待仪器完全停止后，将离心管取出后插于冰中，静置孵育7分钟。
417.4)过滤。
418.用移液器将步骤(3)中的组织裂解液转移到一个新的15ml离心管(corning,430790)中。向离心管中加入9ml冰上预冷的pbs(gibco,10010-031)。于冰上静置1分钟。
419.使用移液器将裂解液逐次吸出，于70μm滤网(falcon,352350)进行过滤。过滤液收集到一新的50ml离心管(corning,430828)中。
420.注意操作均应在冰上进行。
421.5)过滤。
422.使用移液器，将步骤(4)中的过滤液逐次吸出，于70μm滤网(falcon,352350)进行过滤。将过滤液收集到一新的15ml离心管中。
423.注意操作均应在冰上进行。
424.6)镜检计数。
425.通过dapi染液，显微镜下镜检计算细胞核浓度、结团比例、杂质比例：取5μl步骤(5)中的滤液，与dapi染液1:1进行混匀，用移液器吸取10ul加到血球计数板的加样孔中计数，显微镜观察计数区的细胞核个数。荧光显示为细胞核。
426.结果见表5
427.对比实施例30
428.本实施例依照使用30μm(miltenyi biotec,130-110-915)筛网过滤细胞核悬液1次，其余操作与对比实施例29相同。
429.结果见表5
430.对比实施例31
431.本实施例依照使用30μm(miltenyi biotec,130-110-915)筛网过滤细胞核悬液两次，其余操作与对比实施例29相同。
432.结果见表5
433.对比实施例32
434.本实施例依照使用40μm(falcon,352340)筛网过滤细胞核悬液，其余操作与对比实施例29相同。
435.结果见表5
436.对比实施例33
437.本实施例依照使用40μm(falcon,352340)筛网过滤细胞核悬液两次，其余操作与对比实施例29相同。
438.结果见表5
439.对比实施例34
440.本实施例依照使用70μm(falcon,352350)筛网过滤去除草酸钙晶体。
441.1)配置裂解液。依照以下成分配置kr裂解液：
442.2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15mm柠檬酸钠、0.2％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)、0.2u/ml rnase inhibitor(重组型rnase抑制剂(鼠源)，accurate biology,ag11613)。将配置好的裂解液置于冰上进行预冷。
443.2)破碎样本。
444.将50mg猕猴桃根组织样本转入2ml离心管(axygen,mct-200-c)中。加入步骤(1)中冰上预冷的裂解液1ml，加入打碎用的钢珠。将离心管置于打碎用夹板并拧紧扳手，调节仪器转速为1200rpm，180秒。启动仪器进行组织破碎。
445.3)裂解细胞。
446.待仪器完全停止后，将离心管取出后插于冰中，静置孵育7分钟。
447.4)过滤。
448.用移液器将步骤(3)中的组织裂解液转移到一个新的15ml离心管(corning,430790)中。向离心管中加入9ml冰上预冷的pbs(gibco,10010-031)。于冰上静置1分钟。
449.使用移液器将裂解液逐次吸出，于40μm滤网(falcon,352340)进行过滤。过滤液收集到一新的50ml离心管(corning,430828)中。
450.注意操作均应在冰上进行。
451.5)过滤。
452.使用移液器，将步骤(4)中的过滤液逐次吸出，于40μm滤网(falcon,352340)进行过滤。将过滤液收集到一新的15ml离心管中。
453.注意操作均应在冰上进行。
454.6)过滤。
455.将步骤(5)中的滤液全部使用70μm(falcon,352350)筛网过滤，将过滤液收集到一
新的15ml离心管中，于冰上静置过滤，待液体完全过滤到15ml离心管中为止。
456.7)镜检计数。
457.通过dapi染液，显微镜下镜检计算细胞核浓度、结团比例、杂质比例：取5μl步骤(6)中的滤液，与dapi染液1:1进行混匀，用移液器吸取10ul加到血球计数板的加样孔中计数，显微镜观察计数区的细胞核个数。荧光显示为细胞核。
458.结果见表6
459.对比实施例35
460.本实施例依照使用40μm(falcon,352340)筛网过滤去除草酸钙晶体，其余操作与对比实施例32相同。
461.结果见表6
462.对比实施例36
463.本实施例依照使用30μm(miltenyi biotec,130-110-915)筛网过滤去除草酸钙晶体，其余操作与对比实施例32相同。
464.结果见表6
465.对比实施例37
466.本实施例依照使用100
×
g差速离心法去除草酸钙晶体。
467.1)配置裂解液。依照以下成分配置kr裂解液：
468.2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15mm柠檬酸钠、0.2％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)、0.2u/ml rnase inhibitor(重组型rnase抑制剂(鼠源)，accurate biology,ag11613)。将配置好的裂解液置于冰上进行预冷。
469.2)破碎样本。
470.将50mg猕猴桃根组织样本转入2ml离心管(axygen,mct-200-c)中。加入步骤(1)中冰上预冷的裂解液1ml，加入打碎用的钢珠。将离心管置于打碎用夹板并拧紧扳手，调节仪器转速为1200rpm，180秒。启动仪器进行组织破碎。
471.3)裂解细胞。
472.待仪器完全停止后，将离心管取出后插于冰中，静置孵育7分钟。
473.4)过滤。
474.用移液器将步骤(3)中的组织裂解液转移到一个新的15ml离心管(corning,430790)中。向离心管中加入9ml冰上预冷的pbs(gibco,10010-031)。于冰上静置1分钟。
475.使用移液器将裂解液逐次吸出，于40μm滤网(falcon,352340)进行过滤。过滤液收集到一新的50ml离心管(corning,430828)中。
476.注意操作均应在冰上进行。
477.5)过滤。
478.使用移液器，将步骤(4)中的过滤液逐次吸出，于40μm滤网(falcon,352340)进行过滤。将过滤液收集到一新的15ml离心管中。
479.注意操作均应在冰上进行。
480.6)差速离心。
481.将步骤(5)中的滤液补充预冷的pbs至10ml，4℃、100
×
g、10min离心。离心结束后，上清转移至新的离心管中，沉淀使用3ml预冷的pbs重悬。
482.8)镜检计数。
483.通过dapi染液，显微镜下镜检计算细胞核浓度、结团比例、杂质比例：分别取5μl步骤(6)中的上清液与重悬液，与dapi染液1:1进行混匀，用移液器吸取10ul加到血球计数板的加样孔中计数，显微镜观察计数区的细胞核个数。荧光显示为细胞核。
484.结果见表6
485.对比实施例38
486.本实施例依照使用密度梯度离心法去除草酸钙晶体。
487.1)配置裂解液。依照以下成分配置kr裂解液：
488.2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15mm柠檬酸钠、0.2％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)、0.2u/ml rnase inhibitor(重组型rnase抑制剂(鼠源)，accurate biology,ag11613)。将配置好的裂解液置于冰上进行预冷。
489.2)破碎样本。
490.将50mg猕猴桃根组织样本转入2ml离心管(axygen,mct-200-c)中。加入步骤(1)中冰上预冷的裂解液1ml，加入打碎用的钢珠。将离心管置于打碎用夹板并拧紧扳手，调节仪器转速为1200rpm，180秒。启动仪器进行组织破碎。
491.3)裂解细胞。
492.待仪器完全停止后，将离心管取出后插于冰中，静置孵育7分钟。
493.4)过滤。
494.用移液器将步骤(3)中的组织裂解液转移到一个新的15ml离心管(corning,430790)中。向离心管中加入9ml冰上预冷的pbs(gibco,10010-031)。于冰上静置1分钟。
495.使用移液器将裂解液逐次吸出，于40μm滤网(falcon,352340)进行过滤。过滤液收集到一新的50ml离心管(corning,430828)中。
496.注意操作均应在冰上进行。
497.5)过滤。
498.使用移液器，将步骤(4)中的过滤液逐次吸出，于40μm滤网(falcon,352340)进行过滤。将过滤液收集到一新的15ml离心管中。
499.注意操作均应在冰上进行。
500.6)密度梯度离心。
501.分别配置50％(m/v)蔗糖溶液、40％(m/v)蔗糖溶液、20％(m/v)蔗糖溶液、15％(m/v)蔗糖溶液。
502.将步骤(5)所得滤液，4℃、500
×
g、10min离心，离心结束后弃去上清液，使用6ml 15％(m/v)蔗糖溶液重悬细胞核沉淀。
503.在polyallomer离心管(beckman,355631)内从下到上依次加入50％(m/v)蔗糖溶液、40％(m/v)蔗糖溶液、20％(m/v)蔗糖溶液，之后将6ml细胞核溶液缓缓加在最上层，形成密度梯度。
504.18000rpm离心90min，分别取50％(m/v)蔗糖溶液层、40％(m/v)蔗糖溶液层和20％(m/v)蔗糖溶液层于三个新的离心管中。
505.7)镜检计数。
506.通过dapi染液，显微镜下镜检计算细胞核浓度、结团比例、杂质比例：分别取5μl步
骤(6)中的50％(m/v)蔗糖溶液层、40％(m/v)蔗糖溶液层和20％(m/v)蔗糖溶液层，与dapi染液1:1进行混匀，用移液器吸取10ul加到血球计数板的加样孔中计数，显微镜观察计数区的细胞核个数。荧光显示为细胞核。
507.结果见表6
508.对比实施例39
509.本实施例依照使用流式细胞术去除草酸钙晶体。
510.1)配置裂解液。依照以下成分配置kr裂解液：
511.2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15mm柠檬酸钠、0.2％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)、0.2u/ml rnase inhibitor(重组型rnase抑制剂(鼠源)，accurate biology,ag11613)。将配置好的裂解液置于冰上进行预冷。
512.2)破碎样本。
513.将50mg猕猴桃根组织样本转入2ml离心管(axygen,mct-200-c)中。加入步骤(1)中冰上预冷的裂解液1ml，加入打碎用的钢珠。将离心管置于打碎用夹板并拧紧扳手，调节仪器转速为1200rpm，180秒。启动仪器进行组织破碎。
514.3)裂解细胞。
515.待仪器完全停止后，将离心管取出后插于冰中，静置孵育7分钟。
516.4)过滤。
517.用移液器将步骤(3)中的组织裂解液转移到一个新的15ml离心管(corning,430790)中。向离心管中加入9ml冰上预冷的pbs(gibco,10010-031)。于冰上静置1分钟。
518.使用移液器将裂解液逐次吸出，于40μm滤网(falcon,352340)进行过滤。过滤液收集到一新的50ml离心管(corning,430828)中。
519.注意操作均应在冰上进行。
520.5)过滤。
521.使用移液器，将步骤(4)中的过滤液逐次吸出，于40μm滤网(falcon,352340)进行过滤。将过滤液收集到一新的15ml离心管中。
522.注意操作均应在冰上进行。
523.6)流式细胞仪分选。
524.在步骤(5)所得滤液中加入dapi染液，dapi的终浓度为5μg/ml。设置分选条件为紫外激发光下，蓝荧光信号(+)收集。
525.7)镜检计数。
526.通过dapi染液，显微镜下镜检计算细胞核浓度、结团比例、杂质比例：分别取5μl步骤(6)中收集液，与dapi染液1:1进行混匀，用移液器吸取10ul加到血球计数板的加样孔中计数，显微镜观察计数区的细胞核个数。荧光显示为细胞核。
527.结果见表6
528.对比实施例40
529.本实施例依照使用ms分选柱去除草酸钙晶体。
530.1)配置裂解液。依照以下成分配置裂解液：
531.2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15mm柠檬酸钠、0.2％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)、0.2u/ml rnase inhibitor(重组型rnase抑制剂(鼠
源)，accurate biology,ag11613)。将配置好的裂解液置于冰上进行预冷。
532.2)破碎样本。
533.将50mg猕猴桃根组织样本转入2ml离心管(axygen,mct-200-c)中。加入步骤(1)中冰上预冷的裂解液1ml，加入打碎用的钢珠。将离心管置于打碎用夹板并拧紧扳手，调节仪器转速为1200rpm，180秒。启动仪器进行组织破碎。
534.3)裂解细胞。
535.待仪器完全停止后，将离心管取出后插于冰中，静置孵育7分钟。
536.4)过滤。
537.用移液器将步骤(3)中的组织裂解液转移到一个新的15ml离心管(corning,430790)中。向离心管中加入9ml冰上预冷的pbs(gibco,10010-031)。于冰上静置1分钟。
538.使用移液器将裂解液逐次吸出，于40μm滤网(falcon,352340)进行过滤。过滤液收集到一新的50ml离心管(corning,430828)中。
539.注意操作均应在冰上进行。
540.5)过滤。
541.使用移液器，将步骤(4)中的过滤液逐次吸出，于40μm滤网(falcon,352340)进行过滤。将过滤液收集到一新的15ml离心管中。
542.注意操作均应在冰上进行。
543.6)离心收集沉淀。
544.将步骤(5)中的离心管置于离心机中，4℃下，300
×
g离心10分钟。
545.离心完成后，小心取出离心管，将上清小心的倒出，沉淀使用3ml冰上预冷的pbs进行重悬。
546.7)过滤。
547.将步骤(6)中的3ml重悬液全部加入ms column(miltenyi,130-042-201)中，将过滤液收集到一新的15ml离心管中，于冰上静置过滤，待液体完全过滤到15ml离心管中为止。
548.8)镜检计数。
549.通过dapi染液，显微镜下镜检计算细胞核浓度、结团比例、杂质比例：分别取5μl步骤(6)中收集液，与dapi染液1:1进行混匀，用移液器吸取10ul加到血球计数板的加样孔中计数，显微镜观察计数区的细胞核个数。荧光显示为细胞核。
550.结果见表6
551.对比实施例41
552.本实施例依照使用ls分选柱去除草酸钙晶体。
553.1)配置裂解液。依照以下成分配置裂解液：
554.2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15mm柠檬酸钠、0.2％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)、0.2u/ml rnase inhibitor(重组型rnase抑制剂(鼠源)，accurate biology,ag11613)。将配置好的裂解液置于冰上进行预冷。
555.2)破碎样本。
556.将50mg猕猴桃根组织样本转入2ml离心管(axygen,mct-200-c)中。加入步骤(1)中冰上预冷的裂解液1ml，加入打碎用的钢珠。将离心管置于打碎用夹板并拧紧扳手，调节仪器转速为1200rpm，180秒。启动仪器进行组织破碎。
557.3)裂解细胞。
558.待仪器完全停止后，将离心管取出后插于冰中，静置孵育7分钟。
559.4)过滤。
560.用移液器将步骤(3)中的组织裂解液转移到一个新的15ml离心管(corning,430790)中。向离心管中加入9ml冰上预冷的pbs(gibco,10010-031)。于冰上静置1分钟。
561.使用移液器将裂解液逐次吸出，于40μm滤网(falcon,352340)进行过滤。过滤液收集到一新的50ml离心管(corning,430828)中。
562.注意操作均应在冰上进行。
563.5)过滤。
564.使用移液器，将步骤(4)中的过滤液逐次吸出，于40μm滤网(falcon,352340)进行过滤。将过滤液收集到一新的15ml离心管中。
565.注意操作均应在冰上进行。
566.6)离心收集沉淀。
567.将步骤(5)中的离心管置于离心机中，4℃下，300
×
g离心10分钟。
568.离心完成后，小心取出离心管，将上清小心的倒出，沉淀使用3ml冰上预冷的pbs进行重悬。
569.7)过滤。
570.将步骤(6)中的3ml重悬液全部加入ls column(miltenyi,130-042-401)中，将过滤液收集到一新的15ml离心管中，于冰上静置过滤，待液体完全过滤到15ml离心管中为止。
571.9)镜检计数。
572.通过dapi染液，显微镜下镜检计算细胞核浓度、结团比例、杂质比例：分别取5μl步骤(6)中收集液，与dapi染液1:1进行混匀，用移液器吸取10ul加到血球计数板的加样孔中计数，显微镜观察计数区的细胞核个数。荧光显示为细胞核。
573.结果见表6
574.对比实施例42
575.本实施例洗涤条件为100
×
g、4℃、10min洗涤一次。
576.1)配置裂解液。依照以下成分配置裂解液：
577.2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15mm柠檬酸钠、0.2％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)、0.2u/ml rnase inhibitor(重组型rnase抑制剂(鼠源)，accurate biology,ag11613)。将配置好的裂解液置于冰上进行预冷。
578.2)破碎样本。
579.将50mg猕猴桃根组织样本转入2ml离心管(axygen,mct-200-c)中。加入步骤(1)中冰上预冷的裂解液1ml，加入打碎用的钢珠。将离心管置于打碎用夹板并拧紧扳手，调节仪器转速为1200rpm，180秒。启动仪器进行组织破碎。
580.3)裂解细胞。
581.待仪器完全停止后，将离心管取出后插于冰中，静置孵育7分钟。
582.4)过滤。
583.用移液器将步骤(3)中的组织裂解液转移到一个新的15ml离心管(corning,430790)中。向离心管中加入9ml冰上预冷的pbs(gibco,10010-031)。于冰上静置1分钟。
584.使用移液器将裂解液逐次吸出，于40μm滤网(falcon,352340)进行过滤。过滤液收集到一新的50ml离心管(corning,430828)中。
585.注意操作均应在冰上进行。
586.5)过滤。
587.使用移液器，将步骤(4)中的过滤液逐次吸出，于40μm滤网(falcon,352340)进行过滤。将过滤液收集到一新的15ml离心管中。
588.注意操作均应在冰上进行。
589.6)离心收集沉淀。
590.将步骤(5)中的离心管置于离心机中，4℃下，300
×
g离心10分钟。
591.离心完成后，小心取出离心管，将上清小心的倒出，沉淀使用3ml冰上预冷的pbs进行重悬。
592.7)过滤。
593.将步骤(6)中的3ml重悬液全部加入ms column(miltenyi,130-042-201)中，将过滤液收集到一新的15ml离心管中，于冰上静置过滤，待液体完全过滤到15ml离心管中为止。
594.8)离心收集沉淀。
595.将步骤(7)中的离心管置于离心机中，4℃下，100
×
g离心10分钟。
596.离心完成后，小心取出离心管，将上清小心的倒出，沉淀使用100μl冰上预冷的pbs进行重悬。
597.9)质检、镜检计数。
598.吸取上清液使用nanodrop微量分光光度计和荧光分光光度计测量上清液中rna的浓度。
599.通过dapi染液，显微镜下镜检计算活细胞核浓度、结团比例、杂质比例：取5μl步骤(8)中的重悬液，与dapi染液1:1进行混匀，用移液器吸取10ul加到血球计数板的加样孔中计数，显微镜观察计数区的细胞核个数。荧光显示为细胞核。
600.结果见表7
601.对比实施例43
602.本实施例洗涤条件为1000
×
g、4℃、10min洗涤一次。
603.1)配置裂解液。依照以下成分配置裂解液：
604.2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15mm柠檬酸钠、0.2％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)、0.2u/ml rnase inhibitor(重组型rnase抑制剂(鼠源)，accurate biology,ag11613)。将配置好的裂解液置于冰上进行预冷。
605.2)破碎样本。
606.将50mg猕猴桃根组织样本转入2ml离心管(axygen,mct-200-c)中。加入步骤(1)中冰上预冷的裂解液1ml，加入打碎用的钢珠。将离心管置于打碎用夹板并拧紧扳手，调节仪器转速为1200rpm，180秒。启动仪器进行组织破碎。
607.3)裂解细胞。
608.待仪器完全停止后，将离心管取出后插于冰中，静置孵育7分钟。
609.4)过滤。
610.用移液器将步骤(3)中的组织裂解液转移到一个新的15ml离心管(corning,
430790)中。向离心管中加入9ml冰上预冷的pbs(gibco,10010-031)。于冰上静置1分钟。
611.使用移液器将裂解液逐次吸出，于40μm滤网(falcon,352340)进行过滤。过滤液收集到一新的50ml离心管(corning,430828)中。
612.注意操作均应在冰上进行。
613.5)过滤。
614.使用移液器，将步骤(4)中的过滤液逐次吸出，于40μm滤网(falcon,352340)进行过滤。将过滤液收集到一新的15ml离心管中。
615.注意操作均应在冰上进行。
616.6)离心收集沉淀。
617.将步骤(5)中的离心管置于离心机中，4℃下，300
×
g离心10分钟。
618.离心完成后，小心取出离心管，将上清小心的倒出，沉淀使用3ml冰上预冷的pbs进行重悬。
619.7)过滤。
620.将步骤(6)中的3ml重悬液全部加入ms column(miltenyi,130-042-201)中，将过滤液收集到一新的15ml离心管中，于冰上静置过滤，待液体完全过滤到15ml离心管中为止。
621.8)离心收集沉淀。
622.将步骤(7)中的离心管置于离心机中，4℃下，1000
×
g离心10分钟。
623.离心完成后，小心取出离心管，将上清小心的倒出，沉淀使用100μl冰上预冷的pbs进行重悬。
624.9)质检、镜检计数。
625.吸取上清液使用nanodrop微量分光光度计和荧光分光光度计测量上清液中rna的浓度。
626.通过dapi染液，显微镜下镜检计算活细胞核浓度、结团比例、杂质比例：取5μl步骤(8)中的重悬液，与dapi染液1:1进行混匀，用移液器吸取10ul加到血球计数板的加样孔中计数，显微镜观察计数区的细胞核个数。荧光显示为细胞核。
627.结果见表7。
628.对比实施例44
629.本实施例洗涤条件为300
×
g、4℃、10min洗涤一次。
630.1)配置裂解液。依照以下成分配置裂解液：
631.2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15mm柠檬酸钠、0.2％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)、0.2u/ml rnase inhibitor(重组型rnase抑制剂(鼠源)，accurate biology,ag11613)。将配置好的裂解液置于冰上进行预冷。
632.2)破碎样本。
633.将50mg猕猴桃根组织样本转入2ml离心管(axygen,mct-200-c)中。加入步骤(1)中冰上预冷的裂解液1ml，加入打碎用的钢珠。将离心管置于打碎用夹板并拧紧扳手，调节仪器转速为1200rpm，180秒。启动仪器进行组织破碎。
634.3)裂解细胞。
635.待仪器完全停止后，将离心管取出后插于冰中，静置孵育7分钟。
636.4)过滤。
637.用移液器将步骤(3)中的组织裂解液转移到一个新的15ml离心管(corning,430790)中。向离心管中加入9ml冰上预冷的pbs(gibco,10010-031)。于冰上静置1分钟。
638.使用移液器将裂解液逐次吸出，于40μm滤网(falcon,352340)进行过滤。过滤液收集到一新的50ml离心管(corning,430828)中。
639.注意操作均应在冰上进行。
640.5)过滤。
641.使用移液器，将步骤(4)中的过滤液逐次吸出，于40μm滤网(falcon,352340)进行过滤。将过滤液收集到一新的15ml离心管中。
642.注意操作均应在冰上进行。
643.6)离心收集沉淀。
644.将步骤(5)中的离心管置于离心机中，4℃下，300
×
g离心10分钟。
645.离心完成后，小心取出离心管，将上清小心的倒出，沉淀使用3ml冰上预冷的pbs进行重悬。
646.7)过滤。
647.将步骤(6)中的3ml重悬液全部加入ms column(miltenyi,130-042-201)中，将过滤液收集到一新的15ml离心管中，于冰上静置过滤，待液体完全过滤到15ml离心管中为止。
648.8)离心收集沉淀。
649.将步骤(7)中的离心管置于离心机中，4℃下，300
×
g离心10分钟。
650.离心完成后，小心取出离心管，将上清小心的倒出，沉淀使用100μl冰上预冷的pbs进行重悬。
651.9)质检、镜检计数。
652.吸取上清液使用nanodrop微量分光光度计和荧光分光光度计测量上清液中rna的浓度。
653.通过dapi染液，显微镜下镜检计算活细胞核浓度、结团比例、杂质比例：取5μl步骤(8)中的重悬液，与dapi染液1:1进行混匀，用移液器吸取10ul加到血球计数板的加样孔中计数，显微镜观察计数区的细胞核个数。荧光显示为细胞核。
654.结果见表7
655.对比实施例45
656.本实施例洗涤条件为300
×
g、4℃、10min洗涤三次。
657.1)配置裂解液。依照以下成分配置裂解液：
658.2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15mm柠檬酸钠、0.2％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)、0.2u/ml rnase inhibitor(重组型rnase抑制剂(鼠源)，accurate biology,ag11613)。将配置好的裂解液置于冰上进行预冷。
659.2)破碎样本。
660.将50mg猕猴桃根组织样本转入2ml离心管(axygen,mct-200-c)中。加入步骤(1)中冰上预冷的裂解液1ml，加入打碎用的钢珠。将离心管置于打碎用夹板并拧紧扳手，调节仪器转速为1200rpm，180秒。启动仪器进行组织破碎。
661.3)裂解细胞。
662.待仪器完全停止后，将离心管取出后插于冰中，静置孵育7分钟。
663.4)过滤。
664.用移液器将步骤(3)中的组织裂解液转移到一个新的15ml离心管(corning,430790)中。向离心管中加入9ml冰上预冷的pbs(gibco,10010-031)。于冰上静置1分钟。
665.使用移液器将裂解液逐次吸出，于40μm滤网(falcon,352340)进行过滤。过滤液收集到一新的50ml离心管(corning,430828)中。
666.注意操作均应在冰上进行。
667.5)过滤。
668.使用移液器，将步骤(4)中的过滤液逐次吸出，于40μm滤网(falcon,352340)进行过滤。将过滤液收集到一新的15ml离心管中。
669.注意操作均应在冰上进行。
670.6)离心收集沉淀。
671.将步骤(5)中的离心管置于离心机中，4℃下，300
×
g离心10分钟。
672.离心完成后，小心取出离心管，将上清小心的倒出，沉淀使用3ml冰上预冷的pbs进行重悬。
673.7)过滤。
674.将步骤(6)中的3ml重悬液全部加入ms column(miltenyi,130-042-201)中，将过滤液收集到一新的15ml离心管中，于冰上静置过滤，待液体完全过滤到15ml离心管中为止。
675.8)离心收集沉淀。
676.将步骤(7)中的离心管置于离心机中，4℃下，300
×
g离心10分钟。
677.离心完成后，小心取出离心管，将上清小心的倒出，沉淀使用10ml冰上预冷的pbs进行重悬。
678.9)离心收集沉淀。
679.将步骤(8)中的离心管置于离心机中，4℃下，300
×
g离心10分钟。
680.离心完成后，小心取出离心管，将上清小心的倒出，沉淀使用10ml冰上预冷的pbs进行重悬。
681.10)离心收集沉淀。
682.将步骤(9)中的离心管置于离心机中，4℃下，300
×
g离心10分钟。
683.离心完成后，小心取出离心管，将上清小心的倒出，沉淀使用100μl冰上预冷的pbs进行重悬。
684.11)质检、镜检计数。
685.吸取上清液使用nanodrop微量分光光度计和荧光分光光度计测量上清液中rna的浓度。
686.通过dapi染液，显微镜下镜检计算活细胞核浓度、结团比例、杂质比例：取5μl步骤(10)中的重悬液，与dapi染液1:1进行混匀，用移液器吸取10ul加到血球计数板的加样孔中计数，显微镜观察计数区的细胞核个数。荧光显示为细胞核。
687.结果见表7
688.对比实施例46
689.本实施例实验样本为50mg拟南芥叶片，具体操作与实施例1相同。
690.结果见表8
691.对比实施例47
692.本实施例实验样本为50mg拟南芥根，具体操作与实施例1相同。
693.结果见表8
694.对比实施例48
695.本实施例实验样本为50mg玉米胚，具体操作与实施例1相同。
696.结果见表8
697.表1实施例1～4结果
[0698][0699]
本发明描述了一种适用于猕猴桃根组织单细胞核测序的方法，包括猕猴桃根组织细胞核提取的方法以及细胞核悬液优化方法。本发明所提供的技术方法可以将单细胞测序技术引入猕猴桃分子机制及育种的相关研究中，可以有效且高效的促进研究的进程。
[0700]
本发明设计的一种适用于猕猴桃根组织的单细胞核制备方法主要包括一种裂解液，其成分为2％～3％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15～25mm柠檬酸钠、0.2～0.4％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)、0.2～0.4u/ml rnase inhibitor(重组型rnase抑制剂(鼠源)，accurate biology,ag11613)。通过破碎样本、裂解细胞从组织中提取细胞核，再经筛网过滤、离心洗涤等悬液优化处理后得到数量大于1
×
106个、碎片率小于10％、结团率小于4％的细胞核悬液，满足10
×
单细胞测序对于细胞核悬液的质量要求。达到了使用高通量单细胞测序技术进行猕猴桃根组织研究的目的。
[0701]
为了得到本发明中的一种适用于猕猴桃根组织单细胞核测序的方法，进行了从裂解液配方、实验操作步骤、优化方法等方面的一系列探索，通过查阅资料与验证最终得到了本发明中的内容。首先通过对比实施例1～3，使用《identification ofopen chromatin regions in plant genomes usingatac-seq》中的方法分别进行了拟南芥叶片、猕猴桃叶片、猕猴桃根组织细胞核悬液制备，结果显示该文献中的方法仅可以完成拟南芥叶片组织细胞核悬液的制备，无法完成猕猴桃叶片与猕猴桃根组织的细胞核悬液制备；且制备得拟南芥叶片细胞核悬液中杂质占比稍高，虽满足单细胞测序对样本的最低要求，但进行单细胞测序存在风险。在对比实施例4～6中，使用《isolation of plant root nuclei for single cell rna sequencing》的方法使用现有商业化试剂盒提取细胞核实验进行了拟南芥根组织、猕猴桃叶片组织、猕猴桃根组织的细胞核悬液制备实验，结果显示，文献中所属方法仅可以完成拟南芥根组织细胞核悬液制备，无法完成猕猴桃叶片组织细胞核悬液制备，结果显示现有的商业化试剂盒提取得到的猕猴桃根细胞核数量极少，无法成功制备满
足单细胞测序的猕猴桃根组织细胞核悬液。上述的两种方法均表现出，制备出细胞核数量少，杂质极多的现象。裂解液充分裂解组织的同时有合适的缓冲液保障细胞核完整性是保障提取细胞核数量关键。
[0702]
首先通过对比实施例7～20，对适合猕猴桃根组织的缓冲体系进行了探索，结果如表1所示，现有方案中的缓冲体系无法适用于猕猴桃根组织细胞核提取实验；猕猴桃生长于野外，细胞生长机制与模式生物大不相同，猕猴桃根细胞中会富集草酸钙、醛类等。相比与模式生物拟南芥等需要更强缓冲能力的缓冲组分，在常用的缓冲组分中，tris-hcl、mops等均不适用。提高浓度会促进tris与溶液中醛以及各种酶的反应，导致裂解体系不稳定。最终经过探索选择了l-酒石酸与柠檬酸钠一起构建的缓冲体系。l-酒石酸常用于饮料和其他食品的酸味剂，有强的缓冲能力，在本发明中起主要缓冲作用；同时酒石酸还有较强的还原性，在本发明中发挥着对细胞核内核酸的保护作用。对比实施例结果显示缓冲组分浓度低时，无法保持缓冲液ph稳定，细胞核由于缓冲液ph变化而破碎；缓冲组分浓度高时，细胞核因为缓冲液中离子浓度高而发生结团，导致实验失败。因此本发明中细胞核制备缓冲组分为2％～3％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15～25mm柠檬酸钠。
[0703]
提取植物细胞核需要破坏细胞膜，细胞膜的基本结构是磷脂双分子层，常用的是使用去污剂破坏磷脂双分子层可以达到释放细胞核的目的。在对比实施例7～10中进行了裂解液配方的探索，通过不同性质不同工作原理的裂解组分进行实验，结果显示sds(十二烷基硫酸钠)、脱氧胆酸钠强去污剂作为裂解成分时，大量细胞核破碎，无法收集到足量完整的细胞核；洋地黄皂苷弱去污剂作为裂解成分时，由于洋地黄皂苷无法溶解膜蛋白，细胞膜结构无法得到充分破坏，可以收集到相对多一些的细胞核但仍无法满足单细胞测序对细胞核数量的要求。triton x-100属于温和的去污剂来源于聚氧乙烯，并含有一个烷苯基疏水基团，结合脂分子的能力介于十二烷基硫酸钠和洋地黄皂苷之间，且可以作为膜蛋白的助溶剂，裂解得到的细胞核数量较于洋地黄皂更多，但triton x-100作用于细胞膜的同时还会对核膜造成损伤，仍无法得到足量的细胞核进行单细胞核测序实验。常用的去污剂溶解细胞膜制备细胞核的方法不适用于猕猴桃根组织的细胞核制备实验，皂素常用于医药原料，主要用于激素类药物的合成。皂素是由皂苷和糖、糖醛酸或其他有机酸所组成，皂苷赋予了皂素乳化脂分子的功能。对比实施例结果显示，皂素作为裂解组分时，细胞核产量相比于sds、triton x-100等有极其显著的提升；同时因为皂素不会导致蛋白变性，所以皂素作为裂解组分是对细胞核核膜不会有损伤。对比实施例结果显示，皂素浓度低于2％时，细胞核数量会明显下降，因为皂素本身含有糖于有机酸等，皂素浓度高于4％时，会影响裂解体系的稳定性，细胞核数量减少。因此本发明裂解液中皂素的浓度范围是2％～4％(m/v)。
[0704]
表2对比实施例1～20
[0705]
[0706]
[0707]
[0708]
[0709][0710]
植物细胞膜外还有细胞壁包裹，细胞壁是由纤维素、半纤维素、果胶等成分构成，猕猴桃植株为大型落叶藤本，细胞壁的支撑强度要远远高于拟南芥，因此在破碎细胞壁的方法上，需要更强的破碎条件来帮助得到更多的细胞核。接下来通过对比实施例21～25，通过比较不同的处理方法包括刀片切碎、剪刀剪碎、匀浆化、破碎仪破碎、研钵研磨等对细胞核释放的影响，结果显示，刀片切碎、剪刀剪碎、研钵研磨的实验方法得到的细胞核数量都低于匀浆方法，研钵液氮研磨是组织破碎最充分的办法，但是研钵研磨破环细胞壁的同时对细胞核也造成了破坏。分析对比实施例结果得出，破碎仪破碎的方式辅助裂解液充分释放细胞核的同时对细胞核破坏更少，是提取猕猴桃根组织细胞核的最佳方法。
[0711]
表3对比实施例21～25
[0712][0713]
植物细胞核进行单细胞转录组实验时，需要保障细胞内mrna完整，而细胞破碎后，胞质中的rna酶释放到缓冲体系中会降解mrna，因此需要rna酶抑制剂和还原剂保护细胞核mrna，不同物种、组织中的rna酶含量差异较大，对比实施例26～28结果显示，针对50～100mg猕猴桃根组织，0.2～0.4u/ml rnase inhibitor(重组型rnase抑制剂(鼠源)，accurate biology,ag11613)可以很好的保护mrna完整性，提高rna酶抑制剂得到的结果无明显差异，还会造成成本提高和试剂的浪费，因此kr裂解液中rna酶抑制剂的浓度为0.2～0.4u/ml。
[0714]
表4.对比实施例26～28
[0715][0716]
组织经过裂解液处理后提取得到的粗细胞核悬液含有大量的细胞碎片等杂质和细胞破碎释放的mrna、细胞器等。这种条件下的细胞核悬液存在大的碎片无法进行单细胞测序实验，需要去除大的碎片后才能满足单细胞测序的要求，首先过滤去除较大的组织和细胞碎片，通过对比实施例29～33，验证了不同孔径筛网、不同过滤次数，过滤粗细胞核悬液的得率与除杂效率，对比实施例29结果显示70μm筛网不能很好的达到除杂的目的，经70μm筛网过滤后的悬液杂质减少不明显，两次过滤仍然无明显效果。破碎仪破碎的样本大于70μm的碎片较少，在对比实施例30～31中，验证了30μm孔径筛网过滤猕猴桃根粗细胞核悬液的效果，结果显示，30μm的细胞筛会导致细胞核的大量损失，且过滤过程受碎片率高的影响，过滤所需时间长，加大了细胞核内rna降解的风险，因此30μm筛网不能作为猕猴桃根粗细胞核悬液纯化的方法。通过对比实施例32～33结果可知，40μm细胞筛网可以快速的去除粗细胞核悬液中的杂质，纯化猕猴桃根粗细胞核悬液最好的方法是40μm细胞筛网过滤两次，除杂效率高达80％，同时细胞核得率大于70％，这个选择既快速有效降低了碎片率，又有着更高的细胞核得率。
[0717]
表5对比实施例29～33
[0718][0719]
猕猴桃植株在生长过程中，会在细胞/组织内富集大量的草酸钙针状晶体，这些草酸钙针状晶体是构成植物防御和自我保护的重要组成部分。而这些草酸钙晶体在组织破碎后会释放到细胞核悬液中(图3所示为细胞核悬液中草酸钙针状晶体)，筛网过滤后的细胞悬液中还存在针状结晶体，在筛网过滤中，无论是30μm还是70μm都无法有效的完成对该类杂质的过滤。而草酸钙晶体的存在会导致无法开展单细胞测序，草酸钙晶体在猕猴桃根组织中以针状晶体存在，粗细长短不一，根据显微镜观察可知草酸钙晶体长度大于70μm。通过对比实施例34验证70μm细胞筛网去除草酸钙晶体的效果，结果显示70μm细胞筛无法有效去除草酸钙针状晶体。通过对比实施例35～36验证了40μm、30μm筛网去除草酸钙晶体的效果，结果显示，减小筛网孔径仍然不能去除草酸钙晶体。草酸钙针状晶体很容易伴随液流穿过筛网，因此筛网过滤的方法无法去除草酸钙针状晶体。接下来通过对比实施例37～39，分别验证了差速离心法、密度梯度离心法、流式细胞术方法去除草酸钙晶体的效果，结果显示，差速离心法无法达到去除草酸钙晶体的作用，且会导致细胞核大量损失；密度梯度离心会导致细胞核的大量损失，继续进行单细胞核测序存在风险，杂质的比重与细胞核相近导致了密度梯度离心不能很好的纯化细胞核，差速离心法和密度梯度离心法都不能达到纯化的细胞核的目的。而草酸钙针状晶体的存在会直接导致流式细胞仪堵塞，无法收集足量的细胞核进行实验。对比实施例40～41使用macs分选柱进行细胞核悬液优化的探索，分选柱(macs)通常用于磁场下，通过带有磁珠的抗体结合目的细胞膜表面的特异性抗原，从而用于动物特定细胞类型的分选，在本发明中，在非磁场下，利用草酸钙晶体的针状形态特征和
分选柱中纳米材料的堆叠的特点，体积小的细胞核可以伴随液流穿过分选柱，针状草酸钙晶体则会被留在分选柱中，无法伴随液流穿过，达到纯化细胞核的目的可以达到除杂目的的同时保障细胞核得率，解决了单细胞核悬液优化的问题。结果显示，通过ms分选柱过滤单细胞核悬液得到的滤液各项指标都满足10
×
genmics平台对于单细胞测序的要求。
[0720]
表6.对比实施例34～41
[0721]
[0722][0723]
完成草酸钙晶体去除后，需要通过洗涤去除细胞核悬液中游离的mrna提高数据质量，同时需要对细胞核悬液的浓度进行调整，对比实施例42～45中，进行了对洗涤条件的验证。结果显示，过小的离心力会导致细胞核损失较大，过大的离心力会导致细胞核损伤，过多的洗涤次数会导致细胞核破碎；洗涤条件为4℃下，300
×
g～500
×
g离心10分钟，洗涤2次，细胞核悬液中游离的mrna基本去除干净，同时细胞核得率高于其它方法，是适合猕猴桃根组织细胞核悬液的洗涤条件。
[0724]
表7.对比实施例42～45
[0725][0726][0727]
不同物种、不同组织的植物细胞壁构成不同，细胞内容物的构成也不同，对比实施例46～48验证了kr裂解液与本专利中的细胞核提取、优化方法制备拟南芥叶片、拟南芥根
尖、玉米胚细胞核悬液的结果。结果显示，本专利中的细胞核制备方法，及相应的裂解液配方和细胞核优化方法与猕猴桃根组织一一对应，需要按照步骤先后进行才能完成猕猴桃根组织的细胞核悬液制备，对其它物种和组织不适用。
[0728]
表8.对比实施例46～48
[0729]
综上所述，本发明描述的一种适用于单细胞测序的猕猴桃根组织细胞核制备方法，通过对比实施例1～28得出了kr裂解液其成分为2％～3％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15～25mm柠檬酸钠、0.2～0.4％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)、0.2～0.4u/ml rnase inhibitor(重组型rnase抑制剂(鼠源)，accurate biolo；辅助猕猴桃根细胞核释放的方式为破碎仪破碎。通过对比实施例29～41得出了优化细胞核悬液的实验方法：40μm筛网过滤两遍去除大的碎片，ms分选柱去除草酸钙针状晶体；通过对比实施例42～45验证了一种细胞核高得率，去除环境rna的猕猴桃根组织细胞核悬液洗涤方法，为300～500
×
g、4℃、10min洗涤两次。对比实施例46～48结果显示本发明所述的kr裂解液、细胞核悬液过滤操作、细胞核悬液洗涤操作仅适用于猕猴桃根组织细胞核悬液制备。
[0730]
本发明描述的一种适用于单细胞测序的猕猴桃根组织细胞核制备方法可有效制备开展10x genomics平台单细胞转录组测序实验所需的细胞核悬液。本发明所述的一种适用于单细胞转录组测序的猕猴桃细胞核悬液制备方法中猕猴桃根、kr裂解液、细胞核悬液过滤操作、细胞核悬液洗涤操作、单细胞转录组测序结果之间是一一对应关系的，即猕猴桃根、kr裂解液、细胞核悬液过滤操作、细胞核悬液洗涤操作、单细胞转录组测序结果存在配伍关系。如，本发明实施例1～4提到的猕猴桃根、kr裂解液、细胞核悬液过滤操作，应当按照本发明中所指出的方法使用，才能有效的制备细胞核悬液，且制备得到的细胞核悬液各项指标能够达到单细胞转录组测序要求。本发明所述的一种适用于单细胞转录组测序的猕猴桃根细胞核悬液制备方法操作科学严谨，重复性高，能够有效地、高效地从猕猴桃根组织中分离得到数量足够多、杂质率低、极低环境rna的细胞核悬液，且得到的细胞核悬液能够达到10x genomics平台单细胞转录组测序各项指标。
[0731]
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离本发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。
技术特征：
1.一种适用于单细胞测序的猕猴桃根组织细胞核的制备方法，其特征在于，包括如下具体步骤：1)配置kr裂解液：首先配置kr裂解液，并将配置好的溶液预冷；2)破碎样本：将新鲜取材或者冻存的猕猴桃根组织样本转入离心管，加入预冷的所述kr裂解液及钢珠，依照仪器操作说明置于破碎仪上对组织进行破碎；3)裂解细胞：破碎后将离心管置于冰上孵育裂解；4)筛网过滤：将裂解后的组织裂解液转入离心管中，加入预冷的pbs，冰上静置1分钟，吸出组织裂解液，加入滤网中进行过滤得到过滤液；5)筛网过滤：使用滤网对步骤4)中的过滤液再进行一次过滤；6)离心收集沉淀：将步骤5)中的过滤液进行离心，丢弃上清，沉淀使用pbs进行重悬；7)过滤：将步骤6)中的沉淀重悬液全部加入分选柱中进行过滤；8)离心收集沉淀：将步骤7)中的过滤液进行离心，丢弃上清，沉淀使用pbs进行重悬。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述kr裂解液包含以下成份(终浓度)：2％～3％(v/v)l-酒石酸、15～25mm柠檬酸钠、0.2～0.4％(m/v)皂素、0.2～0.4u/ml重组型rnase抑制剂。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述破碎仪为万柏生物高通量组织破碎仪；所述破碎的条件为1200～1300rpm，170～180s；所述1ml的kr裂解液中添加50～100mg猕猴桃根组织。4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述孵育的时间为7～8分钟。5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述滤网为falcon 40μm cell strainer，孔径40μm；所述过滤全程在0～5℃操作。6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，所述离心的温度为4-6℃，离心的时间为10-15分钟，离心力为300～500
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g。7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(7)中，所述分选柱为miltenyi ms column；所述过滤，全程在0～5℃操作。8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(8)中，所述离心的温度为4-6℃，离心的时间为10-15分钟，离心力为300～500
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g。9.一种kr裂解液，其特征在于，所述kr裂解液包含以下成份(终浓度)：2％～3％(v/v)l-酒石酸、15～25mm柠檬酸钠、0.2～0.4％(m/v)皂素、0.2～0.4u/ml重组型rnase抑制剂。10.一种试剂/试剂盒，其特征在于，其包含如权利要求9所述的kr裂解液。11.如权利要求9所述的kr裂解液或如权利要求10所述的试剂/试剂盒在制备适用于单细胞测序的猕猴桃根组织细胞核的方法、猕猴桃根组织细胞核转录组测序、猕猴桃根组织细胞核atac测序研究中的应用。
技术总结
本发明公开了一种适用于单细胞测序的猕猴桃根组织细胞核的制备方法，通过独创的裂解液配方和细胞核悬液优化方法制备得到细胞核质量很高。与现有技术中6～7种组分的裂解液配方相比，本发明裂解液配方显著减少；实验流程在30分钟内即可完成细胞核的制备。本发明所述方法避免蔗糖沉积等步骤，节约试剂、耗材，降低成本，同时大大缩短时间，提高效率，便于大量样本实验的开展。本发明还公开了一种KR裂解液，试剂/试剂盒及其在制备适用于单细胞测序的猕猴桃根组织细胞核的方法中的应用。猴桃根组织细胞核的方法中的应用。
