一种采用激光促进气道基底细胞增殖的系统和方法与流程
1.本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种采用激光促进气道基底细胞增殖的系统和方法。
背景技术：
2.随着组织干细胞功能缺陷与慢性肺病(慢性阻塞性肺病、闭塞性细支气管炎、间质性肺病、肺纤维化等)的发生与进展关系的逐步明确，干细胞疗法在慢性肺病以及急性肺损伤的临床中获得越来越多的关注。
3.气道基底干细胞(bcs)因位于气道上皮基底层而得名，在人类传导气道的上皮和终末细支气管上皮中广泛存在。目前bcs的气道原位移植技术已获临床成功应用，在各类慢性肺病的中已经实现了干细胞对肺部病变组织的修复替代，取得了良好的效果。其临床应用主要源于自身突出的自我更新和分化能力：能够在气道或肺泡上皮组织受损时，激活自我更新和向其他气道上皮细胞分化功能，补充损失的细胞来维持气道和肺泡上皮的完整性，保持肺脏的正常功能。
4.bcs气道移植技术在各类慢性肺病的临床中具有优良的应用前景，但目前bcs气道移植技术尚存一定缺陷：需要经过bcs在体取材、分离提取与培养、体外扩增、细胞特性与安全检测、在体回输等一系列过程，过程繁琐、历时较长，特别是bcs的体外培养条件要求苛刻，且需要长期的体外培养，可能导致bcs功能异常，导致效果的不确定性。因此，一种全新的、安全的、具有直接在体调控细胞功能潜力的bcs增殖调控技术手段，对实现bcs增殖的可控性诱导，解决临床上bcs数量不足等问题具有重要意义。
5.目前激光技术与生物医学的交叉应用，为神经科学、癌症、细胞信号与功能调控等领域提供了全新的精确可控、安全高效的研究技术手段，在诸如神经细胞离子通道与细胞信号的调控、诱导癌细胞凋亡、干细胞组织修复等科学问题上取得了重要进展，显示了激光技术对生物医学研究的积极推动作用。其中激光技术凭借高精度、高安全性以及可直接在体调控等优势，在干细胞的基础研究领域获得了广泛应用，显示了在干细胞临床中的广阔应用前景，但在诱导与调控bcs增殖方面未有相关报道。
技术实现要素：
6.为了克服现有技术中的缺陷，本发明通过利用激光刺激提供了一种非接触、高时空精度、高激活效率和精密可控的bcs功能调控技术，在不需要向细胞内转染任何外源性的光敏蛋白或使用其它生化材料的情况下促进bcs的增殖能力，同时还具有鼠气道组织原位bcs增殖的诱导与调控作用，具有极高的临床应用价值。
7.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.本发明的第一方面是提供一种采用激光促进气道基底细胞增殖的系统，其是基于共聚焦显微镜搭建的，在共聚焦显微镜系统中的扫描光路中耦合入一飞秒激光(famtosecond laser)光路，并在飞秒激光光路中设置机械快门(shutter)用以控制飞秒激
光的开关；该系统通过明场观察或使用荧光探针标记相应的细胞分子标志物，在对气道基底细胞进行实时监测的同时完成飞秒激光在时间与空间上对气道基底细胞的精确刺激，实现对气道基底细胞生理活动的活化从而促进其增殖。
9.进一步地，上述共聚焦显微镜为奥林巴斯fv1200激光扫描共聚焦显微镜，其包括荧光倒置显微镜ix83、半导体激光器、成像检测系统、控制软件等。
10.进一步地，上述系统采用的飞秒激光器为光纤飞秒激光器、钛宝石飞秒激光器或飞秒激光泵浦的光学参量振荡器。
11.进一步地，上述系统基于奥林巴斯fv1200/ix83激光扫描共聚焦显微镜搭建，光纤飞秒激光器的光路经一个可旋转的半波片(1/2λ)、偏振分光棱镜(pbs)与一个机械快门后，经由数个镀膜反射镜耦合进入奥林巴斯fv1200/ix83激光扫描共聚焦显微镜的扫描光路。
12.进一步地，上述光纤飞秒激光器主要参数为：波长1030nm，脉冲宽度220fs，重复频率1mhz，最大输出功率10w，刺激细胞的平均功率使用约15mw。
13.进一步地，上述系统在共聚焦成像扫描过程中设置扫描振镜的工作方式，包括固定振镜的偏转角度以及设置特定的扫描区域，同步配合机械快门开关，实现扫描刺激模式或点刺激模式；在扫描刺激模式下，机械快门在扫描至定义的刺激区域时开启，在点刺激模式下，机械快门在扫描振镜固定的时刻开启。
14.进一步地，上述系统适用激发光光谱范围为《700nm的荧光染料或荧光蛋白作为检测细胞信号的标记物。
15.本发明的第二方面是提供一种采用上述系统的促进气道基底细胞增殖的方法，包括如下步骤：
16.步骤一，对离体气道基底细胞进行荧光染：采用钙离子染料fluo-4用以标记气道基底细胞内钙离子信号，采用anti-igta6抗体用以标记气道基底细胞膜表面的蛋白分子igta6，采用anti-ki67一抗与相应的二抗用以标记气道基底细胞内的增殖标志物ki67分子；
17.步骤二，将离体气道基底细胞或气管组织培养于共聚焦显微镜专用的玻底培养皿中，然后置于上述系统中，通过明场观察或荧光成像确定细胞位置以及刺激位置；
18.步骤三，选择合适的飞秒激光刺激模式对气道基底细胞进行光刺激，对钙离子进行实时监测，光刺激后将气道基底细胞或气道组织重新培养一定的时间；
19.步骤四，通过共聚焦成像中荧光变化观察细胞内相应的生理活动以及增殖能力的改变。
20.本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
21.本发明提供的系统可在共聚扫描成像的同时随时对单细胞或多细胞施加非接触的飞秒激光局部刺激并及时记录之后的细胞活动变化，可促进离体培养bcs增殖能力提升，也可进一步对气管组织中的bcs进行原位刺激，从而促进其在组织中增殖能力的提升。此外，除可以用于激活bcs细胞活性以促进bcs增殖外，该系统还可广泛应用在受光刺激引发或调控的细胞分子信号产生与传递、基因表达、精确细胞手术以及细胞器功能变化等研究领域。
附图说明
22.图1是本发明一实施例中促进气道基底细胞增殖的激光扫描共聚焦显微成像系统的结构光路图；
23.图2是本发明一实施例中扫描刺激模式的示意图；
24.图3是本发明一实施例中点刺激模式的示意图；
25.图4显示了本发明一实施例中飞秒激光扫描刺激模式下激活bcs内钙离子信号；
26.图5显示了本发明一实施例中飞秒激光点刺激模式下激活bcs内钙离子信号；
27.图6显示了本发明一实施例中飞秒激光刺激后bcs增殖能力标志物ki67表达比率上升；
28.图7显示了本发明一实施例中飞秒激光刺激后bcs的克隆团显著增大；
29.图8显示了本发明一实施例中飞秒激光对气管组织中的bcs进行原位刺激后ki67表达比率上升。
具体实施方式
30.本发明提供了一种采用激光促进气道基底细胞增殖的激光扫描共聚焦显微成像系统和方法。下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
31.实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
32.实施例1
33.本实施例提供了一种促进气道基底细胞增殖的激光扫描共聚焦显微成像系统，用于对bcs的精确定位以及细胞生理活动的实时监测。如图1所示，该系统基于奥林巴斯fv1200/ix83激光扫描共聚焦显微镜搭建，光纤飞秒激光器的光路经一个可旋转的半波片(1/2λ)，偏振分光棱镜与一个机械快门后，经由数个镀膜反射镜耦合进入显微镜的扫描光路；该系统使用奥林巴斯fv1200系统操控软件进行刺激模式(扫描刺激模式和点刺激模式)与刺激参数(刺激区域或位置以及刺激时间)的设定，以及成像分析，通过对bcs内相应分子标志物进行化学染料染或免疫荧光染后，通过共聚焦成像中荧光变化反应细胞内相应的生理活动以及增殖能力的改变。
34.上述光纤飞秒激光器的主要参数为波长1030nm，脉冲宽度220fs，重复频率1mhz，最大输出功率10w，刺激细胞的平均功率使用约15mw。该系统使用倍率为60x的浸水物镜，数值孔径1.2或倍率为30x的浸油物镜30x，数值孔径1.15，并使用fv1200配套的405nm、473nm与543nm半导体激光器作为荧光与明场成像的激发光源。
35.通过机械快门控制飞秒激光对细胞的曝光刺激时间，快门时间分辨率为10ms，快门的开关与扫描振镜(galvo mirror)同步，在扫描刺激模式下，快门在扫描至定义的刺激区域时开启，在点刺激模式下，快门在扫描振镜固定的时刻开启。在扫描刺激模式下曝光时间为定义刺激区域扫描一帧的时间，点刺激模式下一般选择0.1～0.2s的曝光时间。
36.如图2所示，扫描刺激模式下的扫描区域通过共聚焦显微镜控制软件进行设定，共聚焦成像区域像素点数目为512
×
512，刺激区域根据成像范围内目标细胞分布进行设置，一般为共聚焦成像区域中的任意部分或全部。相应的刺激为扫描一次刺激区域内所有像素
点所需的时间。
37.该模式下，设定扫描每个像素点时间为2μs。刺激区域一般选择半个成像区域(像素点数512
×
256)或全部区域(512
×
512)，相应的刺激时间为0.55s或1.1s。当扫描进行至刺激区域时，飞秒激光光路的机械快门同步开启，对刺激区域进行一帧扫描刺激后快门关闭，完成对区域内bcs的光刺激。
38.如图3所示，点刺激模式下的刺激点通过共聚焦显微镜控制软件进行设定，共聚焦成像区域像素点数目为512
×
512，刺激点根据成像范围内目标细胞位置进行设置，可设置为成像区域内的任意一点，一般选择为目标细胞内内质网区域的任意一点。当扫描进行至刺激点时，扫描振镜固定，飞秒激光光路的机械快门同步开启，对刺激点进行0.1s～0.2s的曝光后快门关闭，完成对目标bc的光刺激，之后扫描振镜恢复扫描成像模式。
39.实施例2
40.本实施例提供了一种采用实施例1的系统的促进气道基底细胞增殖的方法并对该方法进行了验证，包括如下步骤：
41.1.细胞培养
42.离体的气道基底干细胞在专用细胞培养系统中培养，培养环境为37℃，5％二氧化碳。
43.气管组织取材自c57bl/6小鼠，解剖小鼠，提取主气管，纵向剖开，展平，使用组织胶水将其固定于带微刻度的细胞爬片上，置于专用细胞培养系统中培养，培养环境为37℃，5％二氧化碳。
44.2.细胞荧光染
45.钙离子染料fluo-4用以标记bcs内钙离子信号，用以监测bcs内钙离子信号变化；anti-igta6抗体用以标记bcs细胞膜表面的蛋白分子igta6，从而对bcs进行荧光成像定位；anti-ki67一抗与相应的二抗用以标记bcs内的增殖标志物ki67分子，从而确定bcs的增值能力。标记规程按照相应的产品手册进行。
46.3.激光共聚焦显微成像以及飞秒激光刺激
47.离体bcs以及气管组织培养于共聚焦显微镜专用的玻底培养皿中，实验前进行fluo-4荧光染料或anti-igta6免疫荧光抗体染，以便对bcs进行精确定位。实验中显微镜物镜一般选择为数值孔径1.2的60x浸水物镜，或数值孔径1.15的30x浸油物镜。
48.对离体bcs或气道组织进行荧光标记后，将bcs或气道组织置于上述共聚焦显微成像与飞秒激光刺激系统中，选择合适的飞秒激光刺激模式对bcs进行光刺激，对钙离子进行实时监测，光刺激后将bcs或气道组织重新置于37℃，5％二氧化碳的培养环境中进行培养一定的时间。
49.4.bcs增殖能力的检测
50.光刺激后的离体bcs或气道组织，通过对增殖标志物ki67进行免疫荧光染，免疫荧光染规程按照相应的产品手册进行。染后使用共聚焦显微镜进行荧光成像检测。
51.5.结果
52.由图4和图5可知，两种飞秒激光刺激模式均可激活离体bcs的钙离子信号。
53.由图6可知，光刺激后24小时与48小时后，光激活的bcs中ki67表达阳性的比率要显著高于未被进行光激活的离体bcs，显示了飞秒激光刺激可显著促进离体bcs的增殖能
力。
54.由图7可知，光刺激后3-5天内离体bcs形成的细胞克隆团直径相比未被进行光刺激的bcs有显著增大，说明其克隆团内细胞数量显著提升，表明光刺激可显著促进离体bcs的增殖能力。
55.由图8可知，光刺激后1天与7天后，对气道组织中bcs进行原位光刺激后ki67表达阳性的比率要显著高于未被进行光激活的bcs，显示了飞秒激光刺激也可显著促进气道原位bcs的增殖能力。
56.以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
技术特征：
1.一种采用激光促进气道基底细胞增殖的系统，其特征在于，是基于共聚焦显微镜搭建的，在共聚焦显微镜系统中的扫描光路中耦合入一飞秒激光光路，并在飞秒激光光路中设置机械快门用以控制飞秒激光的开关；所述系统通过明场观察或使用荧光探针标记相应的细胞分子标志物，在对气道基底细胞进行实时监测的同时完成飞秒激光在时间与空间上对气道基底细胞的精确刺激，实现对气道基底细胞生理活动的活化从而促进其增殖。2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述共聚焦显微镜为奥林巴斯fv1200激光扫描共聚焦显微镜。3.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述系统采用的飞秒激光器为光纤飞秒激光器、钛宝石飞秒激光器或飞秒激光泵浦的光学参量振荡器。4.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述系统基于奥林巴斯fv1200/ix83激光扫描共聚焦显微镜搭建，光纤飞秒激光器的光路经一个可旋转的半波片、偏振分光棱镜与一个机械快门后，经由数个镀膜反射镜耦合进入奥林巴斯fv1200/ix83激光扫描共聚焦显微镜的扫描光路。5.根据权利要求4所述的系统，其特征在于，所述光纤飞秒激光器主要参数为：波长1030am，脉冲宽度220fs，重复频率1mhz，最大输出功率10w，刺激细胞的平均功率使用约15mw。6.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述系统在共聚焦成像扫描过程中设置扫描振镜的工作方式，包括固定振镜的偏转角度以及设置特定的扫描区域，同步配合机械快门开关，实现扫描刺激模式或点刺激模式；在扫描刺激模式下，机械快门在扫描至定义的刺激区域时开启，在点刺激模式下，机械快门在扫描振镜固定的时刻开启。7.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述系统适用激发光光谱范围为<700nm的荧光染料或荧光蛋白作为检测细胞信号的标记物。8.一种采用如权利要求1-7任一项所述系统的促进气道基底细胞增殖的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一，对离体气道基底细胞进行荧光染：采用钙离子染料fluo-4用以标记气道基底细胞内钙离子信号，采用anti-igta6抗体用以标记气道基底细胞膜表面的蛋白分子igta6，采用anti-ki67一抗与相应的二抗用以标记气道基底细胞内的增殖标志物ki67分子；步骤二，将离体气道基底细胞或气管组织培养于共聚焦显微镜专用的玻底培养皿中，然后置于所述系统中，通过明场观察或荧光成像确定细胞位置以及刺激位置；步骤三，选择合适的飞秒激光刺激模式对气道基底细胞进行光刺激，对钙离子进行实时监测，光刺激后将气道基底细胞或气道组织重新培养一定的时间；步骤四，通过共聚焦成像中荧光变化观察细胞内相应的生理活动以及增殖能力的改变。
技术总结
本发明提供了一种采用激光促进气道基底细胞增殖的系统和方法。该系统是基于共聚焦显微镜搭建的，在共聚焦显微镜系统中的扫描光路中耦合入一飞秒激光光路，并在飞秒激光光路中设置机械快门用以控制飞秒激光的开关；该系统通过明场观察或使用荧光探针标记相应的细胞分子标志物，在对气道基底细胞进行实时监测的同时完成飞秒激光在时间与空间上对气道基底细胞的精确刺激。本发明提供的系统可在共聚扫描成像的同时随时对单细胞或多细胞施加非接触的飞秒激光局部刺激并及时记录之后的细胞活动变化，可促进离体培养BCs增殖能力提升，也可进一步对气管组织中的BCs进行原位刺激，从而促进其在组织中增殖能力的提升。而促进其在组织中增殖能力的提升。而促进其在组织中增殖能力的提升。
