用于靶向免疫疗法的化合物的制作方法
用于靶向免疫疗法的化合物
1.本技术是申请日为2013年7月16日、申请号为201380033552.6、名称为“用于靶向免疫疗法的化合物”的专利申请的分案申请。
2.相关申请的交叉引用
3.本技术要求2012年7月18日提交的中国专利申请第201210248481.9号的权益以及优先权，该中国专利申请的全部内容在此通过引用并入本文。
技术领域
4.本发明涉及用于靶向免疫疗法的化合物以及含有该化合物的组合物。本发明还涉及所述化合物在诸如癌症之类的疾病中的应用。
背景技术：
5.性抗体已用于临床应用二十多年。目前已有十五种抗肿瘤抗体药物用于临床，这些药物包括：rituxan(1997),herceptin(1998),mylotarg(2000),campath(2001),zevalin(2002),bexxer(2003),avastin(2004),erbitux(2004),vectibix(2006)；arzerra(2009)；benlysta(2011)；yervoy(2011)；adcetris(2011)；perjeta(2012)；和kadcyla(2013)。这些抗体主要靶定四种分子：egfr、her2、cd20和vegf。
6.总体而言，性抗体通过三种机制(scott am,wolchok jd,old lj.antibody therapy of cancer.nat rev cancer.(2012),12:278-87)杀伤肿瘤细胞：(1)抗体直接作用，也就是阻断或激动配体/受体信号转导活性，诱导细胞凋亡并递送药物或细胞毒素剂。抗体受体活化活性可产生直接杀伤肿瘤细胞的作用。例如，一些抗体可与肿瘤细胞表面的受体结合，活化受体，导致细胞凋亡(例如，在线粒体中)。抗体还可通过受体拮抗活性介导肿瘤细胞杀伤。例如，一些抗体可与细胞表面受体结合并阻断二聚化作用、激酶活化以及下游信号转导，从而抑制增殖并促进细胞凋亡。抗体与酶的结合可导致中和作用、信号阻断以及细胞死亡。(2)免疫介导的细胞杀伤机制，该机制包括补体依赖性细胞毒性(cdc)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)、t细胞功能调节，等等。免疫介导的肿瘤细胞杀伤可通过如下方式完成：诱导吞噬作用、活化补体、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性、通过单链可变片段(scfv)使基因修饰的t细胞靶定肿瘤，通过树突细胞的抗体介导的抗原交叉呈递活化t细胞、抑制t细胞抑制性受体(例如，细胞毒性t淋巴细胞相关抗原4(ctla4))。其中，抗体的fc部分的特性对于cdc和adcc介导的肿瘤细胞杀伤作用特别重要。(3)抗体对肿瘤脉管系统和基质的特异性效应，通过捕获血管受体拮抗剂或配体诱导血管和基质细胞消融，包括：抑制基质细胞、将毒素递送至基质细胞以及将毒素递送至脉管系统(scott am,wolchok jd,old lj.antibody therapy of cancer.nat rev cancer.2012,12(4):278-87)。
7.性单克隆抗体药物推进了抗癌药物的研究和开发。然而，仍然存在一些问题需要进一步研究解决，例如，抗体的免疫原性、长期使用肿瘤靶标的耐受性以及单纯地单一阻断信号转导通路的长期作用。简言之，大多数抗体难以实现对肿瘤细胞长期有效的抑制和杀伤作用。
8.1964年，“自然(nature)”杂志发表了抗体-药物偶联(adc)技术这一新观点，该观点近年来得到突破性发展。adc使抗体与高毒物(毒素)通过化学连接体(连接体)共价连接。抗体识别癌细胞表面抗原分子，内吞作用将adc带入细胞质内，具体而言，连接体水解之后释放的细胞内环境毒素杀伤细胞。
9.seattle genetics已研发了brentuximab vedotin(商品名为adcetris)这种药物，其已被fda批准上市。其为单甲基auristatin e(mmae)，一种合成的毒性抗癌药物，其与靶向淋巴瘤细胞特异性cd30分子的抗体连接，具有改进的杀伤肿瘤细胞的效用。
10.目前，已对几十种这样的adc药物开展了临床试验。其中，genentech和immunogen联合开发了用于乳腺癌的与美登素(maytansine)偶联的曲妥珠单抗，一种名为ado-曲妥珠单抗emtansine的药物(kadcyla)，其也被称为t-dm1。2013年2月，fda已批准t-dm1用于人表皮生长因子受体2(her2)-阳性转移性乳腺癌。美登素为一种小分子毒素，其可与微管蛋白结合并可通过形成非还原性双-马来酰亚胺-丙二醇复合物防止微管形成。曲妥珠单抗通过靶向人her2对乳腺癌和胃癌起作用。曲妥珠单抗已被批准用于her2-阳性癌症。然而，曲妥珠单抗无法促进所有的her2-阳性细胞的细胞凋亡。t-dm1使选择性靶向her2受体的曲妥珠单抗与有效的细胞毒性剂美登素结合，从而杀伤肿瘤细胞。t-dm1抗体结合her2受体，导致从偶联物中释放的美登素产生细胞内在化作用，从而杀伤肿瘤细胞。t-dm1具有更好的整体疗效、药代动力学性质以及较低的毒性。
11.传统的小分子化疗药物具有很强的毒性和药代动力学优势，但是在肿瘤的过程中传统的小分子化疗药物可影响其他生理靶标，产生严重的副作用。抗体-药物偶联物使靶向作用和具有特定的药代动力学的小分子药物结合。抗体-药物偶联物的结构为具有靶向功能的单克隆抗体与具有特定的药理学性质的化合物的连接。这种技术需要性抗体与靶标特异性结合，与诸如细胞毒素之类的具有作用或其他功能的分子偶联。诸如偶联的抗体的内吞作用、偶联的稳定性以及毒素的释放和杀伤活性之类的许多因素影响这种类型的抗体的作用。
12.目前正在使用的毒素分子包括微管蛋白抑制剂auristatin类似物单甲基auristatin e、单甲基auristatin f和美登素。单甲基auristatin e为合成的微管聚合物抑制剂，其可抑制微管聚集，干扰肿瘤细胞有丝分裂并且可诱导细胞凋亡(naumovski l and junutula jr.glembatumumab vedotin,a conjugate of an anti-glycoprotein non-metastatic melanoma protein b mab and monomethyl auristatin e for treatment of melanoma and breast cancer.curr opin mol ther2003；12(2):248-57.francisco ja,cerveny cg等人，cac10-vcmmae,an anti-cd30-monomethyl auristatin e conjugate with potent and selective antitumor activity.blood 102(4):1458-65)。单甲基auristatin f为抗有丝分裂auristatin衍生物，在c末端具有带电荷的苯丙氨酸残基。与不带电荷的mmae相比，单甲基auristatin f最小化对细胞信号通路的破坏并且最小化细胞毒性。大量cd30细胞测试发现mab-马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-p-氨基苄氧基羰基-mmaf(mab-l1-mmaf)的毒性比单独的mmaf的毒性强2,200倍(doronina so等人,enhanced activity of monomethylauristatin f through monoclonal antibody delivery:effects of linker technology on efficacy and toxicity.bioconjug chem,2006；17(1):p114-24)。美登素为起到微管蛋白聚合的抑制剂
作用的抗有丝分裂剂，其干扰细胞核内的微管的形成。美登素还抑制dna、rna和蛋白质合成，已经发现美登素的最大影响是对与dna合成。
13.抗体-药物偶联物具有直接和间接抗癌作用。抗体阻断或活化配体/受体信号转导，诱导细胞凋亡，并且同时抗体可直接或间接地向肿瘤细胞呈递或递送有效载荷药物(例如，药物、毒素、小干扰rna或放射性同位素)。性抗体药物偶联物使用抗体和偶联的药物的双重特性，第一为与靶标分子特异性结合的结合功能，第二为抗体自身的肿瘤细胞杀伤功能，以及第三为偶联的药物的特定作用。目前使用的抗体-药物偶联药物限于如何直接杀伤肿瘤细胞。然而，由于在抗体、连接体分子、毒素分子、偶联方面的严格的技术要求以及能够带入肿瘤微环境分子内的毒素有限，在实际的临床研究中仍然存在一些难题。
技术实现要素：
14.一方面，本发明提供一种具有通式(i)的结构的化合物：
15.tm-ln-am
ꢀꢀ
(i)，
16.其中，tm为靶向部分，am为能够活化人免疫细胞的活化部分，ln为连接体，n为选自0和1的整数，所述人免疫细胞包括但不限于：树突细胞、巨噬细胞、单核细胞、骨髓衍生的抑制细胞、nk细胞、b细胞、t细胞或肿瘤细胞或者它们的组合。
17.在一些实施方式中，人树突细胞为浆细胞样树突细胞。在一些实施方式中，人树突细胞为髓样树突细胞。
18.在一些实施方式中，am能够特异性结合人toll样受体7(tlr7)和/或人tlr8或者能够通过tlr7和/或tlr8活化人免疫细胞。
19.另一方面，本发明提供一种具有通式(i)的结构的化合物：
20.tm-ln-am
ꢀꢀ
(i)，
21.其中，tm为靶向部分，am为能够特异性结合人tlr7和/或人tlr8或者能够通过tlr7和/或tlr8活化人免疫细胞的活化部分，ln为连接体，n为选自0和1的整数。
22.在一些实施方式中，am能够特异性结合人tlr7和人tlr8这两者；或者能够通过tlr7和/或tlr8活化人免疫细胞。
23.在一些实施方式中，当tm包括抗体时，am不包括cpg寡核苷酸。
24.在一些实施方式中，其中，所述靶向部分能够特异性结合肿瘤细胞或者相对于非肿瘤细胞优先结合肿瘤细胞。在一些实施方式中，所述肿瘤细胞为癌细胞、肉瘤细胞、淋巴瘤细胞、骨髓瘤细胞或中枢神经系统癌症细胞。
25.在一些实施方式中，所述靶向部分能够特异性结合肿瘤抗原或者相对于非肿瘤抗原优先结合肿瘤抗原。在一些实施方式中，所述肿瘤抗原选自：cd2,cd19,cd20,cd22,cd27,cd33,cd37,cd38,cd40,cd44,cd47,cd52,cd56,cd70,cd79和cd137。在一些实施方式中，所述肿瘤抗原选自：4-1bb,5t4，ags-5,ags-16,血管生成素2,b7.1,b7.2,b7dc,b7h1,b7h2,b7h3,bt-062,btla,caix,癌胚抗原,ctla4,cripto,ed-b,erbb1,erbb2,erbb3,erbb4,egfl7,epcam,epha2,epha3,ephb2,fap,纤连蛋白,叶酸盐受体,神经节苷酯gm3,gd2,糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(gitr),gp100,gpa33,gpnmb,icos,igf1r,整联蛋白αν,整联蛋白ανβ,kir,lag-3,lewisy,间皮素,c-met,mn碳酸酐酶ix,muc1,muc16,粘连蛋白-4,nkgd2,notch,ox40,ox40l,pd-1,pdl1,psca,psma,rankl,ror1,ror2,slc44a4,多配体蛋白
聚糖-1,taci,tag-72,腱生蛋白,tim3,trailr1,trailr2,vegfr-1,vegfr-2,vegfr-3和它们的变体。
26.在一些实施方式中，所述靶向部分包含免疫球蛋白、蛋白质、肽、小分子、纳米颗粒或核酸。
27.在一些实施方式中，所述靶向部分包含抗体或其功能片段。在一些实施方式中，所述抗体选自：美罗华(利妥昔单抗)、赫赛汀(曲妥珠单抗)、爱必妥(西妥昔单抗)、维克替比(帕尼单抗)、arzerra(ofatumumab)、benlysta(贝利木单抗)、yervoy(伊匹单抗)、perjeta(帕妥珠单抗)、tremelimumab、nivolumab、dacetuzumab、urelumab、mpdl3280a、lambrolizumab和blinatumomab。
28.在一些实施方式中，所述靶向部分包含fab、fab’、f(ab’)2、单结构域抗体、t和abs二聚物、fv、scfv、dsfv、ds-scfv、fd、线性抗体、微抗体、双体抗体、双特异性抗体片段、bibody、tribody、sc-双体抗体、κ(λ)body、bite、dvd-ig、sip、smip、dart或者含有一个或一个以上cdr的抗体类似物。
29.在一些实施方式中，所述靶向部分包含vegfr的atwlppr多肽、血小板反应蛋白-1模拟物、cdcrgdcfcg(环状)多肽、sch 221153片段、ncngrc(环状)多肽、ctthwgftlc多肽、cgnkrtrgc多肽(lyp-1)、奥曲肽、伐普肽、兰乐肽、c-3940多肽、达必佳、利普安、诺雷德或西曲瑞克。
30.在一些实施方式中，所述靶向部分包含叶酸或其衍生物。
31.在一些实施方式中，所述靶向部分包含细胞外结构域(ecd)或pd-1,ctla4,btla,kir,tim3,4-1bb,lag3的可溶形式、全长的部分表面配体双调蛋白、β动物纤维素、egf、肝配蛋白、epigen、上皮调节蛋白、igf、神经调节蛋白、tgf、trail或vegf。
32.在一些实施方式中，所述靶向部分包含纳米颗粒。
33.在一些实施方式中，所述靶向部分包含适体。
34.在一些实施方式中，所述活化部分包含：(a)单链rna(ssrna)，优选地为orn02、orn06、sspoly(u)、ssrna40、ssrna41、ssrna-dr或poly(dt)；或者(b)toll样受体配体(tlrl)类似物，优选地为cl075、cl097、cl264、cl307、gardiquimod、洛索立宾、咪喹莫特或瑞喹莫德。
35.在一些实施方式中，所述连接体选自：肼基团，多肽，二硫化物基团和硫醚基团。
36.在一些实施方式中，所述连接体为酶可裂解的。在一些实施方式中，所述连接体不为酶可裂解的。
37.在一些实施方式中，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含本文提供的化合物或其药学上可接受的盐，以及一种或一种以上药学上可接受的载体。
38.在一些实施方式中，所述药物组合物还包含第二化疗剂。在一些实施方式中，所述化疗剂选自：它莫西芬(tamoxifen)，雷洛昔芬(raloxifene),阿那曲唑(anastrozole),依西美坦(exemestane),来曲唑(letrozole),imatanib,紫杉醇,环磷酰胺,洛伐他汀(lovastatin),minosine,吉西他滨(gemcitabine),阿糖胞苷(cytarabine),5-氟尿嘧啶,甲氨蝶呤,多西他赛(docetaxel),戈舍瑞林(goserelin),长春新碱,长春碱,噻氨酯哒唑(nocodazole),替尼泊苷(teniposide),依托泊苷(etoposide),吉西他滨,埃博霉素,长春瑞滨(vinorelbine),喜树碱,道诺霉素(daunorubicin),放线菌素d,米托蒽醌,吖啶,阿霉
素,表柔比星,或去甲氧基柔红霉素。
39.另一方面，本发明提供一种用于需要这种的受治者体内的疾病病症的方法，所述方法包括将药物组合物给药于所述受治者，所述药物组合物包含有效量的本文提供的化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。
40.在一些实施方式中，所述疾病病症为肿瘤。在一些实施方式中，所述疾病病症包括异常细胞增殖。在一些实施方式中，所述异常细胞增殖包括癌前病变。在一些实施方式中，所述异常增殖的细胞为癌细胞。
41.在一些实施方式中，所述癌症选自：乳腺癌、结肠直肠癌、弥漫性大b细胞淋巴瘤、子宫内膜癌、滤泡性淋巴瘤、胃癌、胶质母细胞瘤、头颈癌、肝细胞癌、肺癌、黑素瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和肾细胞癌。
42.又一方面，本发明提供一种具有通式(i)的结构的化合物：
43.tm-ln-am(i)，
44.其中，tm为靶向部分，am为活化部分，ln为连接体，n为选自0和1的整数，条件是，当tm包含抗体时，am不包含cpg寡核苷酸或剂。
45.在一些实施方式中，所述活化部分包含tlr配体、nod样受体配体、rig样受体配体、clr配体、cds配体或炎性体诱导物。
46.在一些实施方式中，所述活化部分包含一种或一种以上选自以下的tlr(toll样受体配体，tlrl)的配体：tlr2,tlr3,tlr4,tlr5,tlr7,tlr8,tlr7/tlr8,tlr9,和tlr10。
47.在一些实施方式中，所述活化部分包含：
48.(i)tlr2的配体，其选自：(a)热杀死的细菌产物，优选地为hkal,hkeb,hkhp,hklm,hklp,hklr,hkmf,hkpa,hkpg,或hksa,hksp，和(b)细胞壁成分产物，优选地为lam,lm,lps,lta,lta,pgn,fsl,pam2csk4,pam3csk4,或酵母聚糖；
49.(ii)tlr3的配体，其选自：poly(i:c)和poly(a:u)；
50.(iii)tlr4的配体，其选自：lps和mpla；
51.(iv)tlr5的配体，其选自：fla和鞭毛蛋白；
52.(v)tlr7/8的配体，其选自：orn02,orn06,sspoly(u),ssrna40,ssrna41,ssrna-dr,poly(dt),cl075,cl097,cl264,cl307,gardiquimod,洛索立宾,咪喹莫特,和瑞喹莫德；
53.(vi)tlr9的配体，其选自：odn1585,odn1668,odn1826,odn2006,odn2007,odn2216,odn2336,odn2395,和odn m362；
54.(vii)tlr10的配体；
55.(viii)核苷酸-寡聚结构域(nod)样配体，其选自：nod1激动剂(c12-ie-dap,ie-dap,tri-dap)、nod2激动剂(l18-mdp,mdp,m-trilys,m-trilys-d-asn,莫拉丁酯(murabutide),n-羟乙酰基-mdp)和nod1/nod2激动剂(m-tridap,pgn)；
56.(ix)一个或一个以上rig-i样受体(rlr)的配体，其选自：5’ppp-dsrna,poly(da:dt),poly(dg:dc),和poly(i:c)；
57.(x)一个或一个以上c型植物凝集素受体(clr)的配体，其选自：凝胶多糖al，hkca，hksc，wgp，酵母聚糖和海藻糖-6,6-二山嵛酸盐；
58.(xi)一个或一个以上细胞溶质dna传感器(cds)的配体，其选自：c-gmp,c-g-amp,c-g-gmp,c-a-amp,c-di-amp,c-di-imp,c-di-gmp,c-di-ump,hsv-60,isd,pcpg,poly(da:
dt),poly(dg:dc),poly(da),和vacv-70；或
59.(xii)炎性体诱导物，其选自：(a)nlrp3炎性体蛋白质复合物，优选地为明矾晶体，atp，cppd晶体，hermozoin，msu晶体，纳米sio2，尼日利亚菌素(nigericin)，以及(b)aim2炎性体蛋白质复合物，优选地为poly(da:dt)。
60.在一些实施方式中，所述活化部分包含imo2134、imo205、mgn-1703、mgn-1704、agatolimod、sd-101、qax-935、dims0150、pollinex quattro、om-174、eritoran、tak-242、ni-0101、i型干扰素、ii型干扰素、iii型干扰素、il-12、il-23、il-18、il-7或il-15。
61.通过引用的合并
62.说明书中提到的所有公开出版物、专利和专利申请在此通过引用并入本文，如同具体地且单独地说明通过引用将每个单独的公开出版物、专利或专利申请并入本文一样。
附图说明
63.本发明的新特点在所附的权利要求书中具体说明。通过参考后面列举的对示例性的实施方式的详细描述可更好地对本发明的特点和优势加以理解，其中，使用了本发明的原理，并且具有如下附图：
64.图1表示偶联的化合物的特性。如通过facs分析所确定的，将曲妥珠单抗mc-vc-瑞喹莫德和曲妥珠单抗-瑞喹莫德偶联物与表达her2的l细胞的结合与未偶联的曲妥珠单抗(作为参比)、对照人igg和不相关人igg1抗体比较。
65.图2表示曲妥珠单抗、曲妥珠单抗mc-vc-tlrl和曲妥珠单抗mc-tlrl偶联物的体外抗体依赖性细胞毒性(adcc)分析。pbmc(效应细胞)与skbr3细胞(靶细胞)一同加至含有不同浓度的对照人igg1、曲妥珠单抗或曲妥珠单抗mc-vc-tlrl和曲妥珠单抗mc-tlrl偶联物的96孔平板(靶标/效应物比例为1/60)中持续17小时。所有实验一式两份进行。分析基于阴性skbr3测定。用ldh对死细胞进行染。
66.图3a表示富集前后的dc百分数。上部的两个图中的数字表示谱系消减前后总细胞中的dc(hla-dr+lin-)百分数。下部图中的数字表示谱系消减前后总dc中的mdc(cd11c+cd123-)和pdc(cd123+cd11c-)的百分数。图3b至图3d表示纯化的人dc的细胞因子产量分析。纯化的人dc被接种在96孔平板中并且与异基因的未处理的(培养基)或处理的不同浓度的tlrl或曲妥珠单抗mc-vc-tlrl和曲妥珠单抗mc-tlrl在37℃下的孵育箱中直接培养20小时至22小时。在另一实验中，提供浓度逐渐增加的西妥昔单抗mc-vc-tlrl和西妥昔单抗mc-tlrl与人dc一同处理。收集上清液，通过elisa分析人ifn-α，il-6，il-12(p70)和tnf-α。数据表示为一式三份的培养物的平均值
±
sd并且数据代表来自三个健康供体中的两个的独立的实验。
67.图4a至图4c表示pdx胃肿瘤模型中曲妥珠单抗mc-vc-tlrl和曲妥珠单抗mc-tlrl的效果。皮下带有来源于患者的胃肿瘤的6至8周龄的雌性balb/c裸鼠(nu/nu)通过静脉注射10mg/kg曲妥珠单抗mc-vc-tlrl，曲妥珠单抗mc-tlrl或未偶联的曲妥珠单抗或盐水进行(每组12只小鼠)。每周进行持续45天的周期。当肿瘤达到平均尺寸为170mm3时开始。图4a：数据表示平均肿瘤体积(平均值
±
sd)。当肿瘤达到尺寸为2000mm3时肿瘤生长曲线停止。图4b：过程中和后小鼠体重的变化。没有观察到可检测的失重。图4c：组和对照组的存活曲线；接受曲妥珠单抗mc-vc-tlrl或未偶联的曲妥珠单抗的
小鼠的寿命大幅度延长。
68.图5a至图5b表示裸鼠/h1650人肺癌模型中西妥昔单抗mc-vc-tlrl的疗效。皮下带有h1650肺癌细胞的6至8周龄雌性balb/c裸鼠(nu/nu)通过静脉注射10mg/kg西妥昔单抗mc-vc-tlrl或未偶联的西妥昔单抗或盐水进行(每组12只小鼠)。每周进行持续45天的周期。当肿瘤达到平均尺寸为170mm3时开始。数据表示平均肿瘤体积(平均值
±
sd)。当肿瘤达到尺寸为2000mm3时肿瘤生长曲线停止。图5a：人肺癌模型中西妥昔单抗mc-vc-tlrl的疗效。图5b：过程中和后小鼠体重的变化。没有观察到可检测的失重。
具体实施方式
69.本发明的许多方面参考用于举例说明的示例性应用在下面进行描述。应当理解的是，列举出许多具体的细节、关系以及方法来全面理解本发明。然而，本领域普通技术人员可容易地意识到本发明可不按照具体细节中的一种或一种以上来实施或者可以其他方法来实施。本发明不受举例说明的操作顺序或事件的限制，因为，一些操作可以不同的顺序进行和/或可同时与其他操作或事件一同进行。
70.进一步地，不是所有举例说明的操作或事件都需要根据本发明的方法来实施。
71.本文使用的术语是仅仅是为了说明具体实施方式，而无意限定本发明。除非另有明确说明，如本文使用的不指明具体数目的冠词(“a”，“an”和“the”)意在包括复数形式。此外，在具体实施方式部分和/或权利要求中使用的术语“包括(“including”，“include”)、具有(“having”，“has”，“with”)或其变体意在包括与术语“包含(comprising)”类似的方式。
72.术语“约”或“大约”是指由本领域普通技术人员测定的特定值在可接受的误差范围内，该误差范围部分取决于该值如何测量或确定，即，测量系统的限制。例如，“约”可意味着在本领域中每一操作在1个标准偏差范围内或超过一个标准偏差。可选地，“约”可意味着高达给定值的20％的范围，优选地高达给定值的10％的范围，更优选地高达给定值的5％的范围并且更优选地高达给定值的1％的范围。可选地，尤其对于生物系统或过程而言，该术语可意味着在某个值的某个数量级范围内，优选地在某个值的5倍范围内，更优选地在某个值的2倍范围内。在本技术和权利要求书中描述特定值的条件下，除非另有说明，应当假定术语“约”意味着在特定值的可接受的误差范围内。
73.i.定义和缩写
74.除非另有说明，本文使用的所有技术术语和科学术语通常具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。总体而言，本文使用的命名系统和细胞培养、分子遗传学、有机化学和核酸化学以及杂交中的实验操作是本领域熟知的且普遍使用的那些命名系统和实验操作。标准技术用于核酸和肽的合成。所述技术和操作通常根据本领域的常规方法和各种不同的常规参考文献进行，本领域的常规方法和各种不同的常规参考文献在本文中提供。本文使用的命名系统和下面描述的分析化学和有机合成中的实验操作是本领域熟知的且普遍使用的命名系统和实验操作。标准技术或其改良用于化学合成和化学分析。
75.除非另有说明，术语“烷基”其自身或作为另一取代基的一部分是指含有指定数目的碳原子(即，c
1-c
10
是指1至10个碳原子)的直链或支链或环状烃自由基或者其组合，所述直链或支链或环状烃自由基或者其组合可为完全饱和的、单不饱和的或多不饱和的并且可
包括二价和多价自由基。饱和的烃自由基的实例包括但不限于如下基团，例如，甲基、乙基、n-丙基、异丙基、n-丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基、其同系物或异构体，例如，n-戊基、n-己基、n-庚基、n-辛基等等。不饱和烷基为具有一个或一个以上双键或三键的烷基。不饱和烷基的实例包括但不限于：乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)、乙炔基、1-丙炔基和3-丙炔基、3-丁炔基以及高级同系物和异构体。除非另有说明，术语“烷基”还意在包括下面更加详细定义的那些烷基衍生物，例如，“杂烷基”。限定为烃基的烷基基团被称为“均烷基(homoalkyl)”。
76.术语“亚烷基”其自身或作为另一取代基的一部分是指从烷烃衍生得到的二价自由基，例如，但不限于：-ch2ch2ch2ch
2-，并且还包括下面如“杂亚烷基”所描述的那些基团。通常，烷基(或亚烷基)基团可具有1至24个碳原子，本发明中优选地为具有10个或更少的碳原子的那些基团。“低级烷基”或“低级亚烷基”是较短链烷基或亚烷基基团，通常具有8个或更少的碳原子。
77.术语“烷氧基”、“烷基氨基”和“烷硫基”(或硫代烷氧基)以其常规含义使用，并且分别是指通过氧原子、氨基基团或硫原子与分子的剩余部分连接的那些烷基基团。
78.除非另有说明，术语“杂烷基”其自身或与另一术语结合是指由规定数目的碳原子和至少一个选自o、n、si和s的杂原子构成的、稳定的直链或支链或环状烃自由基或者其组合，并且，其中，氮和硫原子可被任选地氧化并且氮杂原子可被任选地季铵化。杂原子o、n和s以及si可位于杂烷基的任何内部位置或者位于烷基与分子的剩余部分连接的位置。实例包括但不限于：-ch
2-ch
2-o-ch3,-ch
2-ch
2-nh-ch3,-ch
2-ch
2-n(ch3)-ch3,-ch
2-s-ch
2-ch3,-ch
2-ch2,-s(o)-ch3,-ch
2-ch
2-s(o)
2-ch3,-ch＝ch-o-ch3,-si(ch3)3,-ch
2-ch＝n-och3,和-ch＝ch-n(ch3)-ch3。最多两个杂原子可以连续，例如，-ch
2-nh-och3和-ch
2-o-si(ch3)3。类似地，术语“杂亚烷基”其自身或作为另一取代基的一部分是指从杂烷基衍生得到的二价自由基，例如但不限于：-ch
2-ch
2-s-ch
2-ch
2-和
–
ch
2-s-ch
2-ch
2-nh-ch
2-。对于杂亚烷基基团而言，杂原子还可占据链端中的一个末端或者链端的两个末端(例如，亚烷基氧、亚烷基二氧、亚烷基氨基、亚烷基二氨基，等等)。而且，对于亚烷基和杂亚烷基的连接基团而言，所写的连接基团的分子式中的方向并不暗示连接基团的方向。例如，分子式-c(o)2r
’‑
代表-c(o)2r
’‑
和-r’c(o)
2-。
79.一般而言，“酰基取代基”也选自上面列举的基团。如本文使用的术语“酰基取代基”是指连接至本发明的化合物的多环核心的基团且该基团满足直接或间接地连接至本发明的化合物的多环核心的羰基碳的化合价。
80.除非另有说明，术语“环烷基”和“杂环烷基”其自身或者与其他术语的组合分别表示“烷基”和“杂烷基”的环状形式。此外，对于杂环烷基而言，杂原子可占据杂环与分子的剩余部分连接的位置。环烷基的实例包括但不限于：环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基，等等。杂环烷基的实例包括但不限于：1-(1,2,5,6-四氢吡啶基)、1-基、2-基、3-基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基，等等。
81.除非另有说明，术语“卤代”或“卤素”其自身或作为另一取代基的一部分是指氟、氯、溴或碘原子。此外，诸如“卤代烷基”之类的术语意在包括单卤代烷基和多卤代烷基。例
c4)烷基,数量为0至芳香族环系统上开放的化合价的总数，并且其中r’,r”,r
”’
和r
””
优选地独立地选自：氢、(c
1-c8)烷基和杂烷基、未取代的芳基和杂芳基，(未取代的芳基)-(c
1-c4)烷基以及(未取代的芳基)氧-(c
1-c4)烷基。例如，当本发明的化合物包含一个以上r基团时，r基团中的每一个独立地选自各r’,r”,r
”’
和r
””
基团(当存在这些基团中的一个以上时)。
87.芳基环或杂芳基环的相邻原子上的芳基取代基中的两个可任选地被通式
–
t-c(o)-(crr’)
q-u-的取代基取代，其中，t和u独立地为-nr-，-o-,-crr
’‑
或单个化学键，并且q为0至3的整数。可选地，芳基环或杂芳基环的相邻原子上的取代基中的两个可任选地被通式
–
a-(ch2)
r-b-的取代基取代，其中，a和b独立地为
–
crr
’‑
,-o-,-nr-,-s-,-s(o)-,-s(o)
2-,-s(o)2nr
’‑
或单个化学键，并且r为1至4的整数。由此形成的新环中的单个化学键中的一个可被双键任选地取代。可选地，芳基环或杂芳基环的相邻原子上的取代基中的两个可任选地被通式
–
(crr’)
s-x-(cr”r
’”
)
d-的取代基取代，其中，s和d独立地为0至3的整数，并且x为-o-，-nr
’‑
,-s-,-s(o)-,-s(o)
2-,或
–
s(o)2nr
’‑
。取代基r,r’,r”和r
”’
优选地独立地选自氢或者取代或未取代的(c
1-c6)烷基。
88.如本文使用的术语“杂原子”包括氧(o)、氮(n)、硫(s)、磷(p)和硅(si)。
89.ii.组合物
90.一方面，本发明提供一种具有通式(i)的结构的化合物：
91.tm-ln-am
ꢀꢀ
(i)，
92.其中，tm为靶向部分，am为能够活化人树突细胞、nk细胞或肿瘤细胞或者它们的组合的活化部分，ln为连接体，n为选自0和1的整数。
93.另一方面，本发明提供一种具有通式(i)的结构的化合物：
94.tm-ln-am
ꢀꢀ
(i)，
95.其中，tm为靶向部分，am为能够特异性结合人tlr7和/或人tlr8的活化部分，ln为连接体，n为选自0和1的整数。
96.又一方面，本发明提供一种具有通式(i)的结构的化合物：
97.tm-ln-am
ꢀꢀ
(i)，
98.其中，tm为靶向部分，am为活化部分，ln为连接体，n为选自0和1的整数，条件是当tm包含抗体时，am不包含cpg寡核苷酸或剂。
99.a.靶向部分
100.总体而言，本发明的化合物包含靶向部分。
101.本文中的“靶向部分(tm)”或“靶向剂”是指特异性地或选择性地与目标分子、细胞、颗粒、组织或聚集体结合的分子、复合物或聚集体，所述目标分子、细胞、颗粒、组织或聚集体通常称为“靶标”或“标记物”并且本文将进一步详细讨论这些目标分子、细胞、颗粒、组织或聚集体。
102.在一些实施方式中，靶向部分包含免疫球蛋白、蛋白质、肽、小分子、纳米颗粒或核酸。
103.诸如抗体(例如，嵌合抗体、人源化抗体和人抗体)、受体的配体、植物凝集素和糖类以及一些酶的底物之类的示例性的靶向剂在本领域中被识别并且不受限制地用于实施本发明。其他靶向剂包括一类如下化合物：该化合物不包括特异性分子识别基序，该化合物
包括将分子量加至活化部分的纳米颗粒、诸如聚(乙二醇)之类的大分子、多糖，以及聚氨基酸。额外的分子量影响活化部分的药代动力学，例如血清半衰期。
104.在一些实施方式中，靶向部分为抗体，抗体片段，双特异性抗体或其他基于抗体的分子或化合物。然而，靶向部分的其他实例为本领域已知的并且可使用靶向部分的其他实例，例如，适体、avimer、受体结合配体、核酸、生物素-亲和素结合对、结合肽或蛋白质，等等。术语“靶向部分”和“结合部分”在本文中同义使用。
105.靶标
106.本文中的“靶标”或“标记物”是指能够特异性结合特定的靶向部分的任何实体。在一些实施方式中，靶标与一个或一个以上特定细胞或组织类型特别相关。在一些实施方式中，靶标与一种或一种以上特定疾病状态特别相关。在一些实施方式中，靶标与一种或一种以上特定发育阶段特别相关。例如，细胞类型特异性标记物在该细胞类型中的表达水平通常比在参比细胞中的表达水平高至少两倍。在一些实施方式中，细胞类型特异性标记物的水平比在参比中的平均表达高至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍或者至少1,000倍。细胞类型特异性标记物的检测或测量可将一种目标细胞类型或多种目标细胞类型与许多其他细胞类型、大多数其他细胞类型或所有其他细胞类型区分开。在一些实施方式中，靶标可包含本文所描述的蛋白质、碳水化合物、脂质和/或核酸。
107.如果一种物质与核酸的靶向部分特异性结合，那么该物质可被认为是为了本文所述的目的而“被靶向的”。在一些实施方式中，核酸靶向部分在严格条件下与靶标特异性结合。如果靶向部分与靶标特异性结合，那么含有靶向部分的本发明的复合物或化合物被认为是“被靶向的”，从而将整个复合物或化合物组合物递送至特定的器官、组织、细胞、细胞外基质成分和/或细胞内腔室。
108.在一些实施方式中，根据本发明的化合物包含靶向部分，所述靶向部分特异性结合与器官、组织、细胞、细胞外基质成分和/或细胞内腔室有关的一个或一个以上靶标(例如，抗原)。在一些实施方式中，化合物包含靶向部分，所述靶向部分特异性结合与特定器官或器官系统有关的靶标。在一些实施方式中，根据本发明的化合物包含核靶向部分，该核靶向部分特异性结合一个或一个以上细胞内靶标(例如，细胞器、细胞内蛋白质)。在一些实施方式中，化合物包含靶向部分，所述靶向部分特异性结合与病态的器官、组织、细胞、细胞外基质成分和/或细胞内腔室有关的靶标。在一些实施方式中，化合物包含靶向部分，所述靶向部分特异性结合与特定细胞类型(例如，内皮细胞、癌细胞、恶性癌细胞、前列腺癌细胞，等等)有关的靶标。
109.在一些实施方式中，根据本发明的化合物包含靶向部分，所述靶向部分与对一种或一种以上特定组织类型(例如，肝脏组织和前列腺组织)具有特异性的靶标结合。在一些实施方式中，根据本发明的化合物包含靶向部分，所述靶向部分与对一种或一种以上特定细胞类型(例如，t细胞和b细胞)具有特异性的靶标结合。在一些实施方式中，根据本发明的化合物包含靶向部分，所述靶向部分与对一种或一种以上特定疾病状态(例如，肿瘤细胞和健康细胞)具有特异性的靶标结合。在一些实施方式中，根据本发明的化合物包含靶向部分，所述靶向部分与对一种或一种以上特定发育阶段(例如，干细胞和分化的细胞)具有特异性的靶标结合。
110.在一些实施方式中，靶标可为标记物，所述标记物仅仅或主要与一种或几种细胞类型、一种或几种疾病和/或一种或几种发育阶段有关。细胞类型特异性标记物在该细胞类型中的表达水平通常比在参比细胞中的表达水平高至少两倍，例如，所述参比细胞可由含有几乎等量的来自多种(例如，5-10种，或者更多)不同的组织或器官的细胞的混合物构成。在一些实施方式中，细胞类型特异性标记物的表达水平比在参比中的平均表达水平高至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍或至少1000倍。细胞类型特异性标记物的检测和测量可将一种目标细胞类型或多种目标细胞类型与许多其他细胞类型、大多数其他细胞类型或所有其他细胞类型区分开。
111.在一些实施方式中，靶标包含蛋白质、碳水化合物、脂质和/或核酸。在一些实施方式中，靶标包含蛋白质和/或其特征部分，例如，肿瘤标记物、整联蛋白、细胞表面受体、跨膜蛋白、细胞间蛋白、离子通道、膜转运蛋白、酶、抗体、嵌合蛋白、糖蛋白，等等。在一些实施方式中，靶标包含碳水化合物和/或其特征部分，例如，糖蛋白，糖(例如，单糖、二糖、多糖)、多糖包被(即，大多数真核细胞的外表面上富集碳水化合物的外周区域)，等等。在一些实施方式中，靶标包含脂质和/或其特征部分，例如，油、脂肪酸、甘油酯、激素、类固醇(例如，胆固醇、胆汁酸)、维生素(例如，维生素e)、磷脂、神经鞘脂、脂蛋白，等等。在一些实施方式中，靶标包含核酸和/或其特征部分，例如，dna核酸、rna核酸、修饰的dna核酸、修饰的rna核酸、包括dna、rna、修饰的dna和修饰的rna的任何组合在内的核酸。
112.本领域已知多种标记物。典型的标记物包括细胞表面蛋白质，例如，受体。示例性的受体包括但不限于：转铁蛋白受体、ldl受体、生长因子受体(例如，表皮生长因子受体家族成员(例如，egfr、her2、her3、her4))或血管内皮生长因子受体、细胞因子受体、细胞粘附分子、整联蛋白、选择素和cd分子。所述标记物可为仅仅存在于或大量存在于恶性肿瘤细胞上的分子，例如，肿瘤抗原。
113.肿瘤抗原
114.在一些实施方式中，靶向部分能够特异性结合肿瘤细胞或相对于非肿瘤细胞优先结合肿瘤细胞。
115.靶向部分与肿瘤细胞的结合可使用本领域已知的检测方法来测量。
116.在一些实施方式中，肿瘤细胞为癌细胞、肉瘤细胞、淋巴瘤细胞、骨髓瘤细胞或中枢神经系统癌症细胞。
117.在一些实施方式中，靶向部分能够特异性结合肿瘤抗原或者相对于非肿瘤抗原优先结合肿瘤抗原。
118.本文中的“特异性结合”或“优先结合”是指在两个结合搭档之间(例如，在靶向部分及其结合搭档之间)的结合对两个结合搭档具有选择性并且可从不想要的或非特异性相互作用中区分出来。例如，抗原结合部分结合特异性抗原决定簇的能力可通过酶联免疫吸附分析法(elisa)或其他本领域技术人员熟悉的技术(例如，表面等离子共振技术(在biacore仪器上分析)(liljeblad等人,glyco j 17,323-329(2000))和传统的结合分析(heeley,endocr res 28,217-229(2002)))测量。术语“抗-[抗原]抗体”和“与[抗原]结合的抗体”是指能够通过足够的亲合力结合各自的抗原的抗体，这样，所述抗体用作靶向抗原的诊断剂和/或剂。在一些实施方式中，抗-[抗原]抗体结合不相关的蛋白质的程度小
于所测量(例如，通过放射性免疫分析(ria))的抗体抗原结合程度的约10％。在一些实施方式中，结合[抗原]的抗体的解离常数(kd)小于1μm、小于100nm、小于10nm、小于1nm、小于0.1nm、小于0.01nm或小于0.001nm(例如，10-8
m或更小，例如，10-8
m至10-13
m，例如，10-9
m至10-13
m)。应当理解的是，上述定义还可应用于与抗原结合的抗原结合部分。
[0119]
在一些特定的实施方式中，靶标为肿瘤标记物。在一些实施方式中，肿瘤标记物为存在于肿瘤中的抗原，所述抗原不存在于正常器官、组织和/或细胞中。在一些实施方式中，肿瘤标记物为抗原，所述抗原在肿瘤中比在正常器官、组织和/或细胞中更加普遍。在一些实施方式中，肿瘤标记物为抗原，所述抗原在恶性癌症细胞中比在正常细胞中更加普遍。
[0120]
本文中的“肿瘤抗原”是指肿瘤细胞中产生的抗原性物质，即，该物质触发宿主体内的免疫反应。体内的正常蛋白质由于自体耐受而不是抗原性的，所述自体耐受为如下过程：在该过程中，自身反应性的细胞毒性t淋巴细胞(ctl)和产生自身抗体的b淋巴细胞在初级淋巴组织(bm)中被“中心性地”剔除并在次级淋巴组织(产生t细胞的大多数胸腺和产生b细胞的脾/淋巴结)中被“外周性地”剔除。因此，未暴露于免疫系统的任何蛋白质触发免疫反应。这可包括与免疫系统完全隔绝的正常蛋白质、以极少的量正常生成的蛋白质、仅仅在某些发育阶段正常生成的蛋白质或者结构由于突变而发生改变的蛋白质。
[0121]
在一些实施方式中，相对于在正常组织和/或细胞中的表达，靶标优先在肿瘤组织和/或细胞中表达。
[0122]
在本发明的一些实施方式中，标记物为肿瘤标记物。所述标记物可为多肽，所述多肽在分裂的细胞中的表达水平比在未分裂的细胞中的表达水平高。例如，her-2/neu(也称为erbb-2)为egf受体家族成员并在与乳腺癌相关的肿瘤细胞表面表达。另一实例为称为f3的肽，该肽为用于将纳米颗粒引向核仁蛋白的合适的靶向剂(porkka et al.,2002,proc.natl.acad.sci.,usa,99:7444；and christian等人,2003,j.cell biol.,163:871)。包含纳米颗粒和a10适体(与psma特异性结合)的靶向颗粒表现出能够特异性且有效地将多西他赛递送至前列腺癌肿瘤。
[0123]
特异性靶向这些肿瘤靶标的抗体或其他药物特异性地干扰并调节肿瘤细胞生物行为的信号通路，直接调节或阻断信号通路，从而抑制肿瘤细胞生长或诱导细胞凋亡。迄今为止，已批准了几十种靶向药物用于实体瘤或血液系统恶性肿瘤的临床研究和，并且已有多种用于血液系统恶性肿瘤的靶向药物。
[0124]
在一些实施方式中，肿瘤抗原(或肿瘤靶标)选自：cd2,cd19,cd20,cd22,cd27,cd33,cd37,cd38,cd40,cd44,cd47,cd52,cd56,cd70,cd79和cd137。
[0125]
在一些实施方式中，肿瘤抗原(或肿瘤靶标)选自：4-1bb,5t4，ags-5,ags-16,血管生成素2,b7.1,b7.2,b7dc,b7h1,b7h2,b7h3,bt-062,btla,caix,癌胚抗原,ctla4,cripto,ed-b,erbb1,erbb2,erbb3,erbb4,egfl7,epcam,epha2,epha3,ephb2,fap,纤连蛋白,叶酸盐受体,神经节苷酯gm3,gd2,糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(gitr),gp100,gpa33,gpnmb,icos,igf1r,整联蛋白αν,整联蛋白ανβ,kir,lag-3,lewis y抗原,间皮素,c-met,mn碳酸酐酶ix,muc1,muc16,粘连蛋白-4,nkgd2,notch,ox40,ox40l,pd-1,pdl1,psca,psma,rankl,ror1,ror2,slc44a4,多配体蛋白聚糖-1,taci,tag-72,腱生蛋白,tim3,trailr1,trailr2,vegfr-1,vegfr-2,vegfr-3和它们的变体。肿瘤抗原的变体包括本领域已知的和/或天然生成的各种不同的突变体或多形态。
[0126]
抗体
[0127]
在一些实施方式中，靶向部分包含抗体或其功能片段。
[0128]
本文使用的“免疫球蛋白”或“抗体”是指全长(即，天然生成的或通过正常免疫球蛋白基因片段重组过程形成的)免疫球蛋白分子(例如，igg抗体)或免疫球蛋白分子的免疫活性(即，特异性结合)部分，例如抗体片段。在本发明要求保护的范围内，抗体或抗体片段可被偶联或衍生。这些抗体包括iggl,lgg2a,igg3,igg4(以及igg4亚型)和iga同种型。
[0129]
本文的术语“抗体”以其广义使用并包含各种不同的抗体结构，包括但不限于：单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的抗原结合活性并且包含免疫球蛋白的fc区域或等同于该fc区域的区域。本文中可互换使用的术语“全长抗体”、“完整抗体”和“整个抗体”是指具有与天然抗体结构基本类似的结构的抗体或者具有含本文定义的fc区域的重链的抗体。
[0130]
本文的“天然抗体”是指具有不同结构的天然生成的免疫球蛋白分子。例如，天然igg抗体为约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白，其由被二硫键连接的两个相同的轻链和两个相同的重链构成。从n端至c端，每一重链具有可变区(vh)，也称为可变重链结构域或重链可变结构域，重链之后为三个恒定结构域(ch1、ch2和ch3)，也称为重链恒定区。类似地，从n端至c端，每一轻链具有可变区(vl)，也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域，轻链之后为恒定轻链结构域(cl)，也称为轻链恒定区。基于抗体恒定结构域的氨基酸序列，抗体的轻链可指定为两种类型(称为κ和λ)中的一种。
[0131]
本文中的“抗体片段”是指不同于完整抗体的分子，所述分子包含结合抗原的完整抗体的一部分，所述抗原与完整抗体结合。抗体片段的实例包括但不限于：fv,fab,fab',fab'-sh,f(ab')2,双体抗体,线性抗体,单链抗体分子(例如，scfv),单结构域抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。关于一些抗体片段的综述请参见，hudson等人,nat med 9,129-134(2003)。关于scfv片段的综述请参见例如，pliickthun,in the pharmacology of monoclonal antibodies,vol.113,rosenburg和moore编辑,springer-verlag,new york,pp.269-315(1994)；以及wo 93/16185；和美国专利第5,571,894号和第5,587,458号。关于含有挽救受体结合表位残基且具有提高的体内半衰期的fab和f(ab’)2片段的讨论，请参见美国专利第5,869,046号。双体抗体为可为二价的或双特异性的具有两个抗原结合位点的抗体片段。请参见例如，ep 404,097；wo 1993/01161；hudson等人,nat med 9,129-134(2003)；和hollinger等人,proc natl acad sci usa 90,6444-6448(1993)。三体抗体和四体抗体也在hudson等人,nat med 9,129-134(2003)中描述。单结构域抗体为含有抗体的所有或一部分重链可变结构域或者含有抗体的所有或一部分轻链可变结构域的抗体片段。在一些实施方式中，单结构域抗体为人单结构域抗体(domantis,inc.,waltham,ma；参见例如，美国专利no.6,248,516bl)。抗体片段可通过各种不同的技术制备，所述技术包括但不限于：如本文描述的，完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如，大肠杆菌或噬菌体)生成。
[0132]
本文中的“抗原结合结构域”是指包含与抗原的全部或一部分特异性结合且互补的区域的抗体的一部分。抗原结合结构域可通过例如，一个或一个以上抗体可变结构域(也称为抗体可变区)来提供。具体而言，抗原结合结构域包含抗体轻链可变区(vl)和抗体重链可变区(vh)。
[0133]
本文中的“可变区”或“可变结构域”是指涉及使抗体与抗原结合的抗体重链结构域或轻链结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为vh和vl)通常具有类似的结构，其中，每一结构域包含四个保守的框架区(fr)和三个高变区(hvr)。参见例如，kindt等人,kuby immunology,第六版,w.h.freeman and co.,第91页(2007)。单个vh或vl结构域可足以带来抗原结合特异性。
[0134]
本文中的“高变区”或“hvr”是指序列高度可变和/或形成结构限定的环(“高变环”)的抗体可变结构域的各个区域。一般而言，天然四链抗体包含六个hvr，三个在vh(h1、h2、h3)中，三个在vl(l1、l2、l3)中。hvr通常包含来自高变环的氨基酸残基和/或来自互补决定区(cdr)的氨基酸残基，后者具有最高的序列可变性和/或涉及抗原识别。除了vh中的cdr1，cdr通常包含形成高变环的氨基酸残基。高变区(hvr)也被称为“互补决定区(cdr)”并且与形成抗原结合区的可变区部分有关的这些术语在本文中互换使用。该特定区域已由kabat等人,u.s.dept.of health and human services,sequences of proteins of immunological interest(1983)和chothia等人,jmol biol 196:901-917(1987)描述，其中，当彼此比较时，定义包括氨基酸残基的重叠或子集。然而，关于抗体的cdr或其变体的任何定义的应用意在本文定义的和本文使用的术语的范围内。包含特定cdr的确切的残基数目随cdr的序列和尺寸的不同而不同。在给出抗体的可变区氨基酸序列的条件下，本领域技术人员可常规确定哪些残基包含特定cdr。
[0135]
本发明的抗体可为嵌合抗体、人源化抗体、人抗体或抗体融合蛋白。
[0136]
本文中的“嵌合抗体”是指包含抗体重链和轻链这两者的可变结构域的重组蛋白质，所述可变结构域包括来源于一个物种的抗体(优选地为啮齿动物抗体，更优选地为鼠科动物抗体)的互补决定区(cdr)，而抗体分子的恒定结构域来源于人抗体的恒定结构域。对于兽医应用而言，嵌合抗体的恒定结构域可来源于其它物种的恒定结构域，所述其它物种例如，类人类灵长类动物、猫或狗。
[0137]
本文中的“人源化抗体”是指如下重组蛋白：在该重组蛋白中，来自于一个物种的抗体(例如，啮齿动物抗体)的cdr从啮齿动物抗体的可变重链和可变轻链转移至人重链可变结构域和人轻链可变结构域中。抗体分子的恒定结构域来源于人抗体的恒定结构域。在一些实施方式中，人源化抗体的框架区的特定残基，尤其是接触或靠近cdr序列的那些特定残基，可被修饰，例如可被来自于原始啮齿动物、类人类灵长类动物的相应残基或其他抗体代替。
[0138]
本文中的“人抗体”是指例如从转基因小鼠中获得的抗体，所述转基因小鼠已被“改造”为响应抗原刺激生成特定的人抗体。在该技术中，人重链基因座和人轻链基因座的元件被引入来源于胚胎干细胞系的小鼠品系中，所述胚胎干细胞系包含内源性重链基因座和轻链基因座的靶向断裂。转基因小鼠可合成对人抗原具有特异性的人抗体，并且小鼠可用于生成分泌人抗体的杂交瘤。从转基因小鼠中获得人抗体的方法由green等人,nature genet.7:13(1994)，lonberg等人,nature 368:856(1994)，taylor等人,int.immun.6:579(1994)描述。完全人抗体还可通过基因转染法或染体转染法以及噬菌体展示技术来构建，所有这些方法为本领域已知的。请参见例如，mccafferty等人,nature 348:552-553(1990)，其中描述了通过来自于未免疫的供体的免疫球蛋白可变结构域基因谱系体外生成人抗体及其片段。在该技术中，抗体可变结构域基因框内克隆至丝状噬菌体的主要或次要
外壳蛋白基因中，并且在噬菌体颗粒的表面上展示为功能抗体片段。因为丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链dna拷贝，基于抗体的功能性质的选择还导致对编码表现出那些性质的抗体的基因的选择。通过该方式，噬菌体模仿b细胞的一些性质。噬菌体展示可以多种形式进行，关于噬菌体展示的综述请参见例如，johnson和chiswell,current opinion in structural biology 3:5564-571(1993)。人抗体还可通过体外活化b细胞产生。请参见美国专利第5,567,610号和第5,229,275号，该美国专利的全部内容通过引用并入本文。
[0139]
本文中的“抗体融合蛋白”是指通过重组产生的抗原结合分子，其中，连接相同或不同的天然抗体、具有相同或不同特异性的单链抗体或抗体片段中的两个或两个以上。融合蛋白包含至少一个特异性结合位点。融合蛋白的化合价表示融合蛋白具有的与抗原或表位结合的结合臂或结合位点的总数，即，单价的、二价的、三价的或多价的。多价的抗体融合蛋白是指该抗体融合蛋白可利用多种与抗原结合的相互作用，因此增加与抗原或不同抗原结合的亲合力。特异性表示抗体融合蛋白能够与多少种不同类型的抗原或表位结合，即，单特异性、双特异性、三特异性、多特异性。使用这些定义，天然抗体(例如，igg)为二价的，因为其具有两个结合臂，但是其为单特异性的，因为其结合一种类型的抗原或表位。单特异性多价融合蛋白具有一个以上用于相同抗原或表位的结合位点。例如，单特异性双体抗体为具有两个与相同的抗原反应的结合位点的融合蛋白。融合蛋白可包含不同抗体成分的多价或多特异性组合或同一抗体成分的多个拷贝。融合蛋白还可包含剂。
[0140]
在一些实施方式中，靶向部分为抗体或抗体片段，该靶向部分基于其对抗原的特异性进行选择，所述抗原在目标靶细胞或靶点上表达。已识别出多种不同的肿瘤特异性抗原或其他疾病特异性抗原，并且那些抗原的抗体已用于或计划用于这些肿瘤或其他疾病。本领域已知的抗体可用于本发明的化合物，尤其用于与靶抗原有关的疾病。可被本发明的抗体-连接体-药物偶联物靶定的目标抗原(及其相关疾病)的实例包括：cd2,cd19,cd20,cd22,cd27,cd33,cd37,cd38,cd40,cd44,cd47,cd52,cd56,cd70,cd79，cd137，4-1bb,5t4，ags-5,ags-16,血管生成素2,b7.1,b7.2,b7dc,b7h1,b7h2,b7h3,bt-062,btla,caix,癌胚抗原,ctla4,cripto,ed-b,erbb1,erbb2,erbb3,erbb4,egfl7,epcam,epha2,epha3,ephb2,fap,纤连蛋白,叶酸盐受体,神经节苷酯gm3,gd2,糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(gitr),gp100,gpa33,gpnmb,icos,igf1r,整联蛋白αν,整联蛋白ανβ,kir,lag-3,lewis y,间皮素,c-met,mn碳酸酐酶ix,muc1,muc16,粘连蛋白-4,nkgd2,notch,ox40,ox40l,pd-1,pdl1,psca,psma,rankl,ror1,ror2,slc44a4,多配体蛋白聚糖-1,taci,tag-72,腱生蛋白,tim3,trailr1,trailr2,vegfr-1,vegfr-2,vegfr-3。
[0141]
在一些实施方式中，抗体选自：美罗华(利妥昔单抗)、赫赛汀(曲妥珠单抗)、爱必妥(西妥昔单抗)、维克替比(帕尼单抗)、arzerra(ofatumumab)、benlysta(贝利木单抗)、yervoy(伊匹单抗)、perjeta(帕妥珠单抗)、tremelimumab、nivolumab、dacetuzumab、urelumab、mpdl3280a、lambrolizumab和blinatumomab。
[0142]
美罗华(利妥昔单抗)为用于b细胞非霍奇金淋巴瘤的嵌合抗体。其作用于表达cd20抗原的b细胞表面，cd20抗原在90％的b细胞非霍奇金淋巴瘤上表达。美罗华与cd20结合，从而诱导b细胞通过cdc和adcc溶解并且敏化对一些细胞毒性化疗具有耐药性的人淋巴细胞。
[0143]
赫赛汀(曲妥珠单抗)为作用于her2人表皮生长因子受体细胞外结构域的人源化
单克隆抗体，her2在25％至30％的乳腺癌中表达。曲妥珠单抗被认为具有通过以下三方面的抗肿瘤作用：(1)下调her2受体，抑制her2细胞内信号转导通路以及诱导细胞凋亡；(2)使抗体依赖性adcc和cdc与杀伤肿瘤细胞相关联的免疫机制；(3)提高化疗效果。
[0144]
爱必妥(西妥昔单抗)为作用于表皮生长因子受体(egfr)的嵌合抗体。爱必妥结合egfr，从而抑制egfr的信号转导通路，影响细胞增殖、浸润和转移，以及血管生成。对egfr信号转导通路的抑制可提高化疗药物的疗效和放疗的疗效。
[0145]
阿瓦斯汀(贝伐单抗)为靶定血管内皮生长因子(vegf)的人源化单克隆抗体。阿瓦斯汀与vegfr的结合抑制vegf和信号转导，从而抑制了肿瘤血管生成。
[0146]
目前正在研发的其他抗体也可用作靶向部分。例如，正在研发用于肿瘤的针对下列靶标的性单克隆抗体：cd2,cd19,cd20,cd22,cd27,cd33,cd37,cd38,cd40,cd44,cd47,cd52,cd56,cd70,cd79，cd137。并且也正在研发用于肿瘤的针对下列靶标的性单克隆抗体：4-1bb,5t4，ags-5,ags-16,血管生成素2,b7.1,b7.2,b7dc,b7h1,b7h2,b7h3,bt-062,btla,caix,癌胚抗原,ctla4,cripto,ed-b,erbb1,erbb2,erbb3,erbb4,egfl7,epcam,epha2,epha3,ephb2,fap,纤连蛋白,叶酸盐受体,神经节苷酯gm3,gd2,糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(gitr),gp100,gpa33,gpnmb,icos,igf1r,整联蛋白αν,整联蛋白ανβ,kir,lag-3,lewis,间皮素,c-met,mn碳酸酐酶ix,muc1,muc16,粘连蛋白-4,nkgd2,notch,ox40,ox40l,pd-1,pdl1,psca,psma,rankl,ror1,ror2,slc44a4,多配体蛋白聚糖-1,taci,tag-72,腱生蛋白,tim3,trailr1,trailr2,vegfr-1,vegfr-2,vegfr-3，以及它们的变体。(scott am,wolchok jd,old lj.antibody therapy of cancer.nat rev cancer.2012mar 22；12(4):278-87)。
[0147]
在一些实施方式中，靶向部分包含fab，fab’，f(ab’)2，单结构域抗体，t和abs二聚物，fv，scfv，dsfv，ds-scfv，fd，线性抗体，微小抗体、双体抗体、双特异性抗体片段、bibody、tribody、sc-双体抗体、κ(λ)body，bite，dvd-ig，sip，smip，dart，或者含有一个或一个以上cdr的抗体类似物。
[0148]
下表显示正在研究的各种不同的抗体结构和靶标：
[0149]
表1
[0150]
[0151][0152]
在一些实施方式中，靶向部分包含vegfr的atwlppr多肽、血小板反应蛋白-1模拟物、cdcrgdcfcg(环状)多肽、sch 221153片段、ncngrc(环状)多肽、ctthwgftlc多肽、cgnkrtrgc多肽(lyp-1)、奥曲肽、伐普肽、兰乐肽、c-3940多肽、达必佳、利普安、诺雷德或西曲瑞克。
[0153]
叶酸
[0154]
在一些实施方式中，靶向部分包含叶酸或其衍生物。
[0155]
近年来，关于叶酸的研究取得了很大进步。叶酸为一种细胞分裂必需的小分子维生素。肿瘤细胞分裂异常，叶酸盐受体(fr)在肿瘤细胞表面高表达以捕获足以支持细胞分裂的叶酸。
[0156]
数据显示fr在肿瘤细胞中的表达比在正常细胞中的表达高20倍至200倍。fr在各种不同的恶性肿瘤中的表达率为：在卵巢癌中为82％，在非小细胞肺癌中为66％，在肾癌中为64％，在结肠癌中为34％，在乳腺癌中为29％(xia w，low ps.late-targeted therapies for cancer.j med chem.2010；14；53(19):6811-24)。fa的表达率和上皮肿瘤浸润和转移的恶性程度正相关。fa通过fr介导的内吞作用进入细胞，并且fa通过其羧基基团与进入细胞的药物形成fa复合物。在酸性(ph值为5)条件下，fr从fa中分离出来，并且fa将药物释放进入细胞质。
[0157]
临床上，此系统可用于递送选择性攻击肿瘤细胞的药物。叶酸具有小分子量，不具有免疫原性且具有高稳定性，并且叶酸的合成并不昂贵。更重要的是，药物和载体之间的化学偶联简单，因此，使用fa作为靶向分子构建药物递送系统用于癌症已成为研究热点。目前，临床实验中的ec145(fa化疗药物偶联化合物)可有效攻击癌细胞(pribble p和edelman mj.ec145:a novel targeted agent for adenocarcinoma of the lung.expert opin.investig.drugs(2012)21:755-761)。
[0158]
其他靶向部分
[0159]
在一些实施方式中，靶向部分包含细胞外结构域(ecd)或pd-1,ctla4,cd47,btla,kir,tim3,4-1bb和lag3的可溶形式，全长的部分表面配体双调蛋白，β动物纤维素，egf，肝配蛋白，epigen，上皮调节蛋白，igf，神经调节蛋白，tgf，trail或vegf。
[0160]
纳米颗粒
[0161]
在一些实施方式中，靶向部分包含颗粒(靶向颗粒)，优选地为纳米颗粒，任选地，为连接至靶向分子的靶向纳米颗粒，所述靶向分子可特异性结合或优先结合靶标。在一些实施方式中，靶向颗粒其自身引导本发明的化合物(例如，通过在肿瘤细胞或肿瘤组织中的富集)，而无需与其连接额外的靶向分子。
[0162]
本文中的“纳米颗粒”是指直径小于1000nm的任何颗粒。在一些实施方式中，剂和/或靶向分子可与聚合物基体结合。在一些实施方式中，靶向分子可与聚合物基体的表面共价结合。在一些实施方式中，共价结合由连接体介导。在一些实施方式中，剂可与聚合物基体表面结合，封装在聚合物基体内，被聚合物基体包围，和/或分散于整个聚合物基体。美国专利第8,246,968号，该美国专利的全部内容在此通过引用并入本文。
[0163]
总体而言，本发明的纳米颗粒包含任何类型的颗粒。根据本发明可使用任何颗粒。在一些实施方式中，颗粒为可生物降解的且生物相容的。总体而言，生物相容性物质对细胞无毒。在一些实施方式中，如果将某种物质加至细胞中产生小于细胞死亡的某一阈值的结果，那么认为该物质为生物相容的。在一些实施方式中，如果将某种物质加至细胞中不诱导副作用，那么认为该物质为生物相容的。总体而言，可生物降解的物质为经过相关时间段(例如，数周、数月或者数年)在生理学条件下发生分解的物质。在一些实施方式中，可生物降解的物质为可通过细胞机制进行分解的物质。在一些实施方式中，可生物降解的物质为可通过化学过程分解的物质。在一些实施方式中，颗粒为生物相容且可生物降解的物质。在一些实施方式中，颗粒为生物相容物质，但不为可生物降解的物质。在一些实施方式中，颗粒为可生物降解的物质，但不为生物相容物质。
[0164]
在一些实施方式中，颗粒的粒度大于肾排泄极限(例如，直径大于6nm的颗粒)。在一些实施方式中，颗粒尺寸为足以避免通过肝脏从血流中清除的大小(例如，直径小于1000nm的颗粒)。总体而言，颗粒的生理化学特性应当允许靶向颗粒通过降低肾排泄和肝脏清除在血浆中长期循环。
[0165]
通常，理想的是使用尺寸、形状和/或组成相对均匀的颗粒，这样，每一颗粒具有类似的性质。例如，至少80％的颗粒，至少90％的颗粒或至少95％的颗粒的直径或最大尺寸为平均直径或最大尺寸加减5％，10％或20％。在一些实施方式中，颗粒的尺寸、形状和/或组成可为不均一的。
[0166]
ζ电位为颗粒表面电势的测量值。在一些实施方式中，颗粒的ζ电位为-50mv至+50mv。在一些实施方式中，颗粒的ζ电位为-25mv至+25mv。在一些实施方式中，颗粒的ζ电位为-10mv至+10mv。在一些实施方式中，颗粒的ζ电位为-5mv至+5mv。在一些实施方式中，颗粒的ζ电位为0mv至+50mv。在一些实施方式中，颗粒的ζ电位为0mv至+25mv。在一些实施方式中，颗粒的ζ电位为0mv至+10mv。在一些实施方式中，颗粒的ζ电位为0mv至+5mv。在一些实施方式中，颗粒的ζ电位为-50mv至0mv。在一些实施方式中，颗粒的ζ电位为-25mv至0mv。在一些实施方式中，颗粒的ζ电位为-10mv至0mv。在一些实施方式中，颗粒的ζ电位为-5mv至0mv。在一些实施方式中，颗粒的ζ电位基本为中性(即，约0mv)。
[0167]
根据本发明可使用多种不同的颗粒。在一些实施方式中，颗粒为球形或类球形。在一些实施方式中，颗粒为球形或类球形。在一些实施方式中，颗粒为扁平的或板状的。在一些实施方式中，颗粒为立方体或类立方体。在一些实施方式中，颗粒为卵形或椭圆形。在一些实施方式中，颗粒为圆柱形、圆锥形或金字塔形。
[0168]
在一些实施方式中，颗粒为微颗粒(例如，微球)。总体而言，“微颗粒”是指直径小于1000μm的任何颗粒。在一些实施方式中，颗粒为微微型颗粒(picoparticle)(例如，微微球体)。总体而言，“微微型颗粒”是指直径小于1nm的任何颗粒。在一些实施方式中，颗粒为脂质体。在一些实施方式中，颗粒为胶束。
[0169]
颗粒可为实心的或中空的并且可包含一个或一个以上层(例如，纳米壳，纳米环)。在一些实施方式中，每层相对于其他各层具有独特的组成和独特的性质。例如，颗粒可具有核/壳结构，其中，核为一层，壳为另一层。颗粒可包含多个不同的层。在一些实施方式中，一层可为充分交联的，另一层不充分交联，等等。在一些实施方式中，不同层中的一层，几层或所有层可包含一种或一种以上待递送的剂或诊断剂。在一些实施方式中，一层包含待
raton,1992；mathiowitz等人,1987,j.control.release,5:13；mathiowitz等人,1987,reactive polymers,δ:275；以及mathiowitz等人,1988,j.appl.polymer sci.,35:755)。
[0176]
核酸靶向部分
[0177]
在一些实施方式中，靶向部分包含核酸靶向部分。
[0178]
总体而言，核酸靶向部分为结合与器官、组织、细胞、细胞外基质成分和/或细胞内腔室有关的成分(靶标)的任何多核苷酸。
[0179]
在一些实施方式中，核酸靶向部分为适体。
[0180]
适体通常为与特定目标结构结合的多核苷酸，所述特定目标结构与特定器官、组织、细胞、细胞外基质成分和/或细胞内腔室有关。总体而言，适体的靶向功能基于适体的三维结构。在一些实施方式中，适体与靶标的结合通常由适体和靶标这两者的二维和/或三维结构之间的相互作用介导。在一些实施方式中，适体与靶标的结合不仅仅基于适体的基本序列，还取决于适体和/或靶标的三维结构。在一些实施方式中，适体通过watson-crick互补碱基配对与其靶标结合，所述watson-crick碱基配对被破坏碱基配对的结构(例如，发夹环)阻碍。
[0181]
在一些实施方式中，核酸靶向部分为spiegelmers(pct公布wo 98/08856,wo 02/100442和wo 06/117217)。总体而言，spiegelmers为合成的镜像核酸，其可特异性结合靶标(即，镜像适体)。spiegelmers通过如下结构特征表征：所述结构特征使得它们不易受外切-核酸酶和内切-核酸酶的影响。
[0182]
本领域普通技术人员会意识到的是，根据本发明可使用任何能够特异性结合靶标的核酸靶向部分(例如，适体或spiegelmers)。在一些实施方式中，根据本发明待使用的核酸靶向部分可靶定与疾病、失调和/或病症有关的标记物。在一些实施方式中，根据本发明待使用的核酸靶向部分可靶定癌相关靶标。在一些实施方式中，根据本发明待使用的核酸靶向部分可靶定肿瘤标记物。使用根据本发明的核酸靶向部分可靶定任何类型的癌症标记物和/或任何肿瘤标记物。举例而言，核酸靶向部分可靶定与前列腺癌、肺癌、乳腺癌、直肠结肠癌、膀胱癌、胰腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、骨癌、食管癌、肝癌、胃癌、脑肿瘤、皮肤黑素瘤和/或白血病有关的标记物。
[0183]
本发明的核酸(包括核酸靶向部分和/或待递送的功能性rna，例如，rnai-诱导实体，核酶，trna，等等，下面进一步详细描述)可根据任何可获得的技术制备，包括但不限于：化学合成、酶合成、较长的前体的酶裂解或化学裂解，等等。合成rna的方法为本领域已知的(参见例如，gait,m.j.(编辑)oligonucleotide synthesis:a practical approach,oxford[oxfordshire],washington,d.c.:irl press,1984；和herdewijn,p.(编辑)oligonucleotide synthesis:methods and applications,methods in molecular biology,v.288(clifton,n.j.)totowa,n.j.:humana press,2005)。
[0184]
形成核酸靶向部分的核酸可包含天然生成的核苷，修饰的核苷，具有在一个或一个以上核苷之间插入的烃连接体(例如，亚烷基)或聚醚连接体(例如，peg连接体)的天然生成的核苷，具有在一个或一个以上核苷之间插入的烃连接体或peg连接体的修饰的核苷，或它们的组合。在一些实施方式中，核酸靶向部分的核苷酸或修饰的核苷酸可被烃连接体或聚醚连接体取代，只要核酸靶向部分的结合亲合力和选择性基本不会由于取代(例如，核酸靶向部分对靶标的解离常数不应大于约1
×
10-3
m)而降低。
[0185]
本领域普通技术人员已知，根据本发明的核酸可包含天然生成的核酸中发现的全部类型的核苷酸或者可包括一种或一种以上核苷酸类似物或具有与天然生成的核酸的结构不同的结构。美国专利第6,403,779号、第6,399,754号、第6,225,460号、第6,127,533号、第6,031,086号、第6,005,087号、第5,977,089号，这些美国专利中的参考文献公开了多种不同的具体核苷类似物和可使用的修饰。参见crooke,s.(编辑)antisense drug technology:principles,strategies,and applications(第一版),marcel dekker；isbn:0824705661；第一版(2001)以及其中的参考文献。例如，2
’‑
修饰包括卤代、烷氧基和烯丙氧基。在一些实施方式中，2
’‑
oh基团被选自下列的基团取代：h，or，r，卤素，sh，sr，nh2，nhr，nr2或cn，其中，r为c1-c6烷基，烯基，或炔基，并且卤素为f，cl，br或i。修饰的连接键的实例包括硫代磷酸酯和5
’‑
n-亚磷酰胺连接键。
[0186]
根据本发明可使用包含多种不同的核苷酸类似物、修饰的骨架或非天然生成的核苷间连接键的核酸。本发明的核酸可包括天然核苷(即，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷)或修饰的核苷。修饰的核苷酸的实例包括碱基修饰的核苷(例如，阿糖胞苷(aracytidine)、肌核苷、异鸟苷、水粉荤素(nebularine)、假尿苷、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、2-硫代胸苷、3-脱氮-5-氮杂胞苷、2
’‑
脱氧尿苷、3-硝基吡咯、4-甲基吲哚、4-硫代尿苷、4-硫代胸苷、2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、2-硫代尿苷、5-溴代胞苷、5-碘代尿苷、肌核苷、6-氮尿苷、6-氯代嘌呤、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氮杂腺苷、8-叠氮腺苷、苯并咪唑、m1-甲基腺苷、吡咯并嘧啶、2-氨基-6-氯代嘌呤、3-甲基腺苷、5-丙炔基胞苷、5-丙炔基尿苷、5-溴代尿苷、5-氟代尿苷、5-甲基胞苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧腺苷、8-氧鸟苷、o(6)-甲基鸟嘌呤和2-硫代胞苷)，化学或生物修饰的碱基(例如，甲基化的碱基)，修饰的糖类(例如，2
’‑
氟代核糖、2
’‑
氨基核糖、2
’‑
叠氮核糖、2
’‑
o-甲基核糖、l-对映异构体核苷阿糖和己糖)，修饰的磷酸酯基团(例如，硫代磷酸酯和5
’‑
n-亚磷酰胺连接键)以及它们的组合。用于核酸的化学合成的天然核苷酸单体和修饰的核苷酸单体易于获得。在一些情况下，含有这些修饰的核酸相对于仅由天然生成的核苷酸构成的核酸表现出改善的性质。在一些实施方式中，本文所述的核酸修饰被用于降低和/或防止核酸酶(例如，核酸外切酶，核酸内切酶，等等)消化。例如，核酸的结构可通过在一条链或两条链的3’端包括核苷酸类似物以降低消化来稳定。
[0187]
修饰的核酸不需要沿着分子的全长进行一致性修饰。不同的核苷酸修饰和/或骨架结构可存在于核酸的各个不同位置。本领域普通技术人员可理解的是，核苷酸类似物或其他修饰可位于使核酸的功能基本不受影响的核酸的任何位置。举例而言，修饰可位于使核酸靶向部分特异性结合靶标的能力基本不受影响的核酸靶向部分的任何位置。修饰的区域可位于一条链或两条链的5’端和/或3’端。例如，已使用如下修饰的核酸靶向部分：位于该修饰的核酸靶向部分中的两条链中的任一条链的5’端和/或3’端处的大约1至5个残基为核苷酸类似物和/或具有骨架修饰。所述修饰可为5’或3’末端修饰。一条或两条核酸链可包含至少50％未修饰的核苷酸，至少80％未修饰的核苷酸，至少90％未修饰的核苷酸或100％未修饰的核苷酸。
[0188]
例如，根据本发明的核酸可包含对糖类、核苷或核苷间连接键的修饰，例如，美国专利申请公开第2003/0175950号,第2004/0192626号,第2004/0092470号,第2005/0020525号以及第2005/0032733号中描述的那些。本发明包括具有本文所述的修饰中的任何一种或
一种以上的任何核酸的应用。例如，已报道了多种末端偶联物(例如，脂质(例如，胆固醇)、石胆酸、月桂酸(aluric acid)、长支链烷基)改善细胞摄取。例如，可使用本领域已知的任何合适的测试方法检测类似物和修饰，从而选择使剂或诊断剂的递送得以改善、使核酸的靶向部分与靶标的特异性结合得以改善等等的那些类似物和修饰。在一些实施方式中，根据本发明的核酸可包括一个或一个以上非天然核苷连接键。在一些实施方式中，一个或一个以上位于核酸靶向部分的3’端、5’端或3’端和5’端这两端的内在核苷酸被倒转生成诸如3
’‑3’
连接键或5
’‑5’
连接键之类的连接键。
[0189]
在一些实施方式中，根据本发明的核酸不是合成的，其为已从其天然环境中分离出来的天然生成的实体。
[0190]
可使用任何方法来设计新的核酸靶向部分(请参见例如下列美国专利：6,716,583；6,465,189；6,482,594；6,458,543；6,458,539；6,376,190；6,344,318；6,242,246；6,184,364；6,001,577；5,958,691；5,874,218；5,853,984；5,843,732；5,843,653；5,817,785；5,789,163；5,763,177；5,696,249；5,660,985；5,595,877；5,567,588和5,270,163以及下列美国专利申请公开：2005/0069910,2004/0072234,2004/0043923,2003/0087301,2003/0054360和2002/0064780)。本发明提供一种用于设计新的核酸靶向部分的方法。本发明还提供一种用于从候选核酸靶向部分的混合物中分离或识别新的核酸靶向部分的方法。
[0191]
可设计和/或识别与蛋白质、碳水化合物、脂质和/或核酸结合的核酸靶向部分。在一些实施方式中，核酸靶向部分可被设计和/或识别为在与蛋白质和/或其特征部分结合的本发明的复合物中使用，所述蛋白质和/或其特征部分例如，肿瘤标记物、整合素、细胞表面受体、跨膜蛋白、细胞间蛋白质、离子通道、膜转运蛋白、酶、抗体、嵌合蛋白，等等。在一些实施方式中，核酸靶向部分可被设计和/或识别为在与碳水化合物和/或其特征部分结合的本发明的复合物中使用，所述碳水化合物和/或其特征部分例如，糖蛋白、糖类(例如，单糖、二糖和多糖)、多糖包被(即，大多数真核细胞的外表面上的碳水化合物富集的外周区域)，等等。在一些实施方式中，核酸靶向部分可被设计和/或识别为在与脂质和/或其特征部分结合的本发明的复合物中使用，所述脂质和/或其特征部分例如，油、饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、甘油酯、激素、类固醇(例如，胆固醇、胆汁酸)、维生素(例如，维生素e)、磷脂、神经鞘脂、脂蛋白，等等。在一些实施方式中，核酸靶向部分可被设计和/或识别为在与核酸和/或其特征部分结合的本发明的复合物中使用，所述核酸和/或其特征部分例如，dna核酸、rna核酸、修饰的dna核酸、修饰的rna核酸和包括dna、rna、修饰的dna和修饰的rna的任何组合的核酸，等等。
[0192]
可使用任何可获得的方法设计和/识别核酸靶向部分(例如，适体或spiegelmer)。在一些实施方式中，核酸靶向部分通过从候选的核酸混合物中识别核酸靶向部分来设计和/或识别。指数富集配体系统进化(selex)或其改良方法为从候选的核酸混合物中识别与靶标结合的核酸靶向部分的常用方法。
[0193]
选择性结合任何靶标的核酸靶向部分可通过selex方法或其改良方法分离，条件是所述靶标可用作selex方法中的靶标。
[0194]
b.活化部分
[0195]
总体而言，本发明的化合物包含活化部分。
[0196]
本文中的“活化部分”是指能够刺激或增强个体的免疫系统或肿瘤细胞的分子或
tumor-infiltrating plasmacytoid dendritic cells in head and neck cancer.cancer res 2003；63:6478-6487.zou wp,machelon v,coulomb-l'hermin a,等人，stromal-derived factor-1in human tumors recruits and alters the function of plasmacytoid precursor dendritic cells.nat med 2001；7:1339-1346)和由肿瘤细胞分泌的因子抑制dc成熟(gabrilovich di,corak j,ciernik if等人，decreased antigen presentation by dendritic cells in patients with breast cancer.clin cancer res 1997；3:483-490.bell d,chomarat p,broyles d等人，in breast carcinoma tissue,immature dendritic cells reside within the tumor,whereas mature dendritic cells are located in peritumoral areas.j exp med 1999；190:1417-1425.menetrier-caux c,montmain g,dieu mc等人，inhibition of the differentiation of dendritic cells from cd34(+)progenitors by tumor cells:role of interleukin-6and macrophage colony-stimulating factor.blood 1998；92:4778-4791)。这些未成熟的dc细胞无法在提高抗肿瘤免疫方面发挥作用。相比之下，肿瘤微环境中的dc通过抑制抗肿瘤免疫和促进血管生成而促进肿瘤生长。有证据表明toll样受体7激动剂咪喹莫特和toll样受体9激动剂cpg药物可刺激肿瘤微环境中的pdc，从而抑制肿瘤发展(dummer r,urosevic m,kempf w等人，imiquimod in basal cell carcinoma:how does it work？br j dermatol 2003；149:57-58.miller rl,gerster jf,owens ml等人，imiquimod applied topically:a novel immune response modifier and new class of drug.int j immunopharmacol 1999；21:1-14.hofmann ma,kors c,audring h等人，phase 1evaluation of intralesionally injected tlr9-agonist pf-3512676in patients with basal cell carcinoma or metastatic melanoma.j immunother 2008；31:520-527)。
[0204]
在一些实施方式中，人树突细胞为浆细胞样树突细胞。
[0205]
在一些实施方式中，人树突细胞为髓样树突细胞。
[0206]
在一些实施方式中，活化部分能够特异性结合人tlr7或人tlr8，由此能够活化pdc或mdc。
[0207]
在一些实施方式中，活化部分能够特异性结合人tlr7和人tlr8这两者，由此能够活化pdc和mdc这两者。pdc选择性表达内涵体toll样受体(tlr)7和tlr9，而mdc选择性表达tlr8。bao m,liu yj.regulation of tlr7/9signaling in plasmacytoid dendritic cells,protein cel.2013jan；4(1):40-52.h
é
mont c,neel a,heslan m,braudeau c,josien r.human blood mdc subsets exhibit distinct tlr repertoire and responsiveness.j leukoc biol.2013 apr；93(4):599-609。
[0208]
自然杀伤细胞(nk细胞)
[0209]
在一些实施方式中，活化部分能够活化自然杀伤细胞(nk细胞)，所述自然杀伤细胞优选地为人nk细胞。
[0210]
自然杀伤(nk)细胞为一类细胞毒性淋巴细胞，其构成免疫系统的主要成分。nk细胞为由cd56或cd16的表达和t细胞受体(cd3)的缺乏界定的外周血液淋巴细胞的一个亚型。所述自然杀伤细胞在不引发(priming)mhc非限制性方式的条件下识别并杀伤转化的细胞系。nk细胞在抑制肿瘤和防止细胞受到病毒感染方面发挥重要作用。nk细胞识别靶细胞并
evasion of immune surveillance.cancer res.2005；65(12):5009
–
5014)。tlr3在人乳腺癌细胞中表达(salaun b,coste i,rissoan mc,lebecque sj,renno t.tlr3 can directly trigger apoptosis in human cancer cells.j immunol.2006；176(8):4894
–
4901)，肝癌和胃癌细胞表达tlr2和tlr4(huang b等人，listeria monocytogenes promotes tumor growth via tumor cell toll-like receptor 2signaling.cancer res.2007；67(9):4346
–
4352)，并且tlr9(droemann d等人,human lung cancer cells express functionally active toll-like receptor 9.respir res.2005；6:1)和tlr4(he w,liu q,wang l,chen w,li n,cao x.tlr4 signaling promotes immune escape of human lung cancer cells by inducing immunosuppressive cytokines and apoptosis resistance.mol immunol.2007；44(11):2850
–
2859)通过人肺癌细胞表达。在人肺癌肿瘤细胞中发现tlr7和tlr8(cherfils-vicini j,platonova s,gillard m,laurans l,validire p,caliandro r,magdeleinat p,mami-chouaib f,dieu-nosjean mc,fridman wh,damotte d,saut
è
s-fridman c,cremer i.j.clin invest.2010；120(4):1285
–
1297)。
[0219]
对肿瘤细胞的作用可为各种各样的，例如，在人乳腺癌和黑素瘤细胞中，通过poly i:c刺激tlr3直接触发肿瘤细胞凋亡(salaun b,coste i,rissoan mc,lebecque sj,renno t.tlr3 can directly trigger apoptosis in human cancer cells.j immunol.2006；176(8):4894
–
4901.,salaun b,lebecque s,matikainen s,rimoldi d,romero p.toll-like receptor 3expressed by melanoma cells as a target for therapy？clin cancer res.2007；13(15pt 1):4565
–
4574)。另一方面，人肺癌细胞表达具有功能活性的toll-样受体9并且通过cpg-odn对tlr-9表达细胞系a549和hela的刺激表现出抗细胞凋亡作用。尽管如此，累积的数据表示出tlr很好地与癌细胞结合并且可直接或间接地影响癌细胞。
[0220]
活化部分的化学组成
[0221]
总体而言，本发明的活化部分包含蛋白质、抗体、核酸、小分子或配体。
[0222]
在一些实施方式中，am能够特异性结合人tlr7和/或人tlr8。
[0223]
在一些实施方式中，活化部分包含：(a)单链rna(ssrna)，优选地为orn02，orn06，sspoly(u),ssrna40,ssrna41,ssrna-dr,或poly(dt)，或者(b)配体类似物，优选地为cl075,cl097,cl264,cl307，gardiquimod、洛索立宾(loxoribine)、咪喹莫特或瑞喹莫德(resiquimod)。
[0224]
在一些实施方式中，活化部分包含tlr配体(tlrl)、nod-样受体配体、rig-样受体配体、clr配体、cds配体或炎性体诱导物。
[0225]
在一些实施方式中，活化部分包含一种或一种以上选自以下的tlr的配体：tlr2,tlr3,tlr4,tlr5,tlr7,tlr8,tlr7/tlr8,tlr9和tlr10。
[0226]
tlr为感应微生物产物和/或启动获得性免疫反应的蛋白质家族。tlr活化树突细胞(dc)。tlr为含有富含亮氨酸的重复单元胞外结构域、跨膜结构域和细胞内tir(toll/白介素受体)结构域的保守跨膜分子。tlr识别微生物中的不同结构，通常称为“pamp”(病原体相关分子模式)。与tlr结合的配体引起细胞内信号通路的级联反应，该级联反应诱导参与炎症和免疫的因子的生成。
[0227]
可用于这些受体的示例性的激动剂包括但不限于：脂蛋白、脂多肽、肽聚糖、酵母
聚糖、脂多糖、奈瑟氏球菌孔蛋白、鞭毛蛋白、profiilin、galactoceramide、胞壁酰二肽、giucopyranosyl脂质a(gla)和瑞喹莫德(r848)。肽聚糖、脂蛋白和脂磷壁酸为革兰氏阳性细胞壁成分。脂多糖由大多数细菌表达。鞭毛蛋白为细菌鞭毛的结构成分，所述细菌鞭毛的结构成分由病原细菌和共生细菌分泌。半乳糖苷神经酰胺(galactosylceramide(α-galcer))为天然杀伤t(nkt)细胞的活化剂。胞壁酰二肽为所有细菌共有的生物活性肽聚糖基序。这些激动剂通过toll-样受体介导先天性免疫活化。激动剂与其同源受体的特异性结合通常根据亲和性表达。本发明的配体可以约104m-1
至约108m-1
的亲合力结合。亲合力被计算为kd＝k
off
/k
on
(k
off
为解离速率常数，k
on
为结合速率常数，kd为平衡常数)。可使用单个激动剂或多个激动剂。
[0228]
已发现了人体中至少八种tlr。在细胞表面表达的tlr包括tlr2,tlr3,tlr4,tlr5,tlr7,tlr8或tlr7/tlr8,tlr9和tlr10，并且tlr通过er腔室表达。人树突细胞亚类可基于不同的tlr表达模式来识别。例如，髓样dc或“常规”dc亚类(mdc)当被刺激时表达tlr2至tlr8，并且产生一连串活化标记物(例如，cd80,cd86,i类和ii类mhc,ccr7)，促炎细胞因子和趋化因子。这种刺激和所产生的表达的结果为抗原特异性cd4+t细胞和抗原特异性cd8+t细胞引发。这些dc获得提高的摄取抗原的能力并且以合适的形式将抗原呈递于t细胞。相反，dc的浆细胞样亚类(pdc)在活化后仅仅表达tlr7和tlr9，由此活化nk细胞和t细胞。不受任何特定理论的限制，死亡的肿瘤细胞可对dc功能产生不良影响，假设通过tlr激动剂活化dc在癌症的免疫疗法中对于引发抗肿瘤免疫有益。使用放疗和化疗成功乳腺癌也说明了需要tlr4活化。
[0229]
本领域已知的且在本发明中有用的tlr激动剂包括但不限于：pam3cys(tlr-1/2激动剂)，细胞壁成分产物(lam,lm,lps,lta,lta)(tlr-2激动剂)，malp2(tlr-2激动剂)，pam2cys(tlr-2激动剂)，fsl(tlr-2激动剂)，酵母聚糖(tlr-2激动剂)，pgn(tlr-2激动剂)，polyribosinic，polyribocytidic acid(poly i:c)(tlr-3激动剂)，聚腺苷-聚尿苷酸(polyau，tlr-3激动剂)，通过聚-l-赖氨酸和羧甲基纤维素稳定的聚肌苷-聚胞苷酸(tlr-3激动剂)，单磷酰基脂质a(mpl，tlr-4激动剂)，lps(tlr-4激动剂)，细菌鞭毛蛋白(tlr-5激动剂)，fla(tlr-5激动剂)，orn02(tlr-7/8激动剂)，orn06(tlr-7/8激动剂)，sspoly(u)(tlr-7/8激动剂)，ssrna40(tlr-7/8激动剂)，ssrna41(tlr-7/8激动剂)，ssrna-dr(tlr-7/8激动剂)，poly(dt)(tlr-7/8激动剂)，cl075(tlr-7/8激动剂)，cl097(tlr-7/8激动剂)，cl264(tlr-7/8激动剂)，cl307(tlr-7/8激动剂)，gardiquimod(tlr-7/8激动剂)，洛索立宾(tlr-7/8激动剂)，咪喹莫特(tlr-7/8激动剂)，瑞喹莫德(tlr-7/8激动剂)和odn1585(tlr-9激动剂)，odn1668(tlr-9激动剂)，odn1826(tlr-9激动剂)，odn2006(tlr-9激动剂)，odn2007(tlr-9激动剂)，odn2216(tlr-9激动剂)，odn2336(tlr-9激动剂)，odn2395(tlr-9激动剂)，odn m362(tlr-9激动剂)。
[0230]
在一些实施方式中，活化部分包含：
[0231]
(i)tlr2的配体，其选自：(a)热杀死的细菌产物，优选地为hkal,hkeb,hkhp,hklm,hklp,hklr,hkmf,hkpa,hkpg,或hksa,hksp，和(b)细胞壁成分产物，优选地为lam,lm,lps,lta,lta,pgn,fsl,pam2csk4,pam3csk4,或酵母聚糖；
[0232]
(ii)tlr3的配体，其选自：poly(i:c)和poly(a:u)；
[0233]
(iii)tlr4的配体，其选自：lps和mpla；
[0234]
(iv)tlr5的配体，其选自：fla和鞭毛蛋白；
[0235]
(v)tlr7，tlr 8，或tlr 7和tlr的配体，其选自：orn02(tlr8),orn06(tlr8),sspoly(u)(tlr8),ssrna40(tlr8),ssrna41(tlr8),ssrna-dr(tlr8),poly(dt)(tlr7/8),cl075(tlr7/8),cl097(tlr7/8),cl264(tlr7),cl307(tlr7),gardiquimod(tlr7),洛索立宾(tlr7),咪喹莫特(tlr7/8),和瑞喹莫德(tlr7/8)；
[0236]
(vi)tlr9的配体，其选自：odn1585,odn1668,odn1826,odn2006,odn2007,odn2216,odn2336,odn2395,和odn m362；
[0237]
(vii)tlr10的配体；
[0238]
(viii)核苷酸-寡聚结构域(nod)样配体，其选自：nod1激动剂(c12-ie-dap,ie-dap,tri-dap)、nod2激动剂(l18-mdp,mdp,m-trilys,m-trilys-d-asn,莫拉丁酯(murabutide),n-羟乙酸基-mdp)和nod1/nod2激动剂(m-tridap,pgn)；
[0239]
(ix)一种或一种以上rig-i样受体(rlr)的配体，其选自：5’ppp-dsrna,poly(da:dt),poly(dg:dc),和poly(i:c)；
[0240]
(x)一种或一种以上c型植物凝集素受体(clr)的配体，其选自：凝胶多糖al，hkca，hksc，wgp，酵母聚糖和海藻糖-6,6-二山嵛酸盐；
[0241]
(xi)一种或一种以上细胞溶质dna传感器(cds)的配体，其选自：c-gmp,c-g-amp,c-g-gmp,c-a-amp,c-di-amp,c-di-imp,c-di-gmp,c-di-ump,hsv-60,isd,pcpg,poly(da:dt),poly(dg:dc),poly(da),和vacv-70；以及
[0242]
(xii)炎性体诱导物，其选自：(a)nlrp3炎性体蛋白质复合物，优选地为明矾晶体，atp，cppd晶体，hermozoin，msu晶体，纳米sio2，尼日利亚菌素(nigericin)，以及(b)aim2炎性体蛋白质复合物，优选地为poly(da:dt)。
[0243]
在一些实施方式中，活化部分包括imo2134,imo205,mgn-1703,mgn-1704,阿托莫得(agatolimod),sd-101,qax-935,dims0150,pollinex quattro,om-174,eritoran,tak-242,ni-0101，i型干扰素,ii型干扰素,iii型干扰素,il-12,il-23,il-18,il-7或il-15。
[0244]
在一些实施方式中，活化部分能够特异性结合人tlr7和/或人tlr8，优选地特异性结合tlr7和tlr8这两者(例如，瑞喹莫德(r848))，由此活化部分能够活化pdc和mdc这两者。tlr7和tlr8为系统发育和结构相关的。tlr7由人pdc和b细胞选择性表达。tlr8主要由mdc、单核细胞、巨噬细胞和骨髓抑制细胞表达。tlr7特异性激动剂活化浆细胞样dc(pdc)，从而生成大量1型ifn并且表达高水平的共刺激分子，所述共刺激分子促进t细胞、nk细胞、b细胞和mdc的活化。tlr8特异性激动剂活化髓样dc、单核细胞、巨噬细胞或骨髓衍生的抑制细胞，从而生成大量1型ifn、il-12和il-23，并且表达高水平的i类mhc、ii类mhc和共刺激分子，所述i类mhc、ii类mhc和共刺激分子促进抗原特异性cd4和cd8+t细胞的活化。
[0245]
通过tlr活化人免疫细胞的其他部分或分子可由tlr受体细胞系识别，例如，来自invivogen的293/tlr受体细胞。
[0246]
可活化tlr7和/或tlr8的其他部分或分子以及这些其他部分刺激pdc生成1型ifn的能力、刺激mdc生成1型ifn和il-12的能力、上调cd80和cd86的表达的能力可使用来自invivogen的293/tlr受体细胞来识别。
[0247]
能够通过1型ifn和共刺激分子(例如，由活化的pdc和/或mdc表达的gitr-配体)活化nk细胞的活化部分可通过总外周血单核细胞检测中nk细胞增殖和活化标记物cd69的表
达来识别。
[0248]
能够活化肿瘤细胞以使其经历细胞死亡并生成诸如1型ifn、il-1a/b、tnf或il-6之类的细胞因子的活化部分可使用本领域已知的方法来识别。
[0249]
能够活化dc细胞、单核细胞、巨噬细胞、骨髓抑制细胞、b细胞、nk细胞或肿瘤细胞的其他活化部分或分子可使用本领域已知的方法识别。
[0250]
在一些实施方式中，当靶向部分包括抗体(或其片段)或适体时，活化部分不包括cpg寡核苷酸。
[0251]
在一些实施方式中，尤其是当靶向部分包括抗体或其片段或者适体时，活化部分不包括剂，例如，化疗剂或毒素(例如，抗体药物偶联物中通常使用的毒素)。因此，一般而言，本发明的化合物不包括抗体药物偶联物(adc)或抗体-cpg偶联物。
[0252]
c.连接体
[0253]
总体而言，本发明的化合物包含连接体，所述连接体将靶向部分和活化部分连接。然而，一些化合物不含连接体，活化部分和靶向部分直接连接。
[0254]
本文中的“连接体”是指使第一分子与第二分子通过化学键连接的部分。在本发明的连接体中，可割断连接，从而释放第一和/或第二分子的生物活性形式。连接体的优选实例为包含在中性ph条件下稳定但在较低ph条件下易于发生裂解的化学键的部分。具体而言，优选的连接体的实例为包含在ph为7至8的条件下稳定但在ph为4至6的条件下易于裂解的化学键的部分。连接体的另一实例为包含在存在酶的条件下易于裂解的化学键的部分。这些对酶敏感的连接体的优选实例为肽，所述肽包含内涵体肽酶的识别序列。连接体的另一实例为对氧化还原电位敏感的连接体，该连接体在低还原电位(例如，低浓度的硫醇或谷胱甘肽)条件下稳定但在高还原电位(例如，高浓度的硫醇或谷胱甘肽)条件下裂解。这些对氧化还原电位敏感的连接体的优选实例包括二硫化物和次磺酰胺。具体而言，优选的实例包括取代的芳基-烷基二硫化物，其中，芳基被有空间需求的且吸电子或给电子的取代基取代，从而控制趋于与硫醇反应的二硫键的敏感性。连接体的另一实例为包含在暴露于辐射之后易于裂解的化学键的部分。这些对辐射敏感的连接体的优选实例为2-硝基苄基醚，其在暴露于光之后裂解。具体而言，这些连接体的优选实例为如下部分：在连接键被割断之前该部分掩盖两个连接的分子中的一个的生物活性。
[0255]
在一些实施方式中，本发明的化合物包含选自如下基团的连接体：肼基团、多肽、二硫化物基团和硫醚基团。
[0256]
本文中的“肼基团”或“肼连接体”或“自环化肼连接体”是指在改变条件(例如，ph改变)之后可发生环化反应并形成一个或一个以上环的连接体部分。当连接时，肼基团被转化为腙。这种连接可通过例如在l4部分与酮基团反应而发生。因此，术语肼连接体也可用于描述本发明的连接体，因为这种向腙的转化发生在连接之后。
[0257]
本文中的“五元肼连接体”是指含有肼的分子部分，该部分在条件发生改变(例如，ph发生改变)之后会进行环化反应并形成一个或一个以上五元环。可选地，该五元连接体可被类似地描述为五元肼连接体。
[0258]
本文中的“六元肼连接体”是指含有肼的分子部分，该部分在条件发生改变(例如，ph发生改变)之后会进行环化反应并形成一个或一个以上六元环。该六元连接体可被类似地描述为六元肼连接体。
[0259]
本文中的“环化反应”是指肽、肼或二硫化物连接体的环化，该“环化反应”表示连接体环化形成环并且启动药物配体复合物的分离。环化速率可异地测量并且当至少90％、95％或100％的产物形成时完成环化。
[0260]
在一些实施方式中，本发明的化合物包含位于靶向部分和活化部分之间的连接体区域，并且所述连接体可被存在于细胞内环境(例如，溶酶体或内涵体或小凹内)中的裂解剂裂解。连接体可为例如，肽基连接体，该肽基连接体由细胞内肽酶或蛋白酶(包括但不限于：溶酶体蛋白酶或内涵体蛋白酶)裂解。通常，肽基连接体的长度为至少两个氨基酸的长度或至少三个氨基酸的长度。裂解剂可包括组织蛋白酶b、组织蛋白酶d和纤溶酶，已知组织蛋白酶b、组织蛋白酶d和纤溶酶均可水解二肽药物衍生物，导致靶细胞内部的活物释放(参见例如，dubowchik and walker,1999,pharm.therapeutics 83:67-123)。最典型的连接体为肽基连接体，其可由存在于靶细胞或组织中的酶裂解。例如，可使用可由硫醇依赖性蛋白酶组织蛋白酶-b裂解的肽基连接体(例如，phe-leu或(gly-phe-leu-gly)连接体)，所述硫醇依赖性蛋白酶组织蛋白酶-b在癌组织中高表达。其他这类连接体例如在美国专利第6,214,345号中描述。在一些实施方式中，可由细胞内蛋白酶裂解的肽基连接体为val-cit连接体或phe-lys连接体(参见例如，美国专利第6,214,345号，该美国专利描述了带有val-cit连接体的阿霉素的合成)。使用细胞内蛋白水解释放剂的一个优势为所述剂通常在偶联时被弱化并且偶联物的血清稳定性通常较高。
[0261]
在一些实施方式中，可裂解的连接体为ph敏感的，即对某一ph值条件敏感而发生水解。通常，ph敏感的连接体在酸性条件下可水解。例如，可使用在溶酶体中可水解的酸不稳定连接体(例如，腙、缩氨基脲、硫代缩氨基脲、顺式乌头酰胺、原酸酯、缩醛、缩酮，等等)，参见例如，美国专利第5,122,368号，第5,824,805号，第5,622,929号，dubowchik and walker,1999,pharm.therapeutics 83:67-123；neville等人,1989,biol.chem.264:14653-14661。这些连接体在中性ph条件下相对稳定，例如，在血液中的那些连接体，但是在低于5.5或5.0的ph条件(大约为溶酶体的ph)下不稳定。在一些实施方式中，可水解的连接体为硫醚连接体(例如，通过酰基腙化学键与剂连接的硫醚，参见例如，美国专利第5,622,929号)。
[0262]
在其他实施方式中，连接体为在还原性条件下可裂解的(例如，二硫化物连接体)。本领域已知多种二硫化物连接体，包括例如，可使用sata(n-琥珀酰亚胺基-5-乙酰基硫代乙酸酯)，spdp(n-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯)，spdb(n-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯)和smpt(n-琥珀酰亚胺基-氧羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫代)甲苯)，spdb和smpt(参见例如，thorpe等人,1987,cancer res.47:5924-5931；wawrzynczak等人,in immunoconjugates:antibody conjugates in radioimagery and therapy of cancer(c.w.vogel编辑),oxford u.出版,1987.还参见美国专利第4,880,935号)形成的那些连接体。
[0263]
在其他具体实施方式中，连接体为丙二酸酯连接体(johnson等人,1995,anticancer res.15:1387-93)，马来酰亚胺苯甲酰基连接体(lau等人,1995,bioorg-med-chem.3(10):1299-1304)或3
’‑
n-酰胺类似物(lau等人,1995,bioorg-med-chem.3(10):1305-12)。
[0264]
通常，连接体对细胞外环境基本不敏感。本文在连接体的部分使用的“对细胞外环
境基本不敏感”是指在本发明的化合物样品中，当本发明的化合物存在于细胞外环境(例如，血浆中)时，不超过约20％的连接体裂解，典型地不超过约15％的连接体裂解，更加典型地不超过约10％连接体裂解，甚至更加典型地不超过约5％的连接体裂解，不超过约3％的连接体裂解，或者不超过约1％的连接体裂解。例如，可通过将(a)本发明的化合物(“化合物样品”)和(b)等摩尔量的未偶联的抗体或剂(“对照样品”)独立地与血浆一同孵育一段预定的时间段(例如，2小时、4小时、8小时、16小时或24小时)并随后比较存在于化合物样品中的未偶联的抗体或剂的量和存在于对照样品中的未偶联的抗体或剂的量(例如通过高效液相谱测量)来测定连接体是否对细胞外环境基本不敏感。
[0265]
在其他不相互排斥的实施方式中，连接体促进细胞内在化。在一些实施方式中，当连接体偶联于活化部分时，连接体促进细胞内在化。在其他实施方式中，当连接体偶联于靶向部分和活化部分这两者时，连接体促进细胞内在化。
[0266]
可在本发明的组合物和方法中使用的多种连接体在wo2004010957(名称为“drug conjugates and their use for treating cancer,an autoimmune disease or an infectious disease”)以及us20120141509a1和us20120288512a1(其公开的内容通过引用并入本文)中描述。
[0267]
在一些实施方式中，连接体单元具有如下通式：
[0268]-ta-ww-yy-[0269]
其中，-t-为支架单元，a为0或1，-w-分别独立地为氨基酸单元，w独立地为2至12的整数，-y-为间隔单元，y为0、1或2。
[0270]
支架单元
[0271]
当存在支架单元(-t-)时，该支架单元将靶向部分连接至氨基酸单元(-w-)。可天然地或通过化学操作存在于靶向部分(例如，抗体)上的有用的官能团包括但不限于：巯基、氨基、羟基、碳水化合物的异头羟基和羧基。合适的官能团为巯基和氨基。巯基可通过还原抗体的分子内二硫键生成。可选地，巯基可通过抗体的赖氨酸基团的氨基与2-亚氨基硫杂环戊烷(traut试剂)或其他巯基生成试剂的反应生成。在一些实施方式中，抗体为重组抗体并且被设计为带有一个或一个以上赖氨酸。在其他实施方式中，重组抗体被设计为带有额外的巯基基团，例如，额外的半胱氨酸。
[0272]
在一些实施方式中，支架单元与抗体的硫原子形成化学键。所述硫原子可来源于还原的抗体(a)的巯基基团(-sh)。这些实施方式的代表性的支架单元在通式(iia)和(iib)的方括号中描述，其中，a-、-w-、-y-、-d、w和y为如上所定义的，并且r1选自：-c
1-c
10
亚烷基-、-c
3-c
8-碳环-、-o-(c
1-c8烷基)-、-亚芳基-、-c
1-c
10
亚烷基-亚芳基-、-亚芳基-c
1-c
10-亚烷基-、-c
1-c
10-亚烷基-(c
3-c8碳环)-、-(c
3-c8碳环)-c
1-c
10
亚烷基-、-c
3-c
8-杂环-、-c
1-c
10-亚烷基-(c
3-c8杂环)-、-(c
3-c8杂环)-c
1-c
10
亚烷基-、-(ch2ch2o)r-和-(ch2ch2o)r-ch
2-，并且r为1至10的整数。
[0273][0274]
示例性的支架单元为r1为-(ch2)
5-时的通式(iia)的支架单元：
[0275][0276]
另一示例性的支架单元为r1为-(ch2ch2o)r-ch
2-并且r为2时的通式(iia)的支架单元：
[0277][0278]
另一示例性的支架单元为r1为-(ch2)
5-时的通式(iib)的支架单元：
[0279][0280]
在一些其他具体实施方式中，支架单元通过抗体单元的硫原子和支架单元的硫原子之间的二硫键连接至抗体单元(a)。本实施方式的代表性的支架单元在通式(iii)的方括号中描述，其中，r1、a-、-w-、-y-、-d、w和y是如上所定义的。
[0281][0282]
在其他具体实施方式中，支架的反应性基团包含可与抗体的氨基基团反应的反应位点。氨基基团可为精氨酸或赖氨酸。合适的胺反应位点包括但不限于：活化的酯(例如，琥珀酰亚胺酯、4-硝基苯基酯、五氟代苯基酯)，酸酐、酰氯、磺酰氯、异氰酸酯和异硫氰酸酯。这些实施方式的代表性的支架单元在通式(iva)和(ivb)的方括号中描述，其中，r1、a-、-w-、-y-、-d、w和y为如上所述的。
[0283][0284]
另一方面，支架的反应性官能团包含与可存在于抗体上的修饰的碳水化合物基团反应的反应位点。在一些实施方式中，抗体通过酶的方式被糖基化，从而生成碳水化合物基团。碳水化合物可被诸如高碘酸钠之类的试剂温和地氧化，得到的氧化的碳水化合物的羰基单元可与含有诸如酰肼、肟、反应性胺、肼、硫代氨基脲、肼羧酸酯和芳基酰肼(例如kaneko等人,1991,bioconjugate chem 2:133-41中所描述的那些)之类的官能团的支架缩合。本实施方式的代表性的支架单元在通式(va)至(vc)的方括号中描述，其中，r1、a-、-w-、-y-、-d、w和y为如上所述的。
[0285][0286]
氨基酸单元
[0287]
如果间隔单元存在的话，氨基酸单元(-w-)将支架单元(-t-)连接至间隔单元(-y-)，如果间隔单元不存在的话，氨基酸单元将支架单元连接至细胞毒性剂或细胞抑制剂(活化部分，d)。-ww-为二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽、十肽、十一肽或十二肽单元。每个-w-单元独立地具有如下方括号中所述的通式，并且w为2至12的整数。
[0288][0289]
其中，r2为氢、甲基、异丙基、异丁基、仲丁基、苄基、对羟基苄基、—ch2oh、—ch(oh)ch3、—ch2ch2sch3、—ch2conh2、—ch2cooh、—ch2ch2conh2、—ch2ch2cooh、—(ch2)3nhc(
═
nh)nh2、—(ch2)3nh2、—(ch2)3nhcoch3、—(ch2)3nhcho、—(ch2)4nhc(
═
nh)nh2,—(ch2)4nh2、—(ch2)4nhcoch3、—(ch2)4nhcho、—(ch2)3nhconh2、—(ch2)4nhconh2、—ch2ch2ch(oh)ch2nh2、2-吡啶基甲基-、3-吡啶基甲基-、4-吡啶基甲基-、苯基、环己基、
[0290]
连接体单元的氨基酸单元可通过酶(包括但不限于：肿瘤相关蛋白酶)的方式被酶裂解，从而释放出活化部分(-d)，释放后该活化部分在体内被质子化，从而产生活化分子(d)。
[0291]
示例性的ww单元由通式(vi)至(viii)表示：
[0292][0293]
其中，r3和r4如下表所示：
[0294]
[0295][0296][0297]
其中，r3、r4和r5如下表所示：
[0298][0299][0300]
其中，r3、r4、r5和r6如下表所示：
[0301][0302]
合适的氨基酸单元包括但不限于：通式(vi)单元，其中，r3为苄基，r4为-(ch2)4nh2，r3为异丙基并且r4为-(ch2)4nh2，或者r3为异丙基并且r4为-(ch2)3nhconh2。另一合适的氨基酸单元为通式(vii)单元，其中，r3为苄基、r4为苄基并且r5为-(ch2)4nh2。-ww-单元可在其选择性方面被设计并优化为通过特定的肿瘤相关蛋白酶进行酶裂解。合适的-ww-单元为那些通过蛋白酶(组织蛋白酶b、组织蛋白酶c和组织蛋白酶d)以及纤溶酶催化其裂解的单元。
[0303]
一些实施方式中，-ww-为二肽、三肽或四肽单元。
[0304]
在r2、r3、r4、r5或r6不为氢的条件下，r2、r3、r4、r5或r6所连接的碳原子为手性的。与r2、r3、r4、r5或r6连接的每个碳原子独立地为(s)构型或(r)构型。
[0305]
在一些实施方式中，氨基酸单元为苯基丙氨酸-赖氨酸二肽(phe-lys或fk连接体)。在一些实施方式中，氨基酸单元为缬氨酸-瓜氨酸二肽(val-cit或vc连接体)。在一些
实施方式中，氨基酸单元为5-氨基戊酸、均苯基丙氨酸赖氨酸、四异喹啉羧酸酯赖氨酸、环己基丙氨酸赖氨酸、异酸(isonepecotic acid)赖氨酸、β-丙氨酸赖氨酸、甘氨酸丝氨酸缬氨酸谷酰胺或异酸。
[0306]
氨基酸单元可包含天然氨基酸。在其他实施方式中，氨基酸单元可包含非天然氨基酸。
[0307]
间隔单元
[0308]
当存在间隔单元(-y-)时，该间隔单元将氨基酸单元连接至药物单元。间隔单元为两个大类：自切除的(self-immolative)和非自切除的。非自切除的间隔单元为在tm-连接体-am偶联物或药物连接体化合物中的氨基酸单元酶裂解之后间隔单元的一部分或全部仍然连接于活化部分单元的间隔单元。非自切除间隔单元的实例包括但不限于：(甘氨酸-甘氨酸)间隔单元和甘氨酸间隔单元。当含有甘氨酸-甘氨酸间隔单元或甘氨酸间隔单元的tm-连接体-am偶联物通过肿瘤细胞相关蛋白酶、癌细胞相关蛋白酶或淋巴细胞相关蛋白酶发生酶裂解时，甘氨酸-甘氨酸-药物部分或甘氨酸-药物部分从a-t-ww-中裂解出来。为了释放出am，应当在靶细胞中进行独立的水解反应，从而使甘氨酸-药物单元化学键裂解。
[0309]
在典型的实施方式中，-yy-为可被qm取代的对氨基苄基醚，其中，q为-c
1-c8烷基，-c
1-c8烷氧基、-卤素、-硝基或-氰基，并且m为0至4的整数。
[0310]
在一些实施方式中，非自切除间隔单元(-y-)为-gly-gly-。
[0311]
在一些实施方式中，非自切除间隔单元(-y-)为-gly-。
[0312]
在一些实施方式中，am-连接体化合物或tm-连接体-am偶联物缺乏间隔单元(y＝0)。
[0313]
可选地，含有自切除间隔单元的tm-连接体-am偶联物可释放am(d)，无需单独的水解步骤。在这些实施方式中，-y-为对氨基苄基醇(pab)单元，该对氨基苄基醇(pab)单元通过pab基团的氮原子与-ww-连接并且通过碳酸酯基团、氨基甲酸酯基团或醚基团直接连接于-d。
[0314]
自切除间隔单元的其他实例包括但不限于：与pab基团电子等价的芳香族化合物，例如，2-氨基咪唑基-5-甲醇衍生物(参见例如，hay等人,1999,bioorg.med.chem.lett.9:2237)和邻位或对位-氨基苄基缩醛。可使用酰胺键水解后易于发生环化的间隔单元，例如，取代和未取代的4-氨基丁酸酰胺(rodrigues等人,1995,chemistry biology 2:223)，适当取代的双环[2.2.1]和双环[2.2.2]环系统(storm等人,1972,j.amer.chem.soc.94:5815)以及2-氨基苯基丙酸酰胺(amsberry等人,1990,j.org.chem.55:5867)。甘氨酸的α-位被取代的含胺药物的消除(kingsbury等人,1984,j.med.chem.27:1447)也是自切除间隔单元的策略的实例，该策略可用于tm-连接体-am偶联物。
[0315]
在可选的实施方式中，间隔单元为支链双(羟甲基)苯乙烯(bhms)单元，其可用于合并多个部分。
[0316]
典型的间隔单元(-yy-)由通式(ix)-(xi)表示：
[0317][0318]
其中，q为c
1-c8烷基、c
1-c8烷氧基、卤素、硝基或氰基，并且m为0至4的整数。
[0319][0320]
在一些实施方式中，连接体为酶可裂解的。在一些实施方式中，连接体不为酶可裂解的。
[0321]
iii.药物剂型和给药方式
[0322]
本发明还涉及药物组合物，所述药物组合物包含本发明的化合物或其药学上可接受的盐，以及一种或一种以上药学上可接受的载体。
[0323]
本文所述的化合物(例如，其加成盐或水合物)以及药学上可接受的载体可使用多种不同的给药模式或途径递送至患者。合适的给药途径包括但不限于：吸入给药、透皮给药、口服给药、直肠给药、透过粘膜给药、肠道给药和肠胃外给药(包括肌肉内、皮下和静脉注射)。优选地，包含作为靶向部分的抗体或抗体片段的本发明的化合物以肠胃外的方式给药，更优选地，以静脉注射方式给药。
[0324]
本文使用的术语“给药”意在包括直接和间接地将化合物递送至期望的作用位点的所有方式。
[0325]
本文所述的化合物或其药学上可接受的盐和/或其水合物可单独给药，与本发明的其他化合物联合给药和/或与其他剂联合以混合剂的形式给药。当然，对可与本发明的化合物联合给药的剂的选择部分取决于中的病症。
[0326]
例如，当向患有由依赖于自诱导物的生物体引起的疾病病症的患者给药时，本发明的化合物可以混合剂的形式给药，所述混合剂含有用于疼痛、感染和其他症状以及通常与疾病有关的副作用的药剂。这些药剂包括例如，镇痛剂、抗生素，等等。
[0327]
当向正在进行癌症的患者给药时，化合物可以混合剂的形式给药，所述混合剂包含抗癌剂和/或补充增效剂。所述化合物还可以含有放疗的副作用的药剂的混合剂的形式给药，所述放疗的副作用的药剂例如，止吐药，防辐射剂，等等。
[0328]
可与本发明的化合物联合给药的补充增效剂包括例如，三环类抗抑郁药(例如，米帕明(imipramine)、地昔帕明(desipramine)、阿米替林(amitriptyline)、氯米帕明(clomipramine)、曲米帕明(trimipramine)、多塞平(doxepin)、去甲替林(nortriptyline)、普罗替林(protriptyline)、阿莫沙平(amoxapine)和马普替林(maprotiline))，非三环类抗抑郁药(例如，舍曲林(sertraline)、曲唑酮(trazodone)和西酞普兰(citalopram))，ca2+拮抗剂(例如，维拉帕米(verapamil)、硝苯地平(nifedipine)、尼地平(nitrendipine)和卡罗维林(caroverine))，两性霉素，三苯乙醇类似物(例如，它莫昔芬(tamoxifen))，抗心律失常药物(例如，奎尼丁(quinidine))，抗高血压药物(例如，
利血平(reserpine))，硫醇消耗物(例如，丁硫氨酸和亚砜亚胺)以及甲酰四氢叶酸钙。
[0329]
本发明的活性化合物以其自身的形式给药或者以药物组合物的形式给药，在所述药物组合物中，所述活性化合物与一种或一种以上药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂混合。根据本发明使用的药物组合物通常使用一种或一种以上生理学可接受的载体以常规方式配制，所述生理学可接受的载体包含赋形剂和佐剂，所述生理学可接受的载体有利于将活性化合物加工成可在药学上使用的制剂。合适的剂型取决于所选择的给药途径。
[0330]
对于透过粘膜给药而言，在剂型中使用适于待穿透的屏障的渗透剂。这些渗透剂通常为本领域已知的。
[0331]
对于口服给药而言，化合物易于通过将活性化合物与本领域已知的药学上可接受的载体结合配制。这些载体能够使本发明的化合物配制成由待的患者口服的片剂、药丸、糖衣药丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆状物和悬浮液。口服的药物制剂可通过如下方式获得：将固体赋形剂与活性剂化合物混合，任选地研磨得到的混合物，并对颗粒混合物进行加工，如果想要得到片剂或糖衣片芯的话，需要在该过程之前加入合适的佐剂。具体而言，合适的赋形剂为填充剂(例如，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇的糖)，纤维素制剂(例如，玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、土豆淀粉、明胶、黄耆胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧乙基纤维素钠)和/或聚乙烯吡咯烷酮(pvp)。如果需要的话，可加入崩解剂，例如，交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐(例如，海藻酸钠)。
[0332]
向糖衣片芯提供合适的包衣。为了实现这个目的，可使用浓缩的糖溶液，该溶液可任选地含有阿拉伯树胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆用溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可将染料或颜料加至片剂或糖衣药丸包衣中，用于识别或表征不同的活性化合物剂量组合。
[0333]
可口服使用的药物制剂包括由明胶制成的推合式胶囊和由明胶和增塑剂(例如，丙三醇或山梨糖醇)制成的软的密封的胶囊。推合式胶囊可含有与诸如乳糖之类的填充剂、诸如淀粉之类的粘合剂和/或诸如滑石粉或硬脂酸镁之类的润滑剂和任选地稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性化合物可溶解于或悬浮于合适的液体中，例如，脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。此外，可加入稳定剂。用于口服给药的所有剂型的剂量应当适于这种给药方式。
[0334]
对于口腔给药而言，组合物可以通过常规方式配制的片剂或含片的形式给药。
[0335]
对于吸入给药而言，根据本发明使用的化合物便于通过使用合适的推进剂(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体)以由加压包或喷雾器提供的喷雾的形式递送。在使用加压喷雾的情况下，剂量单位可通过提供递送计量的量的阀来确定。在吸入器或吹入器中使用的胶囊和药筒(例如，明胶胶囊和药筒)可被配制为含有化合物和合适粉末基体(例如，乳糖或淀粉)的粉末混合物的剂型。
[0336]
化合物可被配制为通过注射(例如，快速注射或连续输注)方式肠胃外给药的剂型。注射为本发明的组合物的优选的给药方法。用于注射的剂型可以带有添加的防腐剂的单位剂量形式提供，例如，以安瓶或多剂量容器的形式提供。组合物可采用诸如油性载体或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液之类的形式并且可含有诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂之类的调配剂(formulatory)，并且可加入例如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐(例如，海藻酸钠)。
[0337]
用于肠胃外给药的药物剂型包括水溶性形式的活性化合物的水溶液。此外，活性化合物的悬浮液可制备成合适的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油(例如，芝麻油)或合成的脂肪酸酯(例如，油酸乙酯或甘油三酯)或脂质体。水性注射悬浮液可包含如下物质：该物质增加悬浮液的粘度，例如，羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。任选地，悬浮液还可含有合适的稳定剂或药剂，该稳定剂或药剂增加化合物的溶解度，从而制备高度浓缩的溶液。对于注射而言，本发明的药剂可被配制成水性溶液，优选地配制成生理相容性缓冲液(例如，hanks溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液)。
[0338]
可选地，活性成分可为使用前溶解于合适的载体中的粉末形式，所述合适的载体例如，无菌无热原水。
[0339]
化合物还可被配制成直肠用组合物，例如，栓剂或保留灌肠剂型，例如含有常规栓剂基体(例如可可油或其他甘油酯)。
[0340]
除了前述剂型之外，化合物还可被配制成长效制剂。这种长期起效的剂型可通过植入或经皮递送(例如，皮下递送或肌肉内递送)、肌肉内注射或透皮贴剂给药。因此，例如，化合物可通过合适的聚合材料或疏水性材料(例如，可接受的油中的乳液)或离子交换树脂配制或可将化合物配制成微溶衍生物，例如，配制成微溶的盐。
[0341]
药物组合物还可包含合适的固体或凝胶相载体或赋形剂。这些载体或赋形剂的实例包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖类、淀粉、纤维素衍生物、明胶和诸如聚乙二醇之类的聚合物。
[0342]
优选的药物组合物为配制成注射剂型的组合物，例如，静脉注射剂型，并且该优选的药物组合物包含基于总的100重量％的药物组合物的约0.01重量％至约100重量％的本发明的化合物。药物配体偶联物可为抗体-细胞毒素偶联物，其中，选择靶向特定癌症的抗体。
[0343]
在一些实施方式中，本发明的药物组合物还包含第二化疗剂。
[0344]
本文中的“化疗剂”是指在癌症中有用的化学化合物。实例包括但不限于：吉西他滨(gemcitabine),伊立替康(irinotecan),阿霉素(doxorubicin),5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil),阿糖胞苷(cytosine arabinoside，“ara-c”),环磷酰胺(cyclophosphamide),塞替派(thiotepa),白消安(busulfan),细胞毒素,紫杉酚,甲氨蝶呤(methotrexate),顺铂(cisplatin),美法仑(melphalan),长春碱(vinblastine)和卡铂(carboplatin)。
[0345]
在一些实施方式中，第二化疗剂选自：他莫昔芬(tamoxifen),雷洛昔芬(raloxifene),阿那曲唑(anastrozole),依西美坦(exemestane),来曲唑(letrozole),伊马替尼(imatanib),紫杉醇(paclitaxel),环磷酰胺(cyclophosphamide),洛伐他汀(lovastatin),含羞草素(minosine),吉西他滨(gemcitabine),阿糖胞苷(cytarabine),5-氟尿嘧啶,甲氨蝶呤,多西他赛(docetaxel),戈舍瑞林(goserelin),长春新碱(vincristine),长春碱(vinblastine),诺考达唑(nocodazole),替尼泊苷(teniposide),依托泊苷(etoposide),吉西他滨,埃博霉素(epothilone),长春瑞滨(vinorelbine),喜树碱(camptothecin),柔红霉素(daunorubicin),放线菌素d(actinomycin d),米托蒽醌(mitoxantrone),吖啶(acridine),阿霉素(doxorubicin),表柔比星(epirubicin)或去甲氧基柔红霉素(idarubicin)。
[0346]
iv.试剂盒
[0347]
另一方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包含本发明的化合物或组合物中的一种或一种以上以及使用所述化合物或组合物的说明书。在示例性的实施方式中，本发明提供用于将本发明的连接体臂与另一分子偶联的试剂盒。所述试剂盒包括连接体和用于使连接体与特定的官能团连接的说明书。所述试剂盒还包括细胞毒物、靶向剂、可检测的标记、药学上可接受的盐或缓冲剂中的一种或一种以上。所述试剂盒还可包括容器和任选地一种或一种以上小瓶、测试管、烧瓶、瓶子或注射器。其他形式的试剂盒对于本领域技术人员而言是显而易见的并且在本发明的范围内。
[0348]
v.医疗用途
[0349]
另一方面，本发明提供一种用于需要这种的受治者体内的疾病病症的方法，所述方法包括将药物组合物给药于所述受治者，所述药物组合物包含有效量的本发明的化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。
[0350]
除了上述组合物和构建体之外，本发明还提供本发明的化合物的多种用途。本发明的化合物的用途包括：杀死肿瘤细胞或癌细胞或者抑制肿瘤细胞或癌细胞的生长或复制，癌症、癌前症状、预防肿瘤细胞或癌细胞繁殖、预防癌症、预防表达自体免疫抗体的细胞繁殖。这些用途包括将有效量的本发明的化合物给药于有此需要的诸如哺乳动物或人类之类的动物。
[0351]
本发明的化合物可用于诸如人类之类的动物体内的疾病(例如，癌症)。本发明提供组合物及其在肿瘤中的用途，所述用途包括以药学上可接受的方式向受治者提供药学有效量的本发明的组合物。
[0352]
本文中的“癌症”是指人体内的病理状态，其特征为不受控制的细胞增殖。实例包括但不限于：癌症、淋巴瘤、母细胞瘤和白血病。癌症的更加具体的实例包括但不限于：肺(小细胞和非小细胞)癌、乳腺癌、前列腺癌、类癌性癌症、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、肝癌(肝细胞癌)、肝母细胞瘤、结肠直肠癌、头颈癌、鳞状细胞癌、食管癌、卵巢癌、子宫癌、子宫内膜癌、间皮瘤、黑素瘤、肉瘤、骨肉瘤、脂肪肉瘤、甲状腺癌、硬纤维瘤、急性髓细胞白血病(aml)和慢性髓细胞白血病(cml)。
[0353]
本文中的“抑制”或“”是指降低、性和预防性，其中，目的是降低或预防指定的病理性失调或病症。在一个实施例中，给药本发明的化合物之后，癌症患者可经历肿瘤尺寸减小。“”包括(1)抑制患有或表现出疾病的病理或症状的受治者体内的疾病；(2)缓解患有或表现出疾病的病理或症状的受治者体内的疾病；和/或(3)影响患有或表现出疾病的病理或症状的受治者或患者体内的疾病的任何可测量的降低。本发明的化合物在一定程度上可防止癌细胞生长和/或杀死癌细胞，在该程度上的本发明的化合物可为抑制细胞生长的和/或细胞毒性的。
[0354]
本文中的“有效量”是指有效“”受治者或哺乳动物体内的失调的本文提供的化合物的量。在癌症的情况下，有效量的药物可降低癌细胞的数目，使肿瘤尺寸减小，抑制癌细胞浸润进入外周器官，抑制肿瘤转移，抑制肿瘤生长至某一程度，和/或一定程度地减轻与癌症相关的症状中的一种或一种以上。
[0355]
与一种或一种以上其他剂“联合”给药包括同时给药和以任何顺序连续给药。本文使用的术语“药物组合”是指通过混合活性成分或组合活性成分得到的产品，并且包括
活性成分的固定组合和非固定组合这两者。术语“固定组合”是指活性成分(例如通式(1)的化合物)和联合药剂以单个实体或剂量同时给药于患者。术语“非固定组合”是指活性成分(例如通式(1)的化合物)和联合药剂作为分开的实体同时或按顺序(没有特定的时间限制)给药于患者，这种给药向患者体内提供有效量的活性成分。后者还用于混合剂，例如，给药三种或三种以上活性成分。
[0356]
在一些实施方式中，所述疾病病症为肿瘤。
[0357]
在一些实施方式中，所述疾病病症包括异常细胞增殖，例如癌前病变。
[0358]
本发明尤其对于动物体内的癌症和抑制动物体内的肿瘤细胞的繁殖或癌细胞的繁殖有用。癌症或癌前病症包括肿瘤、转移或任何特征为不受控制的细胞生长的疾病或失调，癌症或癌前病症可通过给药本发明的药物-配体复合物来或预防。化合物将活化部分递送至肿瘤细胞或癌细胞。在一些实施方式中，靶向部分与癌细胞或肿瘤细胞相关抗原特异性结合。由于活化部分靠近配体，所以在内在化之后，活化部分可通过例如受体介导的内吞作用被摄取进入肿瘤细胞或癌细胞的内部。抗原可连接至肿瘤细胞或癌细胞或者可为与肿瘤细胞或癌细胞有关的细胞外基质蛋白质。一旦进入细胞内部，连接体以水解的方式裂解或被肿瘤细胞相关蛋白酶或癌细胞相关蛋白酶以酶的方式裂解，从而释放活化部分。释放的活化部分随后自由扩散并诱导或提高免疫细胞或肿瘤细胞的免疫活性。在可选的实施方式中，活化部分从化合物肿瘤微环境中裂解出来，随后药物渗入细胞。
[0359]
可被本发明的化合物靶定的癌前症状的代表性的实例包括：化生、增生、异常、结肠直肠息肉、光化性角化病、光化性唇炎、人乳头瘤病毒、白斑、扁平苔藓和博温氏病。
[0360]
可被本发明的化合物靶定的癌症或肿瘤的代表性实例包括：肺癌、结肠癌、前列腺癌、淋巴瘤、黑素瘤、乳腺癌、卵巢癌、睾丸癌、cns癌、肾脏癌、肾癌、胰腺癌、胃癌、口腔癌、鼻癌、子宫颈癌和白血病。对于本领域普通技术人员来说明显的是，可选择使活化部分靶定待用药物的肿瘤组织的在化合物中使用的特定靶向部分(即，选择对肿瘤特异性抗原具有特异性的靶向剂)。这种靶向部分的实例是本领域已知的，实例包括用于乳腺癌的抗her2，用于淋巴瘤的抗cd20，用于前列腺癌的抗psma和用于淋巴瘤(包括非霍奇金淋巴瘤)的抗cd30。
[0361]
在一些实施方式中，异常增殖的细胞是癌细胞。
[0362]
在一些实施方式中，癌症选自：乳腺癌、结肠直肠癌、弥漫性大b细胞淋巴瘤、子宫内膜癌、滤泡性淋巴瘤、胃癌、胶质母细胞瘤、头颈癌、肝细胞癌、肺癌、黑素瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和肾细胞癌。
[0363]
在一些实施方式中，本发明提供用于杀伤细胞的化合物。所述化合物以足以杀伤所述细胞的量给药于细胞。在示例性的实施方式中，所述化合物给药于带有所述细胞的受治者。在另一示例性的实施方式中，所述给药使肿瘤的生长延迟或停止，所述肿瘤包括所述细胞(例如，所述细胞可为肿瘤细胞)。对于延迟生长的给药而言，所述细胞的生长速度应当为比给药前的生长速度小至少10％。优选地，生长速度会延迟至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或完全停止。
[0364]
有效剂量
[0365]
适用于本发明的药物组合物包括包含有效量的活性成分的组合物，所述有效量即为有效实现期望目的的量。对特定应用有效的实际量将(尤其)取决于中的病
症。有效量的确定恰好在本领域技术人员的能力范围内(尤其是根据本文具体公开的内容)。
[0366]
对于本文所述的任何化合物而言，有效量可最先通过细胞培养检测法确定。目标血药浓度为能够抑制细胞生长或分裂的活性化合物的浓度。在优选的实施方式中，细胞活性的至少25％被抑制。能够诱导至少约30％、50％、75％或甚至90％或者更高的细胞活性抑制的活性化合物的目标血药浓度为目前优选的。可监测患者体内的细胞活性抑制的百分数，从而评估所达到的血药浓度的适当性，并且可上调或下调剂量以实现期望的抑制百分数。
[0367]
如本领域已知的，用于人体的有效量还可通过动物模型来确定。例如，用于人体的剂量可被配制成实现已在动物体内发现的有效循环浓度。如上所述，人体内的剂量可通过监测细胞抑制和上调或下调剂量来调节。
[0368]
有效剂量还可通过已知的表现出类似药理学活性的化合物的人体数据来确定。所使用的剂量可基于与已知化合物比较的所给药的化合物的相对生物利用度和效力来调节。
[0369]
基于上述方法和本领域熟知的其他方法为实现人体内的最大效力对剂量进行调节恰好在本领域普通技术人员的能力范围内。
[0370]
在局部给药的情况下，所给药的化合物的全身循环浓度不是特别重要。在这种情况下，给药化合物以达到在局部区域有效实现期望的结果的浓度。
[0371]
对于预防和/或与异常细胞增殖有关的疾病方面的应用而言，优选的是，所给药的化合物的循环浓度为约0.001μm至20μm，优选地约0.01μm至5μm。
[0372]
本文所述的化合物的口服给药的患者剂量典型地为约1mg/天至约10,000mg/天，更加典型地为约10mg/天至约1,000mg/天，最典型地为约50mg/天至约500mg/天。按照患者体重而言，典型的剂量为约0.01mg/kg/天至约150mg/kg/天，更加典型地为约0.1mg/kg/天至约15mg/kg/天，最典型地为约1mg/kg/天至约10mg/kg/天，例如，5mg/kg/天或3mg/kg/天。
[0373]
在至少一些实施方式中，延迟或抑制肿瘤生长的患者剂量可为1μmol/kg/天或更少。例如，患者剂量可为0.9μmol/kg/天、0.6μmol/kg/天、0.5μmol/kg/天、0.45μmol/kg/天、0.3μmol/kg/天、0.2μmol/kg/天、0.15μmol/kg/天或0.1μmol/kg/天或更少(参考药物的摩尔数)。优选地，当以每日剂量给药持续至少五天的时间段时，抗体药物偶联物延迟肿瘤生长。
[0374]
对于其他给药模式而言，剂量和间隔可分开调节，从而提供对于中的特定临床适应症有效的给药的化合物的血药浓度。例如，在一种实施方式中，根据本发明的化合物可以相对高的浓度每天多次给药。可选地，更加理想的是，以最小有效浓度给药本发明的化合物并且使用较低频率的给药方案。这会提供与个体的疾病的严重程度相称的方案。
[0375]
使用本文的教导可安排有效的方案，而不导致较大的毒性，并且还完全有效地特定患者表现出的临床症状。这种安排应当包括通过考虑多种因素仔细选择活性化合物，所述多种因素例如，化合物效力、相对生物利用度、患者体重、存在的不良副作用及其严重性、优选的给药模式和所选择的药剂的毒性特征。
[0376]
虽然本文描述并显示了本发明的优选的实施方式，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，这些实施方式仅仅是举例说明。本领域技术人员可对这些实施方式作出多
种改变、修改和替换，而不背离本发明。应当理解的是，本文所述的本发明的可选实施方式可用于实践本发明。通过所附的权利要求来限定本发明的范围，并且这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物也被所附的权利要求涵盖。
[0377]
实施例
[0378]
本发明进一步通过下述实施例举例说明，但本发明不限于此，下述实施例举例说明本发明的化合物的制备方法。
[0379]
实施例1
[0380]
her2或egfr转染的l细胞系的生成
[0381]
试剂：来自atcc(manassas,va；cat no.crl2648)的l细胞，购自sino biological inc.,(cat no.h10004)或genecopoeia,(cat no.z2866)的her2/pez-lv105或egfr/pcmv cdna,葡萄糖dmem,l-谷酰胺,lipofectamine 2000(invitrogen；carlsbad,ca)。
[0382]
为了制备用于筛选偶联的曲妥珠单抗的细胞系，生成表达标记的her2或egfr的l细胞。her2/pez-lv105或egfr/pcmv cdna构建体通过标准lipofectamine 2000操作规程转染至l细胞(该细胞在高浓度葡萄糖dmem+10％ fbs+2mm l-谷酰胺中生长)。
[0383]
结合分析(facs分析)
[0384]
为了确定偶联的曲妥珠单抗的结合能力，对表达人her2的l细胞进行facs分析。简言之，将100μl大约106个带有瞬时转染的her2的l细胞与不同量的曲妥珠单抗偶联的抗体一同孵育，使用pbs或单独的二抗或不相关huigg作为阴性对照。洗涤之后，将细胞重悬于facs缓冲液中并在100μl反应体积中在室温下与偶联至藻红蛋白(mu抗人pe)二抗的20μl小鼠抗人igg一同孵育30分钟。洗涤之后，将细胞固定在200μl 2％多聚甲醛/pbs中，随后进行流式细胞仪分析。将相同的步骤用于作为同种型对照的不相关人igg抗体以设定基线pmt/细胞系。在bd上进行流式细胞仪分析并且记录每个样品的几何平均荧光强度。使用flowjo软件分析记录的数据。结果在图1中显示。
[0385]
抗体toll样受体配体偶联物的生成
[0386]
试剂：曲妥珠单抗(roche/genentech corporation,south san francisco,ca)、西妥昔单抗(merck)、与瑞喹莫德连接的mc-val-cit-pab(mc-vc-pab-tlrl)或与瑞喹莫德连接的mc-(mc-tlrl)(在contract research organization,china合成)、硼酸钠、氯化钠、二硫苏糖醇(dtt)、sephadex g25、dtpa、dtnb和马来酰亚胺基己酰基-单甲基(sigma-aldrich,milwaukee,wisconsin)。
[0387]
用于生成抗体tlr配体偶联物的药物包括曲妥珠单抗和瑞喹莫德(tlrl)，在一些情况下，西妥昔单抗用于偶联物。用于生成tlac的连接体为可裂解的连接体mc-vc-pab或非可裂解的连接体mc。
[0388]
曲妥珠单抗mc-tlrl或西妥昔单抗mc-tlrl的制备
[0389]
曲妥珠单抗通过20mg/ml浓度下的缓冲液交换从中纯化出来，在ph为8.0的条件下溶解于500mm硼酸钠和500mm氯化钠的抗体用过量的100mm二硫苏糖醇(dtt)处理。在37℃孵育约30分钟之后，通过在sephadex g25树脂上的洗脱交换缓冲液并用含有1mm dtpa的pbs进行洗脱。硫醇/ab值通过测定还原的抗体的浓度和硫醇浓度来检测，所述还原的抗体的浓度通过溶液在280nm的吸光度来检测，所述硫醇浓度通过与dtnb(sigma-aldrich,milwaukee,wisconsin)反应以及在412nm处的吸光度来确定。溶解于pbs
biosciences,piscataway,nj；cat no.17-1440-02)，96孔板(costar,cat no.3599,cat no.3916)，台盼蓝(invitrogen cat no 15250-061)，ldh试剂盒(promega,cat no.g7891)，elisa测读仪md5(molecule device)。人源化抗体(genentech corporation,south san francisco,ca；商品名曲妥珠单抗)在使用前复溶于水中以制成10mg/ml原液。
[0395]
为了确定与高效负载的tlrl偶联的曲妥珠单抗是否仍然具有效应功能，检测几种不同偶联形式的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)活性并且与已显示出具有显著提高的adcc活性的曲妥珠单抗参比材料相比。使用来自于健康供体的外周血单核细胞(pbmc)作为效应细胞、使用人skbr3细胞系作为靶细胞进行adcc分析。第一天，将1
×
104/100μl skbr3细胞接种于96孔平板上，随后在37℃、5％co2条件下，孵育48小时。
[0396]
在第三天，由从健康自愿供体获得的人血液制备新鲜的人pbmc。人静脉血样品收集在柠檬酸铵(acd-a)管中。将管颠倒数次，将全部血液转移至一个50ml圆锥管中。用2％fbs中的pbs以1:3稀释血液。将ficoll-hypaque缓慢分配至血液/pbs混合物底部。在室温下以2400rpm的速度对样品进行离心分离持续30分钟，随后通过抽吸除去上层(血浆/pbs)。血沉层(buffy coat)用无菌移液管收集并汇集在50ml圆锥管中。如果在血沉层下仍然可见wbc块，那么收集所有wbc物质，小心不要除去过多的ficoll-hypaque。加入无菌pbs-2％ fbs并通过倒置混合。在室温、250
×
g的条件下对稀释的pbmc悬浮液进行离心分离持续20分钟，收集细胞小粒。pbmc小粒悬浮于具有2％热灭活的fbs的rpmi-1640培养基，洗涤并通过台盼蓝排除法检查活细胞数。制备1.2
×
107细胞/ml的密度待用。同时，在rpmi-1640中制备抗体的最终浓度为从12μg/ml、4μg/ml、1.2μg/ml、0.4μg/ml、0.12μg/ml、0.04μg/ml、0.012μg/ml、0.004μg/ml至0μg/ml。
[0397]
随后将一系列测试抗体和对照抗体的稀释液加至含有靶细胞的孔中，将50μl rpmi-1640培养基中的pbmc效应细胞加至每个孔中(效应细胞与靶细胞的比例为60:1)，并且再孵育17小时。在孵育结束时对平板进行离心处理并使用ldh测量试剂盒分析上清液中的乳酸盐脱氢酶(ldh)活性。细胞溶解使用酶标仪通过490nm处的吸光度定量。仅含有靶细胞的孔的吸光度作为背景对照，而含有用triton-x100溶解的靶细胞的孔提供最大可获得信号。非抗体依赖性细胞毒性在含有靶细胞和效应细胞而未加入抗体的孔中测量。细胞毒性根据下列方程计算：
[0398]
％细胞毒性＝100％x[a490nm(样品)
–
a490(靶细胞)
–
a490(效应细胞]/[a490nm(溶解的靶细胞)
–
a490nm(靶细胞)]
[0399]
相对于抗体浓度绘制一式两份样品稀释液中的平均adcc值，并且通过拟合至prism 5(graphpad)得到ec50值和adcc(％)最大程度。
[0400]
从pbmc中富集人树突细胞(dc)
[0401]
通过ficoll离心，由从健康的自愿供体中获得的血沉层制备人pbmc。通过使用负向消减，由具有来自人pbmc的抗cd3抗体、抗cd19抗体、抗cd20抗体、抗cd14抗体和抗cd16抗体的混合物的磁珠(miltenyi biotec)富集树突细胞。用山羊抗小鼠fitc(谱系)、hla-dr-apccy7、cd123-bv421和cd11c-apc对富集的dc进行染。染的细胞在bd lsr fortessa上进行分析。抗cd3单克隆抗体、抗cd4单克隆抗体、抗cd11c单克隆抗体、抗cd19单克隆抗体、抗cd14单克隆抗体、抗cd16单克隆抗体、抗cd123单克隆抗体购自bd biosciences或biolgend。
[0402]
图3(a)表示富集前后dc的百分数。上部的两个图中的数字表示谱系消减前后总细胞的dc(hla-dr+lin-)百分数。下部图中的数字表示谱系消减前后总dc的mdc(cd11c+cd123-)和pdc(cd123+cd11c-)的百分数。
[0403]
对富集的人dc的刺激以及细胞因子表达
[0404]
将1-2
×
105富集的dc接种于100μl培养基中的96孔平板中，将100μl稀释的刺激剂加至平板中并在37℃的孵育器中培养20至22小时。收集上清液并通过elisa(mabtech ab)分析人ifn-α,il-6,il-12(p70)和tnf-α。
[0405]
统计学分析
[0406]
所有比较的显著性使用student双尾t检测计算，假设模拟组和样品组之间的方差不相等，当p《0.05时认为结果是显著的。参数之间的相关性使用斯皮尔曼秩相关测试评价，p值《0.05被认为是统计学上显著的。
[0407]
使用曲妥珠单抗tlrl偶联物或西妥昔单抗tlrl偶联物进行体内肿瘤细胞杀伤试验
[0408]
对于源自患者的胃癌异种移植物(pdx)小鼠模型的研究而言，将6至8周龄的雌性balb/c裸鼠(获自slac,shanghai,china)用于肿瘤碎片移植。根据动物护理和使用委员会(institutional animal care and use committee)的实验室动物护理和使用指南和规程，用正常裸鼠饮食饲养动物并且将动物养在spf动物设施中。将尺寸为约15mm3至30mm3的患者sto#69胃肿瘤碎片移植(皮下地)到balb/c裸鼠的右侧。
[0409]
对于肺癌异种移植物模型的研究而言，将6至8周龄的雌性balb/c裸鼠用于肿瘤碎片移植。在含有10％血清的rpmi-1640培养基中培养人肺癌细胞系h1650(atcc,cat.#crl5883)，并且将其移植(皮下地)到balb/c裸鼠的右侧。每个小鼠每次接种接受100μl基底膜中的2
×
106个细胞。
[0410]
通过静脉注射途径给药含有5mg/kg至20mg/kg抗体的药物或含有20mg/kg特罗凯(tarceva)或参比药物(qwkx3)的药物。通过卡尺每周测量一次肿瘤以确定其皮下生长。用卡尺每周测量两次肿瘤的二维尺寸。使用如下方程式计算肿瘤体积：肿瘤体积＝(长度
×
宽度2)
×
0.5。平均肿瘤体积或体重使用画图程序prism 5(graphpad)绘制。效力研究的终点设置在第一次后30天至45天或者当肿瘤尺寸达到2000mm3以上时(无论哪个先达到)。如果小鼠失去超过20％的体重或者病得很重并且无法得到足够的食物或水，那么将其从研究中除去并实施安乐死。在终点收集小鼠的肿瘤，在ln2中半冷冻并在福尔马林中半固定，用于制备ffpe组织。
技术特征：
1.一种具有通式(i)的结构的化合物：tm-ln-am(i)，其中，tm为靶向部分，am为能够活化人树突细胞、nk细胞或肿瘤细胞或者它们的组合的活化部分，ln为连接体，n为选自0和1的整数。2.如权利要求1所述的化合物，其中，所述人树突细胞为浆细胞样树突细胞。3.如权利要求1所述的化合物，其中，所述人树突细胞为髓样树突细胞。4.如权利要求1所述的化合物，其中，am能够特异性结合人tlr7或人tlr8。5.如权利要求1所述的化合物，其中，am能够特异性结合人tlr7和人tlr8。6.一种具有通式(i)的结构的化合物：tm-ln-am(i)，其中，tm为靶向部分，am为能够特异性结合人tlr7和/或人tlr8的活化部分，ln为连接体，n为选自0和1的整数。7.如权利要求6所述的化合物，其中，am能够特异性结合人tlr7和人tlr8这两者。8.如权利要求1至7任一项所述的化合物，其中，当tm包含抗体时，am不包含cpg寡核苷酸。9.如权利要求1至8任一项所述的化合物，其中，所述靶向部分能够特异性结合肿瘤细胞或相对于非肿瘤细胞优先结合肿瘤细胞。10.如权利要求9所述的化合物，其中，所述肿瘤细胞为癌细胞、肉瘤细胞、淋巴瘤细胞、骨髓瘤细胞或中枢神经系统癌症细胞。11.如权利要求1至8任一项所述的化合物，其中，所述靶向部分能够特异性结合肿瘤抗原或者相对于非肿瘤抗原优先结合肿瘤抗原。12.如权利要求11所述的化合物，其中，所述肿瘤抗原选自：cd2,cd19,cd20,cd22,cd27,cd33,cd37,cd38,cd40,cd44,cd47,cd52,cd56,cd70,cd79和cd137。13.如权利要求11所述的化合物，其中，所述肿瘤抗原选自：4-1bb,5t4，ags-5,ags-16,血管生成素2,b7.1,b7.2,b7dc,b7h1,b7h2,b7h3,bt-062,btla,caix,癌胚抗原,ctla4,cripto,ed-b,erbb1,erbb2,erbb3,erbb4,egfl7,epcam,epha2,epha3,ephb2,fap,纤连蛋白,叶酸盐受体,神经节苷酯gm3,gd2,糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(gitr),gp100,gpa33,gpnmb,icos,igf1r,整联蛋白αν,整联蛋白ανβ,kir,lag-3,lewis y,间皮素,c-met,mn碳酸酐酶ix,muc1,muc16,粘连蛋白-4,nkgd2,notch,ox40,ox40l,pd-1,pdl1,psca,psma,rankl,ror1,ror2,slc44a4,多配体蛋白聚糖-1,taci,tag-72,腱生蛋白,tim3,trailr1,trailr2,vegfr-1,vegfr-2,vegfr-3和它们的变体。14.如权利要求1至13中任一项所述的化合物，其中，所述靶向部分包含免疫球蛋白、蛋白质、肽、小分子、纳米颗粒或核酸。15.如权利要求14所述的化合物，其中，所述靶向部分包含抗体或其功能片段。16.如权利要求15所述的化合物，所述抗体选自：美罗华(利妥昔单抗)、赫赛汀(曲妥珠单抗)、爱必妥(西妥昔单抗)、维克替比(帕尼单抗)、arzerra(ofatumumab)、benlysta(贝利木单抗)、yervoy(伊匹单抗)、perjeta(帕妥珠单抗)、tremelimumab、nivolumab、dacetuzumab、urelumab、mpdl3280a、lambrolizumab和blinatumomab。17.如权利要求15所述的化合物，其中，所述靶向部分包含fab、fab’、f(ab’)2、单结构
域抗体、t和abs二聚物、fv、scfv、dsfv、ds-scfv、fd、线性抗体、微小抗体、双体抗体、双特异性抗体片段、bibody、tribody、sc-双体抗体、κ(λ)body、bite、dvd-ig、sip、smip、dart或者含有一个或一个以上cdr的抗体类似物。18.如权利要求14所述的化合物，其中，所述靶向部分包含vegfr的atwlppr多肽、血小板反应蛋白-1模拟物、cdcrgdcfcg(环状)多肽、sch221153片段、ncngrc(环状)多肽、ctthwgftlc多肽、cgnkrtrgc多肽(lyp-1)、奥曲肽、伐普肽、兰乐肽、c-3940多肽、达必佳、利普安、诺雷德或西曲瑞克。19.如权利要求14所述的化合物，其中，所述靶向部分包含叶酸或其衍生物。20.如权利要求14所述的化合物，其中，所述靶向部分包含细胞外结构域(ecd)或pd-1,ctla4,btla,kir,tim3,4-1bb,lag3的可溶形式、全长的部分表面配体双调蛋白、β动物纤维素、egf、肝配蛋白、epigen、上皮调节蛋白、igf、神经调节蛋白、tgf、trail或vegf。21.如权利要求14所述的化合物，其中，所述靶向部分包含纳米颗粒。22.如权利要求14所述的化合物，其中，所述靶向部分包含适体。23.如权利要求1至22任一项所述的化合物，其中，所述活化部分包含：(a)单链rna(ssrna)，优选地为orn02、orn06、sspoly(u)、ssrna40、ssrna41、ssrna-dr或poly(dt)；或者(b)受体配体类似物，优选地为cl075、cl097、cl264、cl307、gardiquimod、洛索立宾、咪喹莫特或瑞喹莫德。24.如权利要求23所述的化合物，其中，am包含瑞喹莫德(r848)。25.如权利要求1至24任一项所述的化合物，其中，所述连接体选自：肼基团、多肽、二硫化物基团和硫醚基团。26.如权利要求1至24任一项所述的化合物，其中，所述连接体为酶可裂解的。27.如权利要求1至24任一项所述的化合物，其中，所述连接体不为酶可裂解的。28.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1至27中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，以及一种或一种以上药学上可接受的载体。29.如权利要求28所述的药物组合物，所述药物组合物还包含第二化疗剂。30.如权利要求29所述的药物组合物，其中，所述化疗剂选自：它莫西芬(tamoxifen)，雷洛昔芬(raloxifene),阿那曲唑(anastrozole),依西美坦(exemestane),来曲唑(letrozole),imatanib,紫杉醇,环磷酰胺,洛伐他汀(lovastatin),minosine,吉西他滨(gemcitabine),阿糖胞苷(cytarabine),5-氟尿嘧啶,甲氨蝶呤,多西他赛(docetaxel),戈舍瑞林(goserelin),长春新碱,长春碱,噻氨酯哒唑(nocodazole),替尼泊苷(teniposide),依托泊苷(etoposide),吉西他滨,埃博霉素,长春瑞滨(vinorelbine),喜树碱,道诺霉素(daunorubicin),放线菌素d,米托蒽醌,吖啶,阿霉素,表柔比星,或去甲氧基柔红霉素。31.一种需要这种的受治者体内的疾病病症的方法，所述方法包括将药物组合物给药于所述受治者，所述药物组合物包含有效量的权利要求1至27任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。32.如权利要求31所述的方法，其中，所述疾病病症为肿瘤。33.如权利要求31所述的方法，其中，所述疾病病症包括异常细胞增殖。34.如权利要求33所述的方法，其中，所述异常细胞增殖包括癌前病变。
35.如权利要求33所述的方法，其中，所述异常增殖的细胞为癌细胞。36.如权利要求35所述的方法，其中，所述癌症选自：乳腺癌、结肠直肠癌、弥漫性大b细胞淋巴瘤、子宫内膜癌、滤泡性淋巴瘤、胃癌、胶质母细胞瘤、头颈癌、肝细胞癌、肺癌、黑素瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和肾细胞癌。37.一种具有通式(i)的结构的化合物：tm-ln-am(i)，其中，tm为靶向部分，am为活化部分，ln为连接体，n为选自0和1的整数，条件是当tm包含抗体时，am不包含cpg寡核苷酸或剂。38.如权利要求37所述的化合物，其中，所述活化部分包含tlr配体(tlrl)、nod样受体配体、rig样受体配体、clr配体、cds配体或炎性体诱导物。39.如权利要求38所述的化合物，其中，所述活化部分包含一种或一种以上选自下列的tlr的配体：tlr2,tlr3,tlr4,tlr5,tlr7,tlr8,tlr7/tlr8,tlr9和tlr10。40.如权利要求39所述的化合物，其中，所述活化部分包含：(i)tlr2的配体，其选自：(a)热杀死的细菌产物，优选地为hkal,hkeb,hkhp,hklm,hklp,hklr,hkmf,hkpa,hkpg,或hksa,hksp，和(b)细胞壁成分产物，优选地为lam,lm,lps,lta,lta,pgn,fsl,pam2csk4,pam3csk4,或酵母聚糖；(ii)tlr3的配体，其选自：poly(i:c)和poly(a:u)；(iii)tlr4的配体，其选自：lps和mpla；(iv)tlr5的配体，其选自：fla和鞭毛蛋白；(v)tlr7/8的配体，其选自：orn02,orn06,sspoly(u),ssrna40,ssrna41,ssrna-dr,poly(dt),cl075,cl097,cl264,cl307,gardiquimod,洛索立宾,咪喹莫特,和瑞喹莫德；(vi)tlr9的配体，其选自：odn1585,odn1668,odn1826,odn2006,odn2007,odn2216,odn2336,odn2395,和odn m362；(vii)tlr10的配体；(viii)核苷酸-寡聚结构域(nod)样配体，其选自：nod1激动剂(c12-ie-dap,ie-dap,tri-dap)、nod2激动剂(l18-mdp,mdp,m-trilys,m-trilys-d-asn,莫拉丁酯(murabutide),n-羟乙酰基-mdp)和nod1/nod2激动剂(m-tridap,pgn)；(ix)一种或一种以上rig-i样受体(rlr)的配体，其选自：5’ppp-dsrna,poly(da:dt),poly(dg:dc),和poly(i:c)；(x)一种或一种以上c型植物凝集素受体(clr)的配体，其选自：凝胶多糖al，hkca，hksc，wgp，酵母聚糖和海藻糖-6,6-二山嵛酸盐；(xi)一种或一种以上细胞溶质dna传感器(cds)的配体，其选自：c-gmp,c-g-amp,c-g-gmp,c-a-amp,c-di-amp,c-di-imp,c-di-gmp,c-di-ump,hsv-60,isd,pcpg,poly(da:dt),poly(dg:dc),poly(da),和vacv-70；或(xii)炎性体诱导物，其选自：(a)nlrp3炎性体蛋白质复合物，优选地为明矾晶体，atp，cppd晶体，hermozoin，msu晶体，纳米sio2，尼日利亚菌素(nigericin)，以及(b)aim2炎性体蛋白质复合物，优选地为poly(da:dt)。41.如权利要求37所述的化合物，其中，所述活化部分包含imo2134、imo205、mgn-1703、mgn-1704、agatolimod、sd-101、qax-935、dims0150、pollinex quattro、om-174、eritoran、
tak-242、ni-0101、i型干扰素、ii型干扰素、iii型干扰素、il-12、il-23、il-18、il-7或il-15。
技术总结
本发明公开了用于靶向免疫疗法的化合物，含有该化合物的组合物以及该化合物在诸如癌症之类的疾病的方面的应用。所述化合物具有通式TM-Ln-AM的结构，其中，TM是靶向部分，AM是能够活化人树突细胞、K细胞或肿瘤细胞或者它们的组合的活化部分，Ln是连接体，并且n是选自0和1的整数。自0和1的整数。
