碱性木聚糖酶突变体的制作方法
1.本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种碱性木聚糖酶突变体及其应用。
背景技术：
2.木聚糖是植物半纤维素的主要组成部分，广泛存在于玉米芯、甘蔗渣、麦麸、秸秆等农作物废弃物中，由于木聚糖酶能够将木聚糖分解成不同长度的低聚木糖和木糖，该产物具有重要的经济价值，通过木聚糖酶将这些可利用资源充分利用，发挥其潜在的应用价值，木聚糖酶的研究也受到充分的重视。
3.木聚糖酶（xylanase，xyl）是个复杂的酶系，主要包括β-1,4-内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-l-阿拉伯糖苷酶、α-d-葡糖苷酸酶、乙酰基木聚糖酶和酚酸酯酶[3]，可降解自然界中大量存在的木聚糖类半纤维素，在木聚糖水解酶系中，β-1,4-内切木聚糖酶是最关键的水解酶，它通过水解木聚糖分子的β-1,4-糖苷键，将木聚糖水解为小寡糖和木二糖等低聚木糖，以及少量的木糖和阿拉伯糖。β-木糖苷酶通过水解低聚木糖的末端来催化释放木糖残基。另外，参与彻底降解木聚糖的还有α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡萄糖醛酸苷酶、乙酰木聚糖酯酶，以及能降解木聚糖中阿拉伯糖侧链残基与酚酸（如阿魏酸或香豆酸）形成的酯键的酚酸酯酶等侧链水解酶，它们作用于木糖与侧链取代基之问的糖苷键，协同主链水解酶的作用，最终将木聚糖转化为它的组成单糖。现在木聚糖酶已广泛应用于造纸、食品、饲料和能源等领域，带来了很大的经济效益。
[0004]
木聚糖酶是第一个成为工业用商品酶的半纤维素酶。自viikari等首次发现使用木聚糖酶处理硫酸盐纸浆能增强制浆漂白度和降低在纸浆漂白等造纸过程中环境污染物的用量后，制浆造纸工业中对木聚糖酶的研究已全面展开，并取得了可喜的成果。将木聚糖酶融入到造纸生产工业中，不仅可以降低原料的黏度，分解多余的半纤维素，促进原料生成可溶性脂类成分，改善纸张性能，更重要的是可利用木聚糖酶对纸浆原料进行预处理，辅助等化学漂白剂渗透到纸浆，大大减少化学漂白剂的使用，进而有效减少环境污染。
[0005]
在纸浆和造纸工业中，造纸工艺多需较高的ph及高温蒸煮的方法除去原浆中的木质素，受这种严格的工艺条件限制，工业生产应用上需要具有耐高温、耐碱、催化活性高、成本低等特性的木聚糖酶。目前的木聚糖酶普遍存在活性不高、酶学性质不能满足工业生产应用的需求、发酵成本过高等问题，限制了木聚糖酶在造纸工业中的应用。大多数自然界中筛选获得的野生型木聚糖酶菌株往往产酶量、酶学性质等都达不到工业化应用的需要，故利用基因工程方法获得高活性且酶学性质优良的木聚糖酶编码基因和构建高效的表达菌株是研究的趋势。
技术实现要素：
[0006]
本发明的目的是提供一种新的碱性木聚糖酶突变体。本发明通过对来源于放线杆菌（actinobacteria bacterium）的木聚糖酶进行蛋白质工程改造，获得了突变体蛋白，使其对高温和碱性环境的耐受性得到显著提高，有利于其在造纸领域的广泛应用。
[0007]
申请人通过对木聚糖酶进行随机突变和大量筛选，发现t3c和t30c两个突变位点能引起木聚糖酶耐热性和耐碱性的改变，从而促成本发明。
[0008]
本发明一方面提供了一种木聚糖酶，其氨基酸序列为seq id no:1，其编码核苷酸序列为seq id no:2。
[0009]
本发明另一方面提供了一种木聚糖酶突变体，其包含与seq id no:1具有至少90%同一性的氨基酸序列，且与seq id no:1相比在第3位或/和第130位上发生了氨基酸的取代。
[0010]
所述突变体的氨基酸序列与seq id no:1相比具有至少91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，或至少99%的同一性。
[0011]
所述突变体的氨基酸序列与seq id no:1相比具有至少99.1%，99.2%，99.3%，99.4%，99.5%，99.6%，99.7%，99.8%，或至少99.9%的同一性。
[0012]
所述突变体包含的取代为t3c，t30c或t3c/t30c中的任意一个。
[0013]
所述突变体的氨基酸序列如seq id no:3或seq id no:5或seq id no:7所示。
[0014]
本发明还涉及编码上述木聚糖酶突变体的dna分子。
[0015]
所述木聚糖酶突变体dna分子的编码序列如seq id no:4或seq id no:6或seq id no:8所示。
[0016]
本发明还涉及包含上述dna分子的重组表达质粒。
[0017]
本发明还涉及一种宿主细胞，包含上述重组表达质粒。
[0018]
在本发明的一些实施例中，宿主细胞为毕赤酵母（pichia pastoris）。
[0019]
将上述重组表达质粒转入毕赤酵母宿主细胞中进行重组表达，获得的木聚糖酶突变体在高温和碱性环境中具有更高的酶活力。
[0020]
本发明还涉及上述木聚糖酶突变体在造纸领域中的应用。
[0021]
本发明所述木聚糖酶突变体xyn11-1、xyn11-2、xyn11-3的最适作用ph为6.0，与野生型一致；但突变体对ph 9.0-12.0的碱性条件耐受性更强，37℃处理2h后，其酶活残留率均高于90%；尤其是突变体xyn11-3，其在ph9.0-12.0条件下几乎没有酶活损失，取得了意料不到的技术效果。
[0022]
本发明提供的木聚糖酶突变体xyn11-1和xyn11-2的最适作用温度均为65℃，与野生型一致，但在90℃条件下分别处理30min后，其酶活残留率比野生型分别提高了22.4%和108.0%；突变体xyn11-3的的最适作用温度是70℃，明显高于野生型；而且其耐热性最强，80℃、85℃和90℃处理30min后，酶活残留率分别高达98.37%、96.75%和56.46%，比野生型分别提高了322.7%、847.6%和731.5%，取得了意料不到的技术效果。
[0023]
与野生型相比，本发明所述木聚糖酶突变体的耐热性和耐碱性均得到显著提高，有利于其在造纸行业的广泛推广和应用。
具体实施方式
[0024]
本发明公开了一种碱性木聚糖酶突变体、其制备方法及应用、编码该碱性木聚糖酶突变体的dna分子、载体、宿主细胞，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现
和应用本发明技术。
[0025]
本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如molecular cloning：a laboratory manual，3nd ed. (sambrook, 2001)和current protocols in molecular biology (ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。例如，本发明可选用如下实验材料和试剂：菌株与载体：大肠杆菌dh5α、毕赤酵母gs115、载体ppic9k、amp、g418均购自invitrogen公司。
[0026]
酶与试剂盒：pcr酶及连接酶购买自takara公司，限制性内切酶购自fermentas公司，质粒提取试剂盒及胶纯化回收试剂盒购自omega公司，genemorph ii随机诱变试剂盒购自北京博迈斯生物科技有限公司。
[0027]
培养基配方：大肠杆菌培养基（lb培养基）：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%nacl，ph7.0；酵母培养基（ypd培养基）：1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖；酵母筛选培养基（md培养基）：2%蛋白胨，2%琼脂糖；bmgy培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mm磷酸钾缓冲液(ph6.0)，1.34% ynb，4
×
10-5
% 生物素，1%甘油；bmmy培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mm磷酸钾缓冲液(ph6.0)，1.34% ynb，4
×
10-5
% 生物素，0.5%甲醇；lb-amp培养基：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%nacl，100μg/ml氨苄青霉素，ph7.0；lb-amp平板：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%nacl，1.5%琼脂，100μg/ml氨苄青霉素，ph7.0；下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1 表达质粒的构建将来源于放线杆菌（actinobacteria bacterium）的木聚糖酶基因（genbank pzn45477.1）根据毕赤酵母密码子偏好性进行密码子优化，并在其起始密码子atg前增加6个碱基gaattc（ecor i酶切位点），在其终止密码子taa后增加gcggccgc（not i酶切位点）。优化后的核苷酸序列由上海捷瑞生物工程有限公司合成。将该木聚糖酶命名xyn11，其氨基酸序列为seq id no：1，编码核苷酸序列为seq id no：2。
[0028]
用限制性内切酶ecor i和not i（fermentas）对木聚糖酶基因进行酶切；同时，用限制性内切酶ecor i和not i对质粒ppic9k进行酶切。使用凝胶纯化试剂盒将酶切产物纯化，并用t4 dna连接酶（fermentas）将上述两个酶切产物连接。将连接产物转化进dh5α大肠杆菌（invitrogen），涂布于lb+amp平板，37℃倒置培养，待转化子出现后，菌落pcr（反应体系：模板挑取的单克隆，rtaqdna聚合酶 0.5μl，10
×
buffer 2.0μl，dntps（2.5mm）2.0μl，5’aox引物（10mm）：0.5μl，3’aox引物：0.5μl，ddh2o 14.5μl，反应程序：95℃预变性5min，30个循环： 94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 2min，72℃ 10min），验证阳性克隆子，并进行测序分析。使用质粒小量制备试剂盒（omega）从测序结果正确的大肠杆菌克隆中纯化质粒，测序结果显示获得的dna序列为seq id no：2，其编码的氨基酸序列为seq id no：1，从而说明表达
质粒构建成功，命名为ppic9k-xyn11。
[0029]
实施例2 耐高温木聚糖酶突变体的筛选为了进一步提高木聚糖酶xyn11的耐温性，对其进行蛋白结构分析。该蛋白是11家族木聚糖酶，其结构为β-果冻卷的结构，蛋白质表面和蛋白质的活性中心都是暴露在外界环境中。所以，外界环境的改变，特别是高温环境，既可以直接影响到酶的表面结构的稳定性，也可以直接影响酶的活性中心的稳定性。要提高该酶在高温环境中的耐受性，就要提高蛋白整体的刚性，稳定酶的整体结构，在不破坏该酶蛋白二级结构与活性中心的前提下，进一步对该基因进行突变。
[0030]
1.1设计pcr引物xyn11-f1、xyn11-r1：xyn11-f1：ggcgaattcgatacttgtatcactcaaaaccaaac（下划线为限制性内切酶ecori识别位点）；xyn11-r1：atagcggccgcttatccaatggtaacagttgatgatcc（下划线为限制性内切酶noti识别位点）。
[0031]
以xyn11基因（seq id no：2）为模板，利用上述引物用genemorph ii随机突变pcr试剂盒（博迈斯）进行pcr扩增，胶回收pcr产物，ecori、noti进行酶切处理后与经同样酶切后的pet21a载体连接，转化至大肠杆菌bl21（de3）中，涂布于lb+amp平板，37℃倒置培养，待转化子出现后，用牙签逐个挑至96孔板，每个孔中加入150μl含有0.1mm iptg的lb+amp培养基，37℃ 220rpm培养6 h左右，离心弃上清，菌体用缓冲液重悬，反复冻融破壁，获得含有木聚糖酶的大肠杆菌细胞裂解液。
[0032]
分别取出两份裂解液做如下处理：第一份裂解液用ph8.0的缓冲液稀释，第二份裂解液用ph8.0的缓冲液稀释后于75℃处理30min；然后分别取上述处理好的30 μl裂解液至两块新的96孔板，两块96孔板都加入30 μl用相应缓冲液配置的底物，于50℃反应30 min后，dns法测定生成的还原糖，计算突变体的酶活残留率。
[0033]
实验结果表明，不同的突变体在高温处理后保持的活性不同。有些突变对木聚糖酶的耐温性没有影响，有些突变甚至使其耐温性或酶活变得更差了；另外还有些突变，虽然能提高木聚糖酶的耐温性，但突变导致其酶学性质发生了显著的变化，这些均不符合要求。最终，申请人筛选到既能显著提高木聚糖酶xyn11的耐温性，又不会影响其酶活及原有酶学性质的突变位点及位点的组合：t3c，t30c单点突变，t3c/t30c 两点突变。
[0034]
含t3c单点突变的木聚糖酶突变体命名为xyn11-1，其氨基酸序列为seq id no：3，编码核苷酸序列为seq id no：4；含t30c单点突变的木聚糖酶突变体命名为xyn11-2，其氨基酸序列为seq id no：5，编码核苷酸序列为seq id no：6；含t3c/t30c两点突变的木聚糖酶突变体命名为xyn11-3，其氨基酸序列为seq id no：7，编码核苷酸序列为seq id no：8。
[0035]
实施例3 木聚糖酶在毕赤酵母中的表达3.1表达质粒的构建依照毕赤酵母的密码偏爱性对碱性木聚糖酶突变体xyn11-1，xyn11-2和xyn11-3的基因序列进行优化合成，基因由上海捷瑞生物工程有限公司合成，并且在合成序列5’和3’两端分别加上ecori和noti两个酶切位点。
[0036]
按照实施例1中的方法，将合成的突变体的基因序列xyn11-1，xyn11-2和xyn11-3分别进行ecori和noti双酶切，然后与经同样酶切后的ppic-9k载体16℃过夜连接，并转化
大肠杆菌dh5a，涂布于lb+amp平板，37℃倒置培养，待转化子出现后，菌落pcr验证阳性克隆子，经测序验证后获得了正确的重组突变体表达质粒，分别命名为ppic9k-xyn11-1，ppic9k-xyn11-2和ppic9k-xyn11-3。
[0037]
3.2毕赤酵母工程菌株的构建3.2.1酵母感受态制备将毕赤酵母gs115菌株进行ypd平板活化，30℃培养48 h后接种活化的gs115单克隆于6 ml ypd液体培养基中，30℃、220 rpm，培养约12 h后转接菌液于装有30ml ypd液体培养基的三角瓶中，30℃、220 rpm培养约5h，经紫外分光光度计检测其菌体密度，待其od600值在1.1
–
1.3范围后，4℃ 9000 rpm离心2 min分别收集4ml菌体至灭菌ep管中，轻轻弃上清，用灭菌的滤纸吸干残留的上清后用预冷的1 ml灭菌水重悬菌体，4℃、9000 rpm离心2 min，轻轻弃上清，重复用1ml灭菌水洗一遍后，4℃、9000 rpm离心2 min，轻轻弃上清，预冷的1ml山梨醇（1 mol/l）重悬菌体；4℃、9000 rpm离心2 min，轻轻弃上清，预冷的100-150μl山梨醇（1 mol/l）轻柔重悬菌体。
[0038]
3.2.2转化和筛选分别将实施例1和实施例3.1中构建获得的表达质粒用sac i进行线性化，线性化片段纯化回收后通过电穿孔法分别转化毕赤酵母gs115，在md平板上筛选得到毕赤酵母重组菌株，然后在含不同浓度遗传霉素的ypd平板（0.5mg/ml-8mg/ml）上筛选多拷贝的转化子。
[0039]
将获得的转化子分别转接于bmgy培养基中，30℃、250rpm振荡培养1d；再转入bmmy培养基中，30℃、250rpm振荡培养；每天添加0.5%的甲醇，诱导表达4 d；9000rpm离心10min去除菌体，即得到分别含木聚糖酶xyn11及其突变体的发酵上清液。
[0040]
（1）木聚糖酶酶活单位的定义在温度为50℃、ph为8.0的条件下，每分钟从浓度为5mg/ml的木聚糖溶液中降解释放1μmol还原糖所需要的酶量即为一个酶活性单位，以u表示。
[0041]
（2）木聚糖酶酶活测定方法吸取10.0 ml木聚糖溶液，50℃平衡20 min。
[0042]
吸取10.0 ml经过适当稀释的酶液，50℃平衡5 min。
[0043]
空白样品测定：吸取2.00 ml经过适当稀释的酶液（已经过50℃平衡），加入到刻度试管中，再加入5ml dns试剂，电磁振荡3 s。然后加入2.0 ml木聚糖溶液，50℃平衡30 min，沸水浴加热5 min。用自来水冷却至室温，加水定容至25 ml，电磁振荡3 s～5s。以标准空白样为空白对照，在540 nm处测定吸光度ab。
[0044]
样品测定：吸取2.00 ml经过适当稀释的酶液（已经过50℃平衡），加入到刻度试管中，再加入2.0 ml木聚糖溶液（已经过50℃平衡），电磁振荡3 s，50℃精确保温30 min。加入5.0 ml dns试剂，电磁振荡3 s，以终止酶解反应。沸水浴加热5 min，用自来水冷却至室温，加水定容至25 ml，电磁振荡3 s。以标准空白样为空白对照，在540 nm处测定吸光度ae。
[0045]
xd=。
[0046]
式中：xd—试样稀释液中木聚糖酶的活力，u/ml；ae
—酶反应液的吸光度；ab—酶空白样的吸光度；k—标准曲线的斜率；co—标准曲线的截距；m—木糖的摩尔质量m（c5xyn110o5）= 150.2 g/mol；t—酶解反应时间，min；1000—转化因子，1 mmol = 1000 μmol；xd值应在0.04—0.10 u/ml之间。如果不在这个范围内，应重新选择酶液的稀释度，再进行分析测定。
[0047]
x = xd·df
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
（2）x—试样中木聚糖酶的活力，u/ml；df—试样的稀释倍数。
[0048]
（3）测定结果按照上述方法进行酶活检测，结果显示：上述构建得到的重组表达木聚糖酶xyn11及其突变体的毕赤酵母重组菌株发酵上清液的酶活为120-330 u/ml。
[0049]
实施例4木聚糖酶的酶学性质测定1、最适作用ph采用ph值分别为ph 4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的0.1m磷酸氢二钠-0.05m柠檬酸，ph 8.0、8.5、9.0的0.2m硼酸-0.05m硼砂，ph9.5、10.0、11.0、12.0的0.05m硼砂-0.2m氢氧化钠的缓冲液将上述毕赤酵母重组菌株的发酵上清液进行稀释测定，木聚糖底物也分别用对应ph值的缓冲液配制，在50℃的条件下进行木聚糖酶酶活测定，以最高酶活为100%，计算相对酶活。
[0050]
结果显示，野生型木聚糖酶xyn11及其突变体xyn11-1、xyn11-2、xyn11-3的最适作用ph值均为6.0。
[0051]
2、ph耐受性分析用去离子水将上述毕赤酵母重组菌株发酵上清液稀释至50u/ml，取1ml上清液分别加入到已预热10min的9ml缓冲液中，所述缓冲液的ph分别为9.0、10.0、11.0、12.0；37℃处理2h，反应结束迅速加入5ml补充液，摇匀，然后用缓冲液稀释，测定残余酶活。以未处理样品酶活计100%，计算酶活残留率。
[0052]
酶活残留率（%）=处理后样品的酶活/未处理样品的酶活
×
100%。
[0053]
结果显示，本发明提供的木聚糖酶突变体xyn11-1、xyn11-2、xyn11-3对ph 9.0
‑ꢀ
12.0的碱性条件耐受性更强，37℃处理2h后，酶活残留率均高于90%；尤其是突变体xyn11-3，其在ph9 .0
‑ꢀ
12.0条件下几乎没有酶活损失，取得了意料不到的效果。
[0054]
3、最适反应温度分别在50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃，ph8.0条件下，对上述毕赤酵母重组菌株的发酵上清液进行木聚糖酶酶活测定，以最高酶活为100%，计算相对酶活。
[0055]
结果显示，野生型木聚糖酶xyn11的最适作用温度为65℃；而木聚糖酶突变体xyn11-1、xyn11-2和xyn11-3的最适温度分别是65℃、65℃和70℃。
[0056]
4、耐热性分析将上述毕赤酵母重组菌株发酵上清液用0.1m磷酸氢二钠-0.05m柠檬酸稀释至200u/ml，再用预热10min的缓冲液稀释10倍，混合均匀，80℃、85℃和90℃条件下分别处理30min，结束时取样并冷却至室温，然后测定其木聚糖酶酶活，以未处理样品酶活计100%，计算酶活残留率。具体结果见表1。
[0057]
酶活残留率（%）=处理后样品的酶活/未处理样品的酶活
×
100%。
[0058]
表1 木聚糖酶xyn11及其突变体的耐热性分析从表1的结果可知，与野生型木聚糖酶xyn11相比，本发明提供的单点突变体xyn11-1和xyn11-2、两点突变体xyn11-3在90℃条件下处理30min后，酶活残留率分别提高了22.4%、108.0%、731.5%。从而说明，本发明提供的t3c和t30c两个突变位点能显著提高木聚糖酶xyn11对高温环境的耐受性，其中含t3c和t30c两点组合的木聚糖酶突变体xyn11-3的耐热性最强，80℃、85℃和90℃处理30min后，其酶活残留率分别高达98.37%、96.75%和56.46%，比野生型分别提高了322.7%、847.6%和731.5%，取得了意料不到的技术效果。
[0059]
综上所述，本发明提供的木聚糖酶突变体与野生型相比，其耐热性和耐碱性均得到显著提高，有利于其在造纸行业的广泛推广和应用。
技术特征：
1.一种木聚糖酶突变体，其特征在于，所述突变体包含与seq id no:1具有至少90%同一性的氨基酸序列，且与seq id no:1相比在第3位或/和第130位上发生了氨基酸的取代。2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列与seq id no:1相比具有至少91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，或至少99%的同一性。3.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列与seq id no:1相比具有至少99.1%，99.2%，99.3%，99.4%，99.5%，99.6%，99.7%，99.8%，或至少99.9%的同一性。4.如权利要求1-3任一所述的突变体，其特征在于，所述突变体包含的取代为t3c，t30c或t3c/t30c中的任意一个。5.如权利要求4所述的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如seq id no:3或seq id no:5或seq id no:7所示。6.编码权利要求5所述木聚糖酶突变体的dna分子。7.包含权利要求6所述dna分子的重组表达质粒。8.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞包含权利要求7所述的重组表达质粒。9.如权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为毕赤酵母（pichia pastoris）。10.权利要求1-5任一所述木聚糖酶突变体在造纸领域中的应用。
技术总结
本发明涉及基因工程与蛋白质改造技术领域，具体提供了一种新的碱性木聚糖酶突变体。本发明通过对来源于放线杆菌（Actinobacteria bacterium）的木聚糖酶进行蛋白质工程改造，获得了突变体蛋白，使其对高温和碱性环境的耐受性得到显著提高，有利于其在造纸领域的广泛应用。用。
