Prdx1IgG中和抗体及其制备方法和在制备急性器官损伤药物中的应用
prdx1 igg中和抗体及其制备方法和在制备急性器官损伤药物中的应用
技术领域
1.本发明属于医药领域，具体涉及prdx1 igg中和抗体及其制备方法和在制备急性器官损伤药物中的应用。
背景技术：
2.急性肝损伤(acute liver injury,以下简称ali)是由各种原因引起的肝脏损害，其病情发展迅速。研究表明，外源性物质，如病毒感染、滥用酒精或药物以及接触毒素都可能导致ali。在我国急性肝损伤的首要病因是病毒感染，其次是药物。由于长期的肝损伤会导致慢性肝脏炎症和纤维化反应，而ali所引起的坏死后型肝硬化更是不能治愈。这不仅严重影响患者的生活质量，同时也给国家带来了沉重的医疗负担。因此预防急性、慢加急性和/或慢性肝损伤对公共卫生非常重要。对于严重ali，肝移植是最有效的手段之一，但统计表明接受肝移植的患者不足10％。当前国内外对急性肝衰竭的十分有限，病死率非常高。因此，寻ali的替代疗法是一项迫切的医疗需求。
3.全球范围内已经开展了大量研究工作以寻有效的防治ali的药物，部分在临床使用较长时间，但目前这些药物的效果依然差强人意。
4.急性肾损伤(acute kidney injury，aki)是一种临床常见的综合征，它的发生常伴随着患者住院时间延长，部分患者预后不良进一步发展为慢性肾脏病。全球每年约1300万人发生aki(85％的患者生活在发展中国家)，约170万人死于aki及其并发症。aki可发生于临床多个学科，特别是在icu中发病率超过50％。在我国，一项大样本多中心流行病学调查数据显示，按照kdigo aki的诊断标准和扩展标准，aki发生率为0.99％和2.03％，而住院病死率高达12.4％。近年来，无论是高收入国家还是低收入国家，aki的患病率均呈迅速上升趋势，且病死率居高不下，给国家和社会造成了巨大的经济负担。
5.长期以来临床对于aki始终沿袭对症支持的原则，静待肾脏病变自身的转归，迄今为止尚无一种可以用于在aki中减轻肾组织损伤或促进肾脏修复或防止后期肾脏慢性纤维化的药物获批上市。
技术实现要素：
6.本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供prdx1 igg中和抗体及其制备方法和在制备急性器官损伤药物中的应用，用以解决目前医药领域对于急性肝损伤和急性肾损伤药物的缺失的技术问题。
7.为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：
8.一种prdx1 igg中和抗体，其主要由igg与prdx1蛋白特异性结合后得到。
9.上述的prdx1 igg中和抗体，优选的，所述prdx1 igg中和抗体包括prdx1单克隆中和抗体或prdx1多克隆中和抗体。
10.优选的，所述prdx1 igg中和抗体包括兔来源、人来源、小鼠来源、大鼠来源或人鼠
嵌合的prdx1中和抗体。
11.peroxiredoxin1(prdx1，prx1)是一种抗氧化蛋白，属于peroxiredoxins(prdxs)超家族。prdx1是该家族中表达最为广谱、表达丰度最高的成员，被认为是体内最重要的抗氧化酶之一。经过前期的研究发现：prdx1的中和抗体具有对于急性肝、肾损伤的潜在作用。有望成为一种急性肝、肾损伤的新药，用以解决目前医药领域对于急性肝损伤和急性肾损伤药物的缺失的技术问题。
12.基于一个总的发明构思，还提供一种prdx1 igg中和抗体的制备方法，包括以下步骤：采用重组prdx1蛋白作为免疫原，免疫哺乳动物，获得表达prdx1 igg中和抗体的哺乳动物，最后制备和纯化prdx1 igg中和抗体。
13.上述的制备方法，优选的，具体包括以下步骤：
14.(1)选取兔作为免疫动物，在制备中和抗体之前进行血清采集；
15.(2)于第1天采用免疫原，即重组prdx1蛋白0.4-0.6mg，并予以完全弗氏佐剂对免疫动物进行皮下注射免疫原；
16.(3)于第14天、第35天、第56天采用免疫原，即重组prdx1蛋白0.2-0.3mg，并予以不完全弗氏佐剂对免疫动物进行皮下注射免疫；
17.(4)于第63天，采集步骤(3)处理后的兔血液，提取血清，使用血清进行elisa检测是否存在prdx1 igg中和抗体；
18.(5)挑选出血清中表达prdx1 igg中和抗体的兔子，于第70天再次使用0.2-0.3mg免疫原并予以不完全弗氏佐剂对免疫动物进行加免；
19.(6)采集步骤(5)处理后的兔子血清，采用抗原亲和柱纯化抗体，即得到所述的prdx1igg中和抗体；并使用elisa法检测其与prdx1重组蛋白的亲和力；使用western blot法检测prdx1 igg中和抗体的特异性。
20.基于一个总的发明构思，还提供一种prdx1 igg中和抗体在制备急性器官损伤药物中应用。
21.优选的，所述急性器官损伤包括急性肝损伤、急性肾损伤、急性肺损伤或炎症性肠病活动期损伤。
22.更优选的，所述急性肝损伤包括但不限于脂多糖/d-氨基半乳糖胺诱导或对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤；所述脂多糖/d-氨基半乳糖胺诱导的急性肝损伤的主要表现为炎症、氧化应激/细胞坏死和凋亡；所述对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤为以药物或毒物中毒引起的急性肝损伤。
23.更优选的，所述急性肾损伤包括但不限于肾缺血再灌注损伤诱导的急性肾损伤。所述肾缺血再灌注损伤诱导的急性肾损伤的主要表现为氧化应激或炎症损伤。
24.所述急性肺损伤包括各种原因诱导的急性肺损伤；所述炎性肠病活动期损伤包括各种原因、病因引起的炎性肠病。
25.优选的，所述prdx1 igg中和抗体急性器官损伤可用于小鼠或其他哺乳动物。
26.优选的，所述prdx1 igg中和抗体用于急性肝损伤及急性肾损伤时，用于兔、鼠的给药剂量为300ug/只。
27.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
28.1.本发明利用重组prdx1蛋白免疫兔，获得血清igg中和抗体(即prdx1 igg中和抗
体)，其有中和、阻断血清中prdx1的促炎作用，能够急性器官损伤，例如急性肝损伤、急性肾损伤、急性肺损伤和炎症性肠病活动期损伤。
29.2.本发明制备原材料易得，凡是哺乳类都可以免疫产生prdx1 igg中和抗体，提取或重组同源性所有的prdx1蛋白都属于免疫原。
附图说明
30.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
31.图1为本发明用于免疫印迹的照片，上样为小鼠原代巨噬细胞、肝组织、肾组织；
32.图2为elisa检测小鼠原代巨噬细胞分泌炎症因子的结果；
33.图3为脂多糖/d-氨基半乳糖诱导急性肝损伤模型中各组小鼠肝脏he染图(200倍)；
34.图4为对乙酰氨基酚诱导急性肝损伤模型中各组小鼠肝脏he染图(200倍)；
35.图5为缺血再灌注诱导的急性肾损伤模型中各组小鼠肾脏he染图(200倍)。
具体实施方式
36.为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
37.除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
38.除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
39.本发明采用的重组prdx1蛋白为市场上可以买到的过氧化还原酶1重组蛋白，采购自abclone公司(武汉市东湖高新区生物园三路高科园三路9号武汉精准医疗产业基地，邮编430074)。
40.实施例1：
41.一种prdx1 igg中和抗体，由peroxiredoxin1和igg抗体特异性结合得到。其制备方法的步骤如下：
42.s1、选取兔作为免疫动物，在制备中和抗体之前进行血清采集(5ml/只)；
43.s2、于第1天采用免疫原，即重组prdx1蛋白0.5mg，并予以完全弗氏佐剂进行皮下多点(4点)注射免疫；
44.s3、于第14天、第35天、第56天采用免疫原，即重组prdx1蛋白0.25mg，并予以不完全弗氏佐剂进行皮下多点(4点)注射免疫；
45.s4、于第63天，采集上述兔的血液，1ml/只，提取血清，使用上述血清进行elisa检测是否存在prdx1 igg中和抗体；
46.s5、挑选出血清中表达prdx1 igg中和抗体的兔子，于第70天再次使用0.25mg免疫
原并予以不完全弗氏佐剂进行加免；
47.s6、采集上述兔子血清，采用抗原亲和柱纯化抗体，得到所述的prdx1 igg中和抗体；并使用elisa法检测其与prdx1重组蛋白的亲和力(见下表1)；使用western blot法检测prdx1 igg中和抗体的特异性(见图1)，证明prdx1 igg可有效识别不同组织来源的prdx1。
48.表1通过elisa方法检测prdx1 igg对于重组prdx1的结合活性
[0049][0050]
实验方法：
[0051]
本实施例将在体外验证prdx1 igg中和抗体可中和重组prdx1蛋白，阻断其诱导小鼠原代巨噬细胞分泌炎症因子的作用，下文将对prdx1 igg中和抗体的体外抗炎效果进行论证：
[0052]
1.实验方法
[0053]
(1)小鼠原代巨噬细胞的提取
[0054]
采用10周龄c57雄性小鼠3只，3％硫代乙醇酸盐溶液按每只小鼠3ml的量腹腔注射。3天后处死小鼠，收集腹腔灌洗液铺板，2h后换液洗去未贴壁细胞。
[0055]
(2)重组prdx1刺激小鼠原代巨噬细胞
[0056]
上述原代巨噬细胞采用空1640培基培养，分为空白组、重组prdx1刺激组、重组prdx1+prdx1 igg中和抗体组、prdx1 igg中和抗体组。重组prdx1刺激时加入200nm prdx1，prdx1 igg中和抗体每孔加入200nm(以一般igg平均分子量约为160kda换算得到)。12或24h后收集细胞上清，elisa法检测上清内的炎症因子含量。
[0057]
2.统计学方法：所有计量数据以
±
s表示，多组间比较采用单因素方差(anova)分析：该统计学方法是药物领域实验中对于此类多组间疗效差异比较的最常用方法。得到组间有差异后，再使用turky检验进一步验证组内差异。定义双侧p《0.05认为有统计学意义。
[0058]
3.实验结果
[0059]
3.1prdx1 igg中和抗体可以阻断重组prdx1刺激小鼠原代巨噬细胞产生il-1β、tnf-α及il-6等炎症因子的作用(如图2)差异，证明prdx1 igg中和抗体可阻断小鼠原代巨噬细胞分泌炎症因子，具有统计学意义。
[0060]
实施例2：
[0061]
本实施例将prdx1 igg中和抗体应用于急性肝损伤药物的制备中，下文将对prdx1 igg中和抗体的效果进行论证：
[0062]
1.实验方法
[0063]
(1)制备脂多糖/d-氨基半乳糖胺诱导急性肝损伤(ali)实验动物模型以观察
prdx1 igg中和抗体炎症、氧化应激/细胞坏死和凋亡为主要表现的ali的疗效：
[0064]
spf级c57bl/6小鼠(10-12周龄，雄性，体重25-28g)共17只，分为3组，分别为对照组、模型组和实验组。模型组及prdx1 igg中和抗体组小鼠以100μg/kg lps和500mg/kg d-gain的剂量腹腔注射造模。造模后2h予以中和抗体组小鼠prdx1 igg中和抗体300ug/只的剂量腹腔注射，而正常组及模型组小鼠注射同等剂量的对照igg。造模后6h麻醉小鼠并采血留取血清，随后处死小鼠。
[0065]
(2)制备对乙酰氨基酚(paracetamol，apap)诱导急性肝损伤(ali)实验动物模型以观察prdx1 igg中和抗体药物、毒物中毒等引起的ali的疗效：
[0066]
spf级c57bl/6小鼠(8-10周龄，雄性，体重23-25g)共18只，分为3组，分别为对照组、模型组和实验组。模型组及prdx1 igg中和抗体组小鼠以300mg/kgapap的剂量腹腔注射造模。对照组小鼠每只腹腔注射生理盐水0.3ml。造模后2h予以中和抗体组小鼠prdx1 igg中和抗体300ug/只的剂量腹腔注射，而正常组及模型组小鼠注射同等剂量的对照igg。造模后8h麻醉小鼠并采血留取血清，随后处死小鼠。
[0067]
分离(1)和(2)的小鼠肝脏，留取左外叶制石蜡切片，余下肝脏组织置于液氮罐中。连续监测法检测各组小鼠肝功能，石蜡切片行he染观察肝脏损伤情况。
[0068]
lps/d-gain模型肝脏组织损伤评分标准参考carlos a.等人采用的方法对肝脏病理损伤进行半定量分析。评分标准：0级：受伤的证据很少或没有；1级：轻度损伤，胞浆空泡化，局灶性核固缩；2级：中度至重度损伤，伴有广泛的核固缩、胞质嗜酸性粒细胞增多和胞间边界缺失；3级：伴有肝索脱失、出血和中性粒细胞浸润的严重坏死。apap模型中肝脏组织损伤评分标准参考zhang-xu liu等人采用的方法对肝脏病理损伤进行半定量分析。评分标准：0分：无损伤；0.5分：在邻近中心层的第一个细胞层上看到的单个坏死细胞，并且存在亚线变性；1分：坏死细胞从中央静脉延伸出两到三个细胞层；2分：坏死细胞从中央静脉延伸三至六个细胞层，但局限于周围分布；3分：与2相同，但坏死从一个中心静脉延伸到另一个；4分：比3更严重，整个切片广泛小叶中心坏死。每张切片随机选取200倍视野5个视野进行评分，取平均值为该例样本评分值。
[0069]
2.统计学方法：所有计量数据以
±
s表示，多组间比较采用单因素方差(anova)分析：该统计学方法是药物领域实验中对于此类多组间疗效差异比较的最常用方法。得到组间有差异后，再使用turky检验进一步验证组内差异，即模型组与对照组的差异及各剂量给药组相对于模型组的差异是否具有统计学意义。定义双侧p《0.05认为有统计学意义。
[0070]
3.实验结果
[0071]
3.1he染结果
[0072]
lps/g-gain损伤后6小时，小鼠肝脏出现了较为广泛胞间边界缺失，肝索脱失及坏死、肝窦充血，核固缩。与模型组相比，予以prdx1 igg中和抗体后的小鼠肝脏中，上述病变明显减轻，损伤范围减小(如图3所示)，且肝脏损伤病理评分明显降低(p《0.05)，见表2。apap损伤后24小时，小鼠肝脏出现了较为广泛细胞凋亡、核固缩及坏死。与模型组相比，予以prdx1 igg中和抗体后的小鼠肝脏中，上述病变明显减轻，损伤范围减小(如图4所示)，见表3。
[0073]
表2 lps/g-gain致肝损伤中各组小鼠肝脏损伤评分(x
±
s)
[0074][0075][0076]
表3 apap致肝损伤中各组小鼠肝脏损伤评分(x
±
s)
[0077][0078]
3.2各组小鼠血转氨酶检测结果
[0079]
与对照组相比，lps/d-gain模型组小鼠血转氨酶明显升高，予以prdx1 igg中和抗体疗后，小鼠血转氨酶明显下降，且差异具有统计学意义(p《0.001)，详见表4。与对照组相比，apap模型组小鼠血转氨酶明显升高，予以prdx1 igg中和抗体疗后，小鼠血转氨酶明显下降，且差异具有统计学意义(p《0.01)，详见表5。
[0080]
表4 lps/d-gain致肝损伤中各组小鼠血转氨酶水平(x
±
s)
[0081][0082]
表5 apap致肝损伤中各组小鼠血转氨酶水平(x
±
s)
[0083][0084]
上表2、表3、表4、表5中，*与对照组相比，p《0.05；**与对照组相比，p《0.01；***与对照组相比，p《0.001；#与对照组相比，p《0.05；##与对照组相比，p《0.01；###与对照组相比，p《0.001；
[0085]
4.实验结论：prdx1 igg中和抗体能有效lps/d-gain及apap诱导的小鼠急性肝损伤。
[0086]
实施例3：
[0087]
本实施例将prdx1 igg中和抗体应用于急性肾损伤药物的制备中，下文将对prdx1 igg中和抗体对于缺血再灌注引起的急性肾损伤(以氧化应激及炎症为主要损伤表现)的效果进行论证：
[0088]
1.实验方法
[0089]
(1)制备肾缺血再灌注损伤(iri)诱导的急性肾损伤(aki)小鼠模型以观察prdx1 igg中和抗体aki的疗效：spf级c57bl/6小鼠(8-10周龄，雄性，体重23-25g)共11只，分为3组，分别为对照组、iri+igg组和iri+prdx1中和抗体组。iri+igg组及iri+prdx1中和抗体组小鼠用水合氯醛麻醉，剃除背部毛发，背部左右两侧切口暴露并分离双侧肾蒂，用非创伤性微血管夹夹住肾蒂30分钟，然后松开血管夹开始再灌注，缝合切口。在整个手术过程中，小鼠体温通过温控加热装置保持在36.5-37.5℃。造模后20h予以中和抗体组小鼠prdx1 igg中和抗体300ug/只的剂量腹腔注射，而正常组及模型组小鼠注射同等剂量的对照igg。造模后24h麻醉小鼠并采血留取血清，随后用生理盐水进行心脏灌注并处死小鼠。分离小鼠肾脏，留取同一侧肾脏的一半组织固定，石蜡包埋切片行he染观察肾脏损伤情况；余下组织置于液氮罐中。小鼠血清送检肾功能检测。
[0090]
2.统计学方法：所有计量数据以
±
s表示，多组间比较采用单因素方差(anova)分析：该统计学方法是药物领域实验中对于此类多组间疗效差异比较的最常用方法。得到组间有差异后，再使用turky检验进一步验证组内差异，即模型组与对照组的差异及各剂量给药组相对于模型组的差异是否具有统计学意义。定义双侧p《0.05认为有统计学意义。
[0091]
3.实验结果
[0092]
3.1 he染结果
[0093]
可见模型组(iri)小鼠肾小管出现明显的肾小管的上皮细胞明显肿胀、空泡变性、脱落、坏死及管腔扩张。予以prdx1 igg中和抗体后，上述病变范围及程度均明显减轻(如图5)。在he染切片中对肾小管损伤进行评分。实验结果显示，与假手术组相比，模型组肾小管损伤评分显著的增高，差异具有统计学意义(p＜0.001)；在给予prdx1 igg中和抗体后，与模型组相比，肾小管损伤评分显著降低(p＜0.001)。
[0094]
3.2各组小鼠血肾功能检测结果
[0095]
与对照组相比，缺血再灌模型组小鼠血肌酐明显升高，予以prdx1中和抗体疗后，小鼠血血肌酐明显下降，且差异具有统计学意义(p《0.01)，详见表6。
[0096]
表6缺血再灌致肾损伤中各组小鼠血肾功能水平(x
±
s)
[0097][0098][0099]
表中，*与对照组相比，p《0.05；**与对照组相比，p《0.01；***与对照组相比，p《0.001；
#
与模型组相比，p《0.05；
##
与模型组相比，p《0.01；
###
与模型组相比，p＜0.001。
[0100]
4.实验结论：prdx1中和抗体能有效缺血再灌诱导的小鼠急性肾损伤。
技术特征：
1.一种prdx1 igg中和抗体，其特征在于，其主要由igg与prdx1蛋白特异性结合后得到。2.根据权利要求1所述的prdx1 igg中和抗体，其特征在于，所述prdx1 igg中和抗体包括prdx1单克隆中和抗体或prdx1多克隆中和抗体。3.根据权利要求1或2所述的prdx1 igg中和抗体，其特征在于，所述prdx1 igg中和抗体包括兔来源、人来源、小鼠来源、大鼠来源或人鼠嵌合的prdx1中和抗体。4.一种如权利要求1-3中任一项所述的prdx1 igg中和抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：采用重组prdx1蛋白作为免疫原，免疫哺乳动物，获得表达prdx1 igg中和抗体的哺乳动物，最后制备和纯化prdx1 igg中和抗体。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：(1)选取兔作为免疫动物，在制备中和抗体之前进行血清采集；(2)于第1天采用免疫原，即重组prdx1蛋白0.4-0.6mg，并予以完全弗氏佐剂对免疫动物进行皮下注射免疫原；(3)于第14天、第35天、第56天采用免疫原，即重组prdx1蛋白0.2-0.3mg，并予以不完全弗氏佐剂对免疫动物进行皮下注射免疫；(4)于第63天，采集步骤(3)处理后的兔血液，提取血清，使用血清进行elisa检测是否存在prdx1 igg中和抗体；(5)挑选出血清中表达prdx1 igg中和抗体的兔子，于第70天再次使用0.2-0.3mg免疫原并予以不完全弗氏佐剂对免疫动物进行加免；(6)采集步骤(5)处理后的兔子血清，采用抗原亲和柱纯化抗体，即得到所述的prdx1igg中和抗体。6.一种如权利要求1-3中任一项所述的prdx1 igg中和抗体或由权利要求4-5中任一项所述制备方法制备得到的prdx1 igg中和抗体在制备急性器官损伤药物中应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述急性器官损伤包括急性肝损伤、急性肾损伤、急性肺损伤或炎症性肠病活动期损伤。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述急性肝损伤包括脂多糖/d-氨基半乳糖胺诱导或对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述脂多糖/d-氨基半乳糖胺诱导的急性肝损伤的主要表现为炎症、氧化应激/细胞坏死和凋亡；所述对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤为以药物或毒物中毒引起的急性肝损伤。10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述急性肾损伤包括肾缺血再灌注损伤诱导的急性肾损伤；所述肾缺血再灌注损伤诱导的急性肾损伤的主要表现为氧化应激或炎症损伤。
技术总结
本发明属于医药领域，具体公开了一种Prdx1IgG中和抗体，其主要由IgG与Prdx1蛋白特异性结合后得到。还公开了该Prdx1IgG中和抗体的制备方法和在制备急性器官损伤药物中应用。本发明利用重组prdx1蛋白免疫哺乳动物，获得血清IgG中和抗体(即Prdx1IgG中和抗体)，其有中和、阻断血清中Prdx1的促炎作用，能够急性器官损伤，例如急性肝损伤、急性肾损伤、急性肺损伤和炎症性肠病活动期损伤。肺损伤和炎症性肠病活动期损伤。肺损伤和炎症性肠病活动期损伤。
