PAX6基因突变体及其应用的制作方法
pax6基因突变体及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物领域，具体涉及pax6基因突变体及其应用，更具体地涉及核酸、多肽、基因突变，用于先天性无虹膜症的药物、构建体、重组细胞、检测先天性无虹膜症的试剂盒等。
背景技术：
2.先天性无虹膜是一种全眼疾病，发病率为1.31/100000，影响双侧的虹膜、角膜、晶状体、中心凹和视神经的形成，其明显特征是虹膜完全或部分发育不全，伴有眼球震颤和中心凹发育不全，是出生后视力下降的主要原因。而迟发性白内障、无虹膜相关角膜病变（ark）和青光眼会导致进一步的视力丧失。无虹膜患者的表型多种多样，虹膜受累范围从几乎正常到无虹膜，中心凹发育不全的程度也有所不同。
3.大约三分之一的先天性无虹膜病例为散发病例，而三分之二的先天性无虹膜病例有明确的遗传史，符合常染体显性遗传模式。在11p13区域染体缺失引起的wagr综合征（肾母细胞瘤、无虹膜、泌尿生殖系统疾病和精神发育迟滞）中可能出现先天性无虹膜散发病例。pax6位于染体区域11p13，大小为22kb，调节约450kb的基因组dna（lagali n, wowra b, fries fn, latta l, moslemani k, utheim tp, wylegala e,seitz b, kasmann-kellner b. pax6 mutational status determines aniridia associated keratopathy phenotype. ophthalmology. 2020;127(2):273
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5. moosajee, m.; hingorani, m.; moore, a.t. pax6-related aniridia. in genereviews((r)); adam, m.p .,ardinger, h.h., pagon, r.a., wallace, s.e., bean, l.j.h., stephens, k., amemiya, a., eds.; university of washington: seattle, dc, usa, 2018.）。转录因子在生物进化过程中高度保守，参与各种组织和器官的胚胎发育，尤其是眼睛的发育。pax6基因中的杂合致病性突变被认为是先天性无虹膜的主要原因。“pax6突变数据库”目录报告了pax6中的所有突变，并记录了490多个独特的突变体（2018年最后一次更新）。这些突变大多是移码突变、剪接位点突变或无义突变，被认为会产生截短或无义转录物，导致与眼部异常体征相关的单倍体不足，而其它突变是错义的。在数据库中，约96%的变体是基因内突变，其它是5'和3'调控区中描述的全基因缺失或变体（pedersen, h.r.; hagen, l.a.; landsend, e.c.s.; gilson, s.j.; utheim, o.a.; utheim, t.p .; neitz, m.; baraas, r.c.color vision in aniridia. investig. ophthalmol. vis. sci. 2018, 59, 2142
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2152.）。
技术实现要素：
4.本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种pax6基因突变体及其应用。先天性无虹膜是一种先天性眼部异常，大约80%的先天性无虹膜病例是由pax6的基因突变引起的。三分之二的无虹膜病例有明显的遗传史，为常染体显性遗传，其余病例为散发病例。公认的是，核苷酸变化，包括无义、
移码（帧外插入或缺失）和pax6中引入过早终止密码子（ptc）的大多数剪接位点突变，主要导致突变转录物的降解，并导致50%的pax6蛋白水平的损失。ptc是pax6中最常见的突变，导致出现空等位基因。pax6中的ptc突变与严重虹膜发育不全和最严重和最早发病的ark有关，而错义突变与影响较小的虹膜和较轻的非进展性ark有关。发明人利用高通量测序技术对dna的目标片段进行测序，研究了1个中国先天性无虹膜系，鉴定了1个新的致病性突变，还分析了与之相关的表型特征。
5.为此，本发明第一方面提供一种核酸。在本发明的一些实施方案中，与野生型pax6基因相比，所述核酸具有c.314dela突变。
6.发明人首次发现人类(homo sapiens)pax6基因（登录号：nm_001604）的c.314dela突变，chr11:31823193-31823194，导致pax6蛋白发生移码突变，第105号氨基酸由赖氨酸突变为丝氨酸并产生新的阅读框架，终止于第105号密码子下游33号密码子处。这种突变导致编码氨基酸的过早终止，最终导致pax6单倍体剂量不足。c.314dela突变与先天性无虹膜症的发病密切相关，从而可以通过检测上述基因突变在生物样品中是否发生，可以有效地检测生物样品源自的个体是否患先天性无虹膜症。
7.本发明第二方面提供一种多肽。在本发明的一些实施方案中，所述多肽由第一方面所述的核酸表达而成。
8.发明人发现，pax6基因的c.314dela突变，导致pax6蛋白发生移码突变，第105号氨基酸由赖氨酸突变为丝氨酸并产生新的阅读框架，终止于第105号密码子下游33号密码子处。这种突变导致编码氨基酸的过早终止，最终导致pax6单倍体剂量不足。而pax6蛋白与先天性无虹膜症的发病密切相关。
9.本发明第三方面提供一种可检测的基因突变。在本发明的一些实施方案中，与野生型pax6基因相比，所述基因突变具有c.314dela突变。
10.发明人首次发现pax6基因的c.314dela突变，chr11:31823193-31823194，导致pax6蛋白发生移码突变，c.314dela突变与先天性无虹膜症的发病密切相关，从而可以通过检测上述基因突变在生物样品中是否发生，可以有效地检测生物样品源自的个体是否患先天性无虹膜症。
11.本发明第四方面提供检测第一方面所述的核酸或第二方面所述的多肽或第三方面所述的可检测的基因突变的试剂在制备试剂盒或者设备中的用途。在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒或者设备用于诊断先天性无虹膜症。
12.上述的基因突变、核酸、多肽与先天性无虹膜症的发病密切相关，进而能够检测上述的基因突变、核酸或者多肽的试剂能够用于制备试剂盒或设备，所得到的试剂盒或者设备能有效筛选出患先天性无虹膜症，尤其是常染体显性先天性无虹膜症的生物样品。
13.在本发明的一些实施方案中，所述试剂包括特异性针对所述核酸、所述多肽、所述基因突变中至少之一的探针、引物、抗体以及质谱检测试剂的至少之一。
14.本发明第五方面提供生物模型在筛选药物中的用途。在本发明的一些实施方案中，所述生物模型携带下列至少之一：（1）第一方面所述的核酸；（2）表达第二方面所述的多肽；（3）第三方面所述的可检测的基因突变。
15.在本发明的一些实施方案中，所述生物模型为细胞模型或者动物模型。
16.本发明第六方面提供特异性改变第一方面所述的核酸或者第三方面所述的可检测的基因突变的试剂在制备药物中的用途。在本发明的一些实施方案中，所述药物用于先天性无虹膜症。
17.需要说明的是，这里的特异性改变是指能使得突变的核酸或者基因突变的位点恢复到原来的野生状态或者其它不具有致病性的状态，而对于个体基因组的其它序列不产生实质影响。如前所述，前面所述的核酸或者前面所述的基因突变与先天性无虹膜症，尤其是常染体显性先天性无虹膜症的发病密切相关，由此，特异性改变前面所述的核酸或者前面所述的基因突变的试剂制备的药物能有效用于先天性无虹膜症，尤其是常染体显性先天性无虹膜症。
18.在本发明的一些实施方案中，所述先天性无虹膜症为常染体显性先天性无虹膜症。
19.在本发明的一些实施方案中，所述试剂为基于同源重组修复、碱基的直接插入修复、talen、zfn中至少之一进行缺失修复的试剂。
20.本发明第七方面提供一种用于先天性无虹膜症的药物。在本发明的一些实施方案中，所述药物含有：特异性改变第一方面所述的核酸或者第三方面所述的可检测的基因突变的试剂。
21.需要说明的是，这里的特异性改变是指能使得突变的核酸或者基因突变的位点恢复到原来的野生状态或者其它不具有致病性的状态，而对于个体基因组的其它序列不产生实质影响。如前所述，前面所述的核酸或者前面所述的基因突变与先天性无虹膜症的发病密切相关，由此，包含特异性改变前面所述的核酸或者前面所述的基因突变的试剂的药物能有效用于先天性无虹膜症。
22.在本发明的一些实施方案中，所述先天性无虹膜症为常染体显性先天性无虹膜症。
23.在本发明的一些实施方案中，所述试剂为基于同源重组修复、碱基的直接插入修复、talen、zfn中至少之一进行缺失修复的试剂。
24.本发明第八方面提供一种构建体。在本发明的一些实施方案中，包含第一方面所述的核酸或第三方面所述的可检测的基因突变。
25.本发明第九方面提供一种重组细胞。在本发明的一些实施方案中，所述重组细胞是通过第八方面所述的构建体转化受体细胞获得的。
26.本发明的重组细胞，能够有效地用作先天性无虹膜症，尤其是常染体显性先天性无虹膜症的相关研究的模型。
27.本发明第十方面提供一种检测先天性无虹膜症的试剂盒。在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒中包括检测第一方面所述的核酸的试剂，和/或检测第二方面所述的多肽的试剂，和/或检测第三方面所述的可检测的基因突变的试剂。
28.前面所述的核酸、多肽、基因突变与先天性无虹膜症的发病密切相关，因此，包含能有效地检测前面所述的核酸或前面所述的基因突变或前面所述的多肽的试剂的试剂盒能有效筛选出患先天性无虹膜症，尤其是常染体显性先天性无虹膜症的生物样品。
29.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变
得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
30.本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：图1显示了先证者的裂隙灯前节照片和前节oct检查结果，其中，a图和b图展示了先证者的裂隙灯前节照片，a图中白箭头表示晶状体赤道，黑箭头表示成熟白内障；b图中白箭头表示周边至中周边角膜结膜化，血管向内生长，黑箭头显示整个角膜存在增厚的不透明区域，c图和d图显示了先证者的前节oct检查结果，od代表右眼，os代表左眼；图2显示了无虹膜家族先证者的眼底特征，a图显示了先证者的眼底照片，黑箭头显示黄斑区的结构，b图显示了先证者的黄斑oct检查，白箭头表示黄斑中央凹的结构；图3a显示了中国无虹膜病家系pax6移码突变c.314dela（p.k105sfs*33）的鉴定家谱，正方形表示男性，圆圈表示女性，空符号和填充符号分别代表正常个体和受影响个体，wt：野生型，mt：突变，图3b为序列谱图，显示了野生型和实施例3中鉴定的pax6 c.314dela（p.k105sfs*33）突变，箭头表示突变的位置，显示的是sanger测序反向测序验证。
具体实施方式
31.下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
32.需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
33.在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
34.为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义，否则本文中使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
35.在本文中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其它方面的内容。
36.在本文中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。
37.ptc是pax6中最常见的突变，导致出现空等位基因。pax6中的ptc突变与严重虹膜发育不全和最严重和最早发病的ark有关，而错义突变与影响较小的虹膜和较轻的非进展性ark有关。发明人利用一个先天性无虹膜家系成员接受了详细的临床评估，包括最佳矫正
视力、裂隙灯检查、压平眼压测量和眼底镜检查。还进行了眼底照相、光学相干断层扫描对角膜及黄斑进行了检查。在家系成员外周血中提取基因组dna，利用高通量测序技术检测遗传性视网膜疾病相关基因。家系的先证者中发现一个新的pax6基因的移码突变c.314dela（p.k105sfs*33）；chr11:31823193-31823194，导致pax6蛋白发生移码突变，第105号氨基酸由赖氨酸突变为丝氨酸并产生新的阅读框架，终止于第105号密码子下游33号密码子处。这种突变导致编码氨基酸过早终止，最终导致pax6单倍体剂量不足。其父母和未出现先天性无虹膜表现，并且未检测到异常突变。
38.发明人在一个先天性无虹膜症的中国家系中发现了一个新的pax6基因缺失，pax6 c.314dela（p.k105sfs*33）；chr11:31823193-31823194是常染体显性先天性无虹膜的新的致病突变。该发现扩大了pax6基因的突变谱，有助于先天性无虹膜疾病的遗传诊断。对理解pax6突变引起的先天性无虹膜疾病的发病机制有很大帮助。
39.本文中，术语“先天性无虹膜症”在本领域也常被称为“先天性虹膜缺损”或“先天性无虹膜”，其是一种全眼疾病，影响双侧的虹膜、角膜、晶状体、中心凹和视神经的形成，其明显特征是虹膜完全或部分发育不全，伴有眼球震颤和中心凹发育不全，是出生后视力下降的主要原因。而迟发性白内障、无虹膜相关角膜病变（ark）和青光眼会导致进一步的视力丧失。
40.术语“常染体显性先天性无虹膜症”是指无虹膜症是发生在常染体上的显性等位基因所控制的，只需要两个等位基因中的至少一个具有患病突变，该患者就表现为患病。
41.而且，需要说明的是，本文中所提供的pax6基因上的突变位点，可以用来作为先天性无虹膜症，更具体地说是常染体显性先天性无虹膜症的标示；或者这些突变位点的出现用来说明生物样品患有先天性无虹膜症，更具体地说是患有常染体显性先天性无虹膜症。这并不意味着“先天性无虹膜症”、“常染体显性先天性无虹膜症”是作为pax6基因上该突变位点的一种限制。也就是说，如果要对pax6基因上的该突变位点所表征的疾病进行详细地指示或者说明时，可以知悉其可以说明该生物样品是患有先天性无虹膜症，更具体地说是常染体显性先天性无虹膜症；但是也完全可以根据具体目的或者针对对象不同，被直接告知患有先天性无虹膜症。
42.本文中，野生型pax6基因的dna序列（例如包括内含子序列、外显子序列等）、rna序列、所编码的蛋白信息等有关该野生型pax6基因的信息均在ncbi数据库中有收录。本文中所示出的c.314dela突变是以ncbi数据库中野生型pax6基因（nm_001604）的序列为参考而确定的。
43.本文中，所示出的c.314dela突变是指与野生型pax6基因的核酸序列相比，第314位发生a的缺失，导致发生pax6移码突变c.314dela（p.k105sfs*33），提前终止密码子（ptc）进入pax6开放阅读框，获得了相比于野生型的pax6蛋白的多肽序列更短的新的多肽序列。
44.需要说明的是，上述给出的突变位点以及序列等，均是以收录于ncbi数据库中的内容作为参考，本领域技术人员应该理解的是，由于数据库的更新或者数据库的不同，所示出的突变位点以及序列可能会稍有不同或者变化，这些不同或者变化均可以给出的该数据库中的内容为标准到，这些不同或者变化也均包含在本发明的保护范围之内。
45.而且，本领域技术人员能够理解的是，本文中所使用的野生型pax6基因序列位置
是以人类基因组中野生型pax6基因的序列为准，但当该野生型pax6基因存在于其它物种时，该序列可能会有所差异，可以将该物种的野生型pax6基因与人类基因组中野生型pax6基因进行比对，获得该物种的野生型pax6基因中所对应的位置。
46.核酸在本发明的一方面，本发明提出了一种核酸。根据本发明的实施例，与野生型pax6基因相比，所述核酸具有c.314dela突变。发明人首次发现pax6基因的c.314dela突变，chr11:31823193-31823194，导致pax6蛋白发生移码突变，第105号氨基酸由赖氨酸突变为丝氨酸并产生新的阅读框架，终止于第105号密码子下游33号密码子处。这种突变导致编码氨基酸的过早终止，最终导致pax6单倍体剂量不足。c.314dela突变与先天性无虹膜症的发病密切相关，从而可以通过检测上述基因突变在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品源自的个体是否患先天性无虹膜症。
47.对于本发明说明书和权利要求书中，提及核酸，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。例如，提及pax6基因的序列，实际包括其互补序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然。
48.需要说明的是，野生型pax6基因的编码序列可以从ncbi上获得。
49.本文中所提到的c.314dela突变是以ncbi数据库中所对应的pax6基因编码序列进行定位的。
50.多肽在本发明另一方面，本发明提出了一种多肽。根据本发明的实施例，所述多肽由上述核酸表达而成。如前所述，pax6基因的c.314dela突变，导致pax6蛋白发生移码突变，第105号氨基酸由赖氨酸突变为丝氨酸并产生新的阅读框架，终止于第105号密码子下游33号密码子处。这种突变导致编码氨基酸的过早终止，最终导致pax6单倍体剂量不足。而pax6蛋白与先天性无虹膜症的发病密切相关，进而通过检测上述多肽在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品源自的个体是否患先天性无虹膜症。
51.基因突变在本发明的另一个方面，本发明提出了一种基因突变。根据本发明的实施例，与野生型pax6基因相比，所述基因突变具有c.314dela突变。c.314dela突变与先天性无虹膜症的发病密切相关，从而可以通过检测上述基因突变在生物样品中是否发生，可以有效地检测生物样品源自的个体是否患先天性无虹膜症。
52.基因突变通常指基因在结构上发生碱基对组成或者排列顺序的改变。本文中，基因突变是指发生在pax6基因上的缺失突变。该基因突变是可以被检测的或者说是可以被辨别的，其可以作为pax6基因上的一个突变位点被检测或者辨别，也可以被作为pax6基因的部分核酸或者pax6基因的全部核酸被检测或者辨别。
53.检测前面所述的核酸、基因突变、多肽的试剂在制备试剂盒或设备中的用途在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述的基因突变或前面所述的核酸或前面所述的多肽的试剂在制备试剂盒或者设备中的用途。根据本发明的实施例，所述试剂盒或者设备用于诊断先天性无虹膜症。如前所述，前面所述的核酸、基因突变、多肽与先天性
无虹膜症的发病密切相关，进而检测前面所述的核酸或前面所述的基因突变或前面所述的多肽的试剂用于制备试剂盒或者设备，所得到的试剂盒或者设备能有效筛选出患先天性无虹膜症，尤其是常染体显性先天性无虹膜症的生物样品。
54.根据本发明的实施例，所述试剂包括特异性针对所述核酸、所述基因突变和所述多肽的至少之一的抗体、探针、引物以及质谱检测试剂的至少之一。例如，发明人可通过特异性识别所述多肽的抗体与所述多肽的特异性结合来检测待测样品中是否存在上述突变，即通过特异性抗体与抗原的相互作用来检测上述多肽是否存在；发明人还可以通过预先设计特异性识别所述核酸或基因突变的探针，通过探针与上述核酸或基因突变位点所在的核酸片段发生互补配对，来鉴别上述核酸或基因突变的存在；发明人还可以设计用于扩增上述基因突变所在外显子的特异性引物，进而通过基因扩增以及测序，确定上述基因突变是否存在；发明人还可以通过质谱来检测多肽的m/z来判断，上述发生c.314dela突变所表达的多肽是否存在。根据本发明的具体实施例的抗体、探针、引物以及质谱检测试剂的至少之一能特异性、高灵敏性地筛选出前面所述的核酸或者前面所述的基因突变或者前面所述的多肽，进而特异性、高灵敏性地筛选出患先天性无虹膜症，尤其是患常染体显性先天性无虹膜症的生物样品，进而能有效用于制备筛选患先天性无虹膜症，尤其是患常染体显性先天性无虹膜症的生物样品的试剂盒或者设备。
55.生物模型在本发明的另一方面，本发明提出了生物模型在筛选药物中的用途。根据本发明的实施例，所述生物模型携带下列至少之一：（1）前面所述的核酸；（2）表达前面所述的多肽；（3）前面所述的基因突变。根据本发明的实施例的生物模型能有效地用作先天性无虹膜症，尤其是常染体显性先天性无虹膜症的相关研究的模型。这些生物模型可以是细胞模型也可以是动物模型。
56.试剂在制备药物中的用途在本发明的又一方面，本发明提出了特异性改变前面所述的核酸或者前面所述的基因突变的试剂在制备药物中的用途，所述药物用于先天性无虹膜症。需要说明的是，这里的特异性改变是指能使得突变的核酸或者基因突变的位点恢复到原来的野生状态或者其它不具有致病性的状态，而对于个体基因组的其它序列不产生实质影响。如前所述，前面所述的核酸或者前面所述的基因突变与先天性无虹膜症的发病密切相关，由此，由这些能够特异性改变前面所述的核酸或者前面所述的基因突变的试剂所制备的药物能有效用于先天性无虹膜症。
57.根据本发明的实施例，所述试剂为基于同源重组修复、碱基的直接插入修复、talen、zfn至少之一的试剂。例如，通过同源重组方式，在pax6基因的c.314dela突变位点处插入a，从而回复为野生型状态，或者通过碱基的直接插入来修复缺失的碱基。
58.先天性无虹膜症的药物在本发明的另一个方面，本发明提出了一种用于先天性无虹膜症的药物。根据本发明的实施例，所述药物含有：特异性改变前面所述的核酸或者前面所述的基因突变的试剂。需要说明的是，这里的特异性改变是指能使得突变的核酸或者基因突变的位点恢复到原来的野生状态或者其它不具有致病性的状态，而对于个体基因组的其它序列不产生实质影响。如前所述，前面所述的核酸或者前面所述的基因突变与先天性无虹膜症的发病
密切相关，由此，包含特异性改变前面所述的核酸或者前面所述的基因突变的试剂的药物能有效用于先天性无虹膜症。
59.根据本发明的实施例，所述试剂为基于同源重组修复、碱基的直接插入修复、talen、zfn至少之一的试剂。例如，通过同源重组方式，在pax6基因的c.314dela突变位点处插入a，从而回复为野生型状态，或者通过碱基的直接插入来修复缺失的碱基。
60.构建体及重组细胞在本发明的又一个方面，本发明提出了一种构建体。根据本发明的实施例，所述构建体包含前面所述的核酸或前面所述的基因突变。
61.需要说明的是，“构建体包含前面所述的核酸”表示，本发明的构建体与野生型pax6基因相比，其包含c.314dela突变；“构建体包含前面所述的基因突变”表示，本发明的构建体与野生型pax6基因相比具有c.314dela突变；由此，根据本发明实施例的构建体转化受体细胞获得的重组细胞，能够有效地用作先天性无虹膜症，尤其是常染体显性先天性无虹膜症的相关研究的模型。其中，所述受体细胞的种类不受特别限制，例如可以为大肠杆菌细胞、哺乳动物细胞，优选该受体细胞来源于哺乳动物。
62.在本发明中所使用的术语“构建体”是指这样的一种遗传载体，其包含特定核酸序列，并且能够将目的核酸序列转入宿主细胞中，以获得重组细胞。根据本发明的实施例，构建体的形式不受特别限制。根据本发明的实施例，其可以为质粒、噬菌体、人工染体、粘粒（cosmid）、病毒的至少一种，优选质粒。质粒作为遗传载体，具有操作简单，可以携带较大片段的性质，便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制，既可以是环形质粒，也可以是线性质粒，即可以是单链的，也可以是双链的。本领域技术人员可以根据需要进行选择。在本发明中所使用的术语“核酸”可以是任何包含脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的dna、rna，其长度不受任何特别限制。对于用于构建重组细胞的构建体，优选所述核酸为dna，因为dna相对于rna而言，其更稳定，并且易于操作。
63.在本发明的再一个方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞是通过前面所述的构建体转化受体细胞而获得的。根据本发明的一些实施例，本发明的重组细胞，能够有效地用作先天性无虹膜症，尤其是常染体显性先天性无虹膜症的相关研究的模型。
64.根据本发明的实施例，受体细胞的种类不受特别限制，例如可以为大肠杆菌细胞、哺乳动物细胞，优选所述受体细胞来源于非人哺乳动物。
65.检测先天性无虹膜症的试剂盒在本发明的另一个方面，本发明提出了一种检测先天性无虹膜症的试剂盒。
66.根据本发明的实施例，所述试剂盒中包括检测前面所述的核酸的试剂，和/或检测前面所述的基因突变的试剂，和/或检测前面所述的多肽的试剂。如前所述，前面所述的核酸、基因突变、多肽与先天性无虹膜症的发病密切相关，因此，包含能有效地检测前面所述的核酸或前面所述的基因突变或前面所述多肽的试剂的试剂盒能有效筛选出患先天性无虹膜症，尤其是常染体显性先天性无虹膜症的生物样品。
67.在本发明中，发明人发现一个与pax6基因突变相关的先天性无虹膜家系，其先证者具有典型的先天性无虹膜疾病的表型，包括：眼球震颤、视力低下、角膜混浊、中心凹发育
不良等。其父母和均正常，无眼部异常及全身异常。
68.无虹膜是一种影响双侧虹膜、角膜、晶状体、黄斑中心凹和视神经的全眼疾病。发病率为1:40000-100000，具有完全外显率和可变表达率（moosajee, m.; hingorani, m.; moore, a.t. pax6-related aniridia. in genereviews((r)); adam, m.p.,ardinger, h.h., pagon, r.a., wallace, s.e., bean, l.j.h., stephens, k., amemiya, a., eds.; university of washington: seattle, dc, usa, 2018; yokoi, t.; nishina, s.; fukami, m.; ogata, t.; hosono, k.; hotta, y.; azuma, n. genotype-phenotype correlation of pax6 gene mutations in aniridia. hum. genome var. 2016, 3, 15052 ; dubey, s.k.; mahalaxmi, n.; vijayalakshmi, p.; sundaresan, p. mutational analysis and genotype-phenotype correlations in southern indian patients with sporadic and familial aniridia. mol. vis. 2015, 21, 88
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97)。最明显的眼部特征是完全或部分虹膜发育不全，伴有眼球震颤、白内障、无虹膜相关角膜病（ark）、青光眼、视盘发育不全和中央凹发育不全（lima cunha d, arno g, corton m, moosajee m. the spectrum of pax6 mutations and genotype-phenotype correlations in the eye. genes (basel) 2019, 10(12). https://doi.org/10.3390/genes10121050; wang p, sun w, li s, xiao x, guo x, zhang q. pax6 mutations identified in 4 of 35 families with microcornea. invest ophthalmol vis sci. 2012;53(10):6338
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42; lagali n, wowra b, fries fn, latta l, moslemani k, utheim tp, wylegala e,seitz b, kasmann-kellner b. pax6 mutational status determines aniridia associated keratopathy phenotype. ophthalmology. 2020;127(2):273
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5）。无虹膜患者可以表现出广泛的表型谱，基因型和表型之间没有明显的相关性(moosajee, m.; hingorani, m.; moore, a.t. pax6-related aniridia. in genereviews((r)); adam, m.p .,ardinger, h.h., pagon, r.a., wallace, s.e., bean, l.j.h., stephens, k., amemiya, a., eds.; university of washington: seattle, dc, usa, 2018.)，即使来自具有相同pax6突变家族的成员出现不同程度的虹膜受累，其范围从几乎正常的虹膜到无虹膜，并伴有不同程度的中央凹发育不全(pedersen, h.r.; hagen, l.a.; landsend, e.c.s.; gilson, s.j.; utheim, o.a.; utheim, t.p .; neitz, m.; baraas, r.c.color vision in aniridia. investig. ophthalmol. vis. sci. 2018, 59, 2142
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2152; pedersen, h.r.; neitz, m.; gilson, s.j.; landsend, e.c.s.; utheim, o.a.; utheim, t.p .; baraas, r.c. the cone photoreceptor mosaic in aniridia: within-family phenotype-genotype discordance. ophthalmol. retin.2019, 3, 523
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534.)。在本发明中，发明人利用靶向外显子测序（tes）研究了一个中国无虹膜家族的遗传异常，并在pax6基因中鉴定了1个新的ptc突变。结合国内外文献及发明人的研究发现，几乎所有pax6基因突变的患者都有临床表型，如：低视力、虹膜缺失、黄斑中心凹发育不良，其中部分患者有上睑下垂、眼球震颤、白内障、ark、青光眼、黄斑中央凹发育不良。即使来自具有相同突变的同一家族的患者也可以具有不同的表型。然后鉴定这些有义突变，并将其与疾病表型共同分离。
69.在pax6中观察到的最常见的基因内突变是无义突变（39%），其次是移码突变（27%）、错义突变（12%）、剪接位点突变（15%）、小指数突变（2%）和c端延伸（或运行子突变）
（2%）(moosajee, m.; hingorani, m.; moore, a.t. pax6-related aniridia. in genereviews((r)); adam, m.p .,ardinger, h.h., pagon, r.a., wallace, s.e., bean, l.j.h., stephens, k., amemiya, a., eds.; university of washington: seattle, dc, usa, 2018; tzoulaki, i.; white, i.m.; hanson, i.m. pax6 mutations: genotype-phenotype correlations. bmc genet. 2005,6, 27)。约85%的无虹膜病例是由基因内ptc引起的突变、全基因缺失或调节区失活引起的pax6单倍体不足。在本发明中，pax6移码突变c.314dela（p.k105sfs*33）诱导提前终止密码子（ptc）进入pax6开放阅读框，含ptc的mrna通过无义介导的衰变过程降级，导致单倍体缺乏。此外，包含pax6和wt1基因座的11p区域的染体重排或小缺失会导致wagr综合征（肾母细胞瘤、无虹膜、泌尿生殖系统异常和智力低下）。大约30%的散发性无虹膜患者患有该综合征，诊断出的儿童有50%至70%的风险发展为肾母细胞瘤并累及肾脏(fischbach, b.v .; trout, k.l.; lewis, j.; luis, c.a.; sika, m. wagr syndrome: a clinical review of 54 cases.pediatrics 2005, 116, 984
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988)。
70.不同pax6病例中虹膜发育不良的严重程度也不相同，晶状体异常也分为不同程度和类型的白内障和晶状体异位(lagali n, wowra b, fries fn, latta l, moslemani k, utheim tp, wylegala e,seitz b, kasmann-kellner b. pax6 mutational status determines aniridia associated keratopathy phenotype. ophthalmology. 2020;127(2):273
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5)。角膜病变在无虹膜患者中很常见，因为pax6基因负责角膜的胚胎发育和出生后发育。pax6水平降低可能导致角膜上皮细胞不完全分化(ramaesh t , ramaesh k , martin collinson j , chanas sa ,dhillon b , w e s t jd . developmental and cellular factors underlying corneal epithelial dysgenesis in the pax6 + /
‑ꢀ
mouse model of aniridia. exp eye res. 2005;81(2):224
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35)。缺乏pax6也可将角膜缘干细胞转化为皮肤样上皮(ouyang h ,xue y ,lin y ,et al.wnt7a and pax6 define corneal epithelium homeostasis and pathogenesis. nature. 2014;511(7509):358
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61)。有实验表明，pax6单倍体不足（pax6+/-）被诱导，证明角膜上皮细胞之间的异常粘附，包括桥粒结构的变化和细胞之间的较大间隙(davis j ,duncan mk ,robison wg, jr ,piatigorsky j . requirement for pax6 in corneal morphogenesis: a role in adhesion. j cell sci. 2003;116(pt 11):2157
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67)。在先天性无虹膜的角膜病变（ark）的发展过程中，角膜最初是透明的，角膜缘完整，随后中央角膜厚度增加，基底上皮混浊，角膜敏感性降低。角膜从边缘到顶点逐渐变为不透明（lagali n, wowra b, fries fn, latta l, moslemani k, utheim tp, wylegala e, seitz b, kasmann-kellner b. pax6 mutational status determines aniridiaassociated keratopathy phenotype. ophthalmology. 2020;127(2):273
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5）。在该家族中，先证者的右眼角膜保持透明，但中央角膜厚度增加，左眼角膜带状变性，中央角膜厚度增加，角膜缘血管性血管翳表明存在早期ark(lagali n, wowra b, fries fn, latta l, moslemani k, utheim tp, wylegala e, seitz b, kasmann-kellner b. pax6 mutational status determines aniridiaassociated keratopathy phenotype. ophthalmology. 2020;127(2):273
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5)。无虹膜青光眼通常发生在成年早期，包括婴幼儿。
71.人类pax6基因于1991年被克隆，并且从脊椎动物和无脊椎动物中分离出来。它由
14个外显子组成，编码具有配对型dna结合结构域的转录调控子。它具有两个不同的dna结合亚结构域，n末端亚结构域（nts）和c末端亚结构（cts），在配对结构域中，其结合相应的dna序列以识别目标基因。人类pax6基因产生2种交替剪接的亚型，其具有配对结构域(glaser t, walton ds, maas rl. genomic structure, evolutionary conservation and aniridia mutations in the human pax6 gene. nat genet. 1992;2(3):232
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9)的独特结构。在人类pax6数据库中报告了约500个突变（ouyang h ,xue y ,lin y ,et al.wnt7a and pax6 define corneal epithelium homeostasis and pathogenesis. nature. 2014;511(7509):358
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61）。值得注意的是，在“关键区域”内的一个非编码元件中的变化，其它顺式调节元件也可能导致无虹膜(bhatia s, bengani h, fish m, brown a, divizia mt, de marco r, damante g, grainger r, van heyningen v, kleinjan da. disruption of autoregulatory feedback by a mutation in a remote, ultraconserved pax6 enhancer causes aniridia. am j hum genet. 2013;93(6):1126
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34)。在一些pax6基因突变检测为阴性的无虹膜患者中发现了pax6全基因缺失和端粒顺式调节元件缺失。因此，建议将pax6全基因直接测序与分子检测拷贝数改变（cnv）的方法例如高分辨率比较杂交（hr-cgh）阵列、荧光原位杂交（fish）等，和多重连接依赖性探针扩增（mlpa）推广应用，对于提高与pax6基因变异相关的先天性无虹膜患者的检测率非常重要，会更适用于那些基因筛查结果为阴性的无虹膜病例（ansari m, rainger j, hanson im, williamson ka, sharkey f, harewood l, sandilands a, clayton-smith j, dollfus h, bitoun p, et al. genetic analysis of
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pax6-negative
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individuals with aniridia or gillespie syndrome. plos one. 2016;11(4):e0153757）。目前的研究认为，在散发的和伴有综合征的患者中可能存在更大的基因异质性。因此，改进检测方法有助于提高无虹膜病致病基因的检出率。
72.简而言之，一个新的pax6基因中的移码突变c.314dela（p.k105sfs*33）在一个先天性无虹膜的中国家系中被鉴定，这可能导致pax6单倍体不足。与该突变相关的表型包括无虹膜，ark、青光眼、白内障和中央凹发育不全。本发明扩大了pax6基因的突变谱，有助于先天性无虹膜疾病的遗传诊断。
73.下面将结合实施例对本公开的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本公开，而不应视为限定本公开的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
74.实施例1临床资料本研究由中国人民解放军总医院伦理委员会（中国北京）批准。一个独立先证者在中国人民解放军总医院海南医院（中国海南省三亚市），被诊断为先天性无虹膜，该先证者以及家系成员均签署了知情同意书。
75.本研究中评估的家庭来自中国南方。先证者以视力下降为首发症状。在这个家系中，先证者是一名8岁的男性，自幼双眼低视力伴畏光，bcva右眼为0.02，左眼为hm/10cm。眼科检查显示双眼水平眼球震颤，双眼角膜缘血管扩张、充血，右眼角膜透明、虹膜完全缺损、晶体混浊半脱位，眼底视网膜360度脱离呈宽漏斗状；左眼角膜带状变性，眼底窥不清（图1中a、b图所示）。眼压：右眼：6mmhg，左眼：42mmhg。右眼行玻璃体切除、视网膜复位、视网膜光
凝、硅油填充术后1月，见右眼底视盘界清，淡红，c/d约0.3，视网膜复位好，视网膜血管走行可，黄斑区未见中心凹反光。oct提示：左眼角膜增厚、右眼黄斑区无中心凹结构（图1中c、d图以及图2所示）。先证者的父母和妹没有明显的眼部异常及全身疾病。
76.实施例2 样本测序和致病突变筛选收集家系的遗传资料和临床资料。绘制家系图，对家系中的患者和正常成员进行眼科检查，使用国际标准视力表检查视力，sl-2g裂隙灯（日本东京topcon公司）拍摄眼前节照片，sd-oct检查使用rtvue xr oct设备（美国加利福尼亚州弗里蒙特市optovueinc）进行，使用trc-50dx（ia型）视网膜照相机（日本东京topcon公司）进行眼底检查和拍照，faf和ffa使用spectralis hra血管造影仪（德国海德堡海德堡工程gmbg）检查，根据国际临床视觉电生理学会（iscev，www.iscev.org）的标准，使用reti port/scan 21装置（德国勃兰登堡-德哈维尔罗兰）进行erg和eog测试。全身检查包括血液检查、尿检、心电图、胸片、血液生化、血脂和凝血试验，以排除其它系统性疾病。
77.根据《赫尔辛基宣言》关于人类受试者研究的指南，采集所有参与者的外周血样本，同时提取基因组dna用于pax6突变筛查。先证者及其家人通过直接dna测序进行pax6基因突变鉴定。使用gencap捕获试剂盒（mygenotics gencap enrichment technologies；mygenotics，inc.，中国北京）捕获扩增dna。通过聚合酶链反应（pcr）从基因组dna中扩增pax6的所有编码外显子。通过primer3程序设计用于扩增的引物。特异性遗传性眼睛的目标富集小组收集了371个目标基因的蛋白质编码区（由马里兰州巴尔的摩mygenetics设计），用于下一代测序，其中包括37个与虹膜疾病相关的基因（pax6、elp4、foxd3、pitx3、foxe3、pitx2、adamts10、fbn1、ltbp2、adamts17、mthfr、tyr、mitf、pax3、snai2、sox10、rbp4、chd7、tmem67、rpgrip1l、cc2d2a、yap1、maf、c12orf57、foxc1、b3glct、nf1、gpr143、oca2、tyrp1、crygc、adamsl4、sall2、igbp1、cyp1b1、myoc、sall1）。一些虹膜异常疾病，如无虹膜、wagr综合征、axenfeld-rieger综合征与这些基因相关。特异性高通量测序采用相同的程序。
78.根据制造商的协议，进行了捕获实验。简言之，将1μg dna文库与缓冲液bl和gencap基因板探针（mygenotics，中国北京）混合，在pcr机上在95℃加热7分钟和65℃加热2分钟；然后将23μl 65
°
c预热缓冲液hy（mygenostics inc，中国北京）添加到混合物中，并将混合物在65
°
c下保持，pcr盖子加热22小时以进行杂交。50μl肌酮珠粒（life technology）在500μl 1x结合缓冲液中洗涤3次，然后再悬浮在80μl 1x缓冲液中。向混合混合物中添加64μl 2x缓冲液，并用80μl肌酮珠转移到试管中。混合物在旋转器上旋转1小时。然后在室温下用wb1缓冲液清洗珠子15分钟一次，在65
°
c下用wb3缓冲液清洗珠子15分钟三次（wb1缓冲液和wb3缓冲液源自康为世纪）。然后用缓冲液洗脱结合的dna。最终使用以下程序将洗脱的dna扩增15个周期：98℃ 30秒（1个周期）；98
°
c持续25秒，65
°
c持续30秒，72
°
c持续30秒（15个循环）；72
°
c持续5分钟（1个循环）。根据制造商的方案，使用spri珠（beckman coulter）纯化pcr产物。富集文库在illumina hiseq x ten测序仪上测序，成对读取150bp。
79.进行测序后，原始数据以fastq格式保存（英国剑桥威康信托桑格研究所），使用cutadapt (http://cutadapt.readthedocs.io/en/stabl美国马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院）筛除illumina测序适配器和低质量读数（《80 bp），进行质量控制。使用burrows
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wheeler（bwa；http://bio-bwa.sourceforge.net)软件包（wellcome trust sanger institute）检测变异。使用picard (http://broadinstitute.github.io/picard麻省理工
学院，剑桥，马萨诸塞州，美国）删除重复读取序列。使用gatk haplotype caller (https://software.broadinstitute.org/gatk；美国马萨诸塞州剑桥市布罗德研究所）检测单核苷酸多态性（snps）的变异以及插入和缺失。使用基因组分析工具包（gatk；broad institute）进行变异筛选。然后将数据结果转换为变异调用格式，并用注释变异对变异进行注释（美国费城儿童医院应用基因组学中http://annovar.openbioinformatics.org/en/latest)，在多个数据库中搜索变异，如1000基因组（1000基因组项目联盟），esp6500（国家心脏、肺和血液研究所exome测序项目，华盛顿大学，西雅图，瓦城，美国），bsnp（国家生物技术信息中心，贝塞斯达，md，美国），exome聚集联盟（blued institute），innhore（mygenostics，inc.）和人类基因突变数据库（医学遗传学研究所，威尔士）。利用基因组进化速率谱（gerphttp://mendel.stanford.edu/sidowlab/downloads/gerp/)，罕见的外显子组变体组合学习（revel，https://sites.google.com/site/revelgenomics/)，区分不容忍与容忍突变（筛选，https://sift.bii.a-star.edu.sg；新加坡生物信息学研究所，新加坡共和国），polyph-2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2哈佛大学、剑桥、美国、马萨诸塞州）和突变计划（www. mututhastest.org；查理埃特-柏林医科大学，柏林，德国）预测突变的危害性。
80.根据以下原则筛选潜在的致病突变：（1）突变读数不应小于5，突变率》30%；（2）在1000个基因组、esp6500和内部数据库中，突变频率不超过5%；（3）该突变不存在于innormal数据库（mygenotics，inc.）中；（4）突变不是同义的。致病性突变是根据美国医学遗传学和基因组学学院的标准和指南确定的。
81.实施例3 突变鉴定经过实施例2中的致病突变筛选过程，在家系中的先证者的pax6基因外显子7中发现了移码突变，c.314dela（p.k105sfs*33），chr11:31823193-31823194，导致pax6蛋白发生移码突变，第105号氨基酸由赖氨酸突变为丝氨酸并产生新的阅读框架，终止于第105号密码子下游33号密码子处。这种突变导致编码氨基酸的过早终止，最终导致pax6单倍体剂量不足。其父母和未检测到异常突变。这个突变在之前提到的数据库或报告的文献中都不存在，并通过sanger测序验证，并检测其它家族成员，这些杂合突变与相应家族中的无虹膜表型共分离。受影响的个体携带突变，而未受影响的成员没有（图3a，图3b）。这些结果表明，pax6 c.314dela（p.k105sfs*33），chr11:31823193-31823194是常染体显性先天性无虹膜的新的致病突变。
82.在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、“一些实施方案”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
83.尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
技术特征：
1.一种核酸，其特征在于，与野生型pax6基因相比，所述核酸具有c.314dela突变。2.一种多肽，其特征在于，所述多肽由权利要求1所述的核酸表达而成。3.一种可检测的基因突变，其特征在于，与野生型pax6基因相比，具有c.314dela突变。4.检测权利要求1所述的核酸或权利要求2所述的多肽或权利要求3所述的可检测的基因突变的试剂在制备试剂盒或者设备中的用途，其特征在于，所述试剂盒或者设备用于诊断先天性无虹膜症，所述试剂包括特异性针对所述核酸、所述多肽、所述基因突变中至少之一的探针、引物、抗体以及质谱检测试剂的至少之一。5.生物模型在筛选药物中的用途，其特征在于，所述生物模型携带下列至少之一：（1）权利要求1所述的核酸；（2）表达权利要求2所述的多肽；（3）权利要求3所述的可检测的基因突变；其中，所述生物模型为细胞模型或者动物模型。6.特异性改变权利要求1所述的核酸或者权利要求3所述的可检测的基因突变的试剂在制备药物中的用途，其特征在于，所述药物用于先天性无虹膜症，所述先天性无虹膜症为常染体显性先天性无虹膜症。7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述试剂为基于同源重组修复、碱基的直接插入修复、talen、zfn中至少之一进行缺失修复的试剂。8.一种用于先天性无虹膜症的药物，其特征在于，所述药物含有：特异性改变权利要求1所述的核酸或者权利要求3所述的可检测的基因突变的试剂，所述先天性无虹膜症为常染体显性先天性无虹膜症。9.根据权利要求8所述的用于先天性无虹膜症的药物，其特征在于，所述试剂为基于同源重组修复、碱基的直接插入修复、talen、zfn中至少之一进行缺失修复的试剂。10.一种构建体，其特征在于，包含权利要求1所述的核酸或权利要求3所述的可检测的基因突变。11.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是通过权利要求10所述的构建体转化受体细胞获得的。12.一种检测先天性无虹膜症的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括检测权利要求1所述的核酸的试剂，和/或检测权利要求2所述的多肽的试剂，和/或检测权利要求3所述的可检测的基因突变的试剂。
技术总结
本发明涉及生物领域，具体涉及PAX6基因突变体及其应用。本发明提供了一种先天性无虹膜症相关的基因突变体及其应用，所提供的基因突变与野生型PAX6基因相比，具有c.314delA突变。该基因突变是先天性无虹膜症的新的相关的致病突变，通过检测该突变在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品源自的个体是否患先天性无虹膜症。该基因突变扩大了PAX6基因的突变谱，为该疾病的诊断和提供了新的检测位点，以及新的检测方法和途径。以及新的检测方法和途径。以及新的检测方法和途径。
