一种香水莲花中花苷的提取纯化方法与流程
1.本发明涉及植物天然素活性成分提取技术领域，具体为一种香水莲花中花苷的提取纯化方法。
背景技术：
2.随着现代医学的发展，大多数合成素被证明有不同程度的毒性而对人体有害，甚至有致癌、致畸作用。与合成素相比，天然素多来自动物、植物组织，一般来说对人体的安全性较高，其中不少品种兼有营养和药理作用。因此，天然素更受人们欢迎且发展的前景更大。与此同时，天然素能更好地模仿天然物的颜，着时的调也更自然，
3.天然素按结构可分为异戊二烯类、卟啉类、类黄酮类和含氮杂环类等，植物素是通过植物体内的一系列生物合成产生的，主要有类黄酮类、类胡萝卜素、卟啉类、含氮杂环类等,具有不同的化学性质。它们分布在植物体的各个部分(萼片、花瓣、花粉等),并在植物体内起到了一些重要的作用，比如光合作用、向外界传递信号、对天敌的防御以及与外界的热交换等。
4.花青素是人们日常饮食中摄入量最高的酚类化合物，通常被糖基化修饰后形成花苷。花苷(anthocyanins)为自然界中水溶性的可食用植物素，广泛分布于深的蔬菜、浆果和谷物中，人们通过混合膳食每天可以摄入数十毫克的花苷。食物中含量最为丰富的6类花青素是矢车菊素(cyanidin)、天竺葵素(pelargonidin)、飞燕草素(delphindin)、芍药素(peonidin)、牵牛花素(petunidin)和锦葵素(malvidin)。花苷具有抗氧化、抗炎、抗癌、缓解脂肪肝、预防糖尿病和神经保护作用等多种生理功能。此外，花苷还具有促进视紫红质再生、改善视网膜毛细血管微循环、提高夜视力等作用。花苷的健康功效在食品和医药领域受到越来越多的关注，其作为着剂在食品加工中具有极大的应用潜力，研究花苷的生物活性及其作用机理对指导合理膳食和开发健康功能食品具有重要意义。
5.香水莲花(nymphaea hybrida peck)是睡莲科水生宿根植物，包括金、黄、紫、蓝、赤(中国红)、茶、绿、红(洋红)、白九大系，故俗称“九品香水莲花”或“九品莲花”等。香水莲花中不仅有碳水化合物、蛋白质等常规营养成分，还富含黄酮、多酚和多糖类化合物，目前已有以成花为原料制成的香水莲花茶、香水莲花酒和香水莲花汤等功能食品还有以提取物为原料制成的香水莲花精油、纯露、面膜等化妆品上市销售。
6.天然素的提取纯化工艺多种多样，主要包括水提法、有机溶剂浸取法、微波及超声波提取法、酶处理法、膜处理、超临界萃取法等。水提法对于水溶性素提取效果较好、无毒性且成本较低，但对于一些脂溶性素及一些多萜烯类素提取效果较差；有机溶剂浸提法可浸提水溶性较差甚至脂溶性素及多萜烯类素，成本较低，但单纯使用有机溶剂提取法提取不彻底，酶法制备花苷，有一定的成果，但是酶具有单一性，且单一的酶制剂并不能有效的分解植物组织释放花苷，不同的植物组织构成不同，所需的酶的组成和种类也会有所差异。超临界萃取法特别适合脂溶性成分，对于水溶性花苷效果不佳，一次性
投入过大，提取花苷的技术尚不成熟。
7.申请号为cn201310369190.x的专利中公开了一种具有抗氧化活性的短梗五加浆果花苷的制备方法，其步骤包括(1)以短梗五加浆果为原料。(2)冻结融解酶法提取短梗五加浆果花苷：将冷冻的原料与提取液混合、解冻、破碎、酶解。(3)超声—微波协同提取短梗五加浆果花苷：将酶解液进行超声—微波协同提取，离心，得到粗提液。(4)花苷粗提液纯化：将上述粗提液用大孔树脂进行吸附，收集洗脱液、减压浓缩。(5)真空冷冻干燥。(6)将花苷粉碎、包装。
8.申请号为cn201710451750.4的专利中公开了一种提取植物花苷的方法，将含有花苷的植物粉碎后加入低共熔溶剂；采用静电场超声提取法提取花苷提取液；向花苷提取液中加入凹土负载壳聚糖交联环糊精复合物得吸附在凹土负载壳聚糖交联环糊精复合物上的花苷复合物沉淀；将花苷复合物沉淀在有机溶剂中溶解解吸、离心得含有有机溶剂的花苷上清液；将花苷上清液过微孔滤膜得纯化的含有机溶剂的花苷溶液；脱去花苷溶液中的有机溶剂并去除多余水分得目标产物花苷。
9.申请号为cn202110502151.7的专利中公开了一种香樟果花苷的提取方法，集的香樟果原料清洗，去核，冷冻干燥，粉碎，过筛处理得香樟果粉；采用乙酸乙酯按一定料液比对香樟果粉进行浸提脱脂处理，得脱脂香樟果粉；将脱脂香樟果粉与低共熔溶剂按照一定料液比进行混合，加水稀释，经磁力充分振荡提取；将所得溶液置于超高压条件下进行超高压处理；向所得溶液中加入一定比例的反萃取溶液，离心取上清液，得香樟果花苷粗提液；将樟果花苷粗提液经大孔树脂和葡聚糖凝胶洗脱，得香樟果花苷精提液。
10.目前，花苷的提取分离方法常常采用超声、微波、超高压处理或大量有机溶剂提取，存在能耗较高、环境不友好、工艺流程繁琐和有机试剂残留等诸多问题。经专利检索和文献检索，目前国内关于香水莲花的花苷的提取，相关文献和尤其专利的报道仍较少，探求系统、环保、低成本且高效的香水莲花花苷提取工艺对天然素的开发利用具有重要意义。
技术实现要素：
11.发明目的：为了弥补现有技术的补足，本发明提供一种香水莲花中花苷的提取纯化方法。该方法工艺操作简单，能耗低，实现天然花苷的绿环保高效提取。
12.技术方案：为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
13.一种香水莲花中花苷的提取纯化方法，包括如下步骤：
14.(1)取香水莲花，破碎，加入其质量8-20倍的水，煮沸提取1-4次，每次提取1-5h，提取后过滤得到提取液；
15.(2)将步骤(1)的提取液经大孔树脂上样吸附，上样完成后用水冲洗树脂柱，再用一定浓度的乙醇水溶液冲洗，得到洗脱液；
16.(3)取步骤(2)的洗脱液，减压浓缩并干燥，得到粗提物1；
17.(4)取步骤(3)的粗提物1，加入一定量乙醇，加热溶解，冷却至室温后过滤，滤液减压浓缩并干燥，得到粗提物2；
18.(5)取步骤(4)的粗提物2，用乙醇溶解，经c18反相硅胶柱吸附后，用一定浓度的甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液，浓缩，待花苷结晶析出，过滤，得到花苷固体。
19.优选的，步骤(1)中，所述的香水莲花，选自新鲜或干燥的粉、红、黄、蓝、紫几种颜整花或花瓣中的一种或几种组合。
20.优选的，步骤(2)中，所述的大孔树脂，其型号选自ab-8、d101、nka-9、da201、dm130、hpd200、hpd400、lx-12、lx-32、lx-68中的一种或几种组合，填料量以香水莲花的质量计，为其质量1-5倍的体积。
21.优选的，步骤(2)中，所述上样和乙醇水溶液冲洗，其流速为0.5-4bv/h；所述的用水冲洗树脂柱，用水量为树脂体积的1-5倍。
22.优选的，步骤(2)中，所述一定浓度的乙醇水溶液，选自体积分数为20-95％中的一种或几种乙醇水溶液，若为多种乙醇水溶液，则按体积分数由低到高依次洗脱，总用量为树脂体积的2-10倍。
23.优选的，步骤(4)中，所述一定量乙醇，其用量为粗提物1质量2-10倍的体积；所述加热溶解的温度为50-70℃，并且同时进行搅拌。
24.优选的，步骤(5)中，所述用乙醇溶解，乙醇用量为粗提物2质量1-10倍的体积。
25.优选的，步骤(5)中，所述的c18反相硅胶柱，其填料量为粗提物2质量10-200倍的体积。
26.优选的，步骤(5)中，所述的甲醇水溶液，选自体积分数为10-95％中的一种或几种甲醇水溶液，若为多种甲醇水溶液，则按体积分数由高到低依次洗脱，总用量为c18反相硅胶体积的3-20倍。
27.优选的，上述方法中，所述减压浓缩的温度为50-80℃；步骤(5)中，所述浓缩，浓缩后体积为粗提物2质量的1-5倍。
28.有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优势：
29.(1)本发明工艺操作简单、能耗低、条件可控，大孔树脂使用方便迅速，能重复利用，大大降低生产成本。
30.(2)本发明所提供的香水莲花花苷，具有较高的抗氧化活性，在食品和化妆品领域具有潜在的运用前景。
具体实施方式
31.为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细描述。
32.花苷含量检测方法：
33.采用ph差异法测定花苷含量。将所制得的花苷固体分别用ph1.0和ph4.5的缓冲液稀释，并在缓冲液中对花苷进行扫描得出可见光部分最大吸收波长，平衡1h后用得到的最大吸收波长测定二者的吸光度。用700nm处的吸光度来作为模糊度的校正。公式如下：
34.总素质量分数(mg/g)＝(a
×
mw
×
df
×
1000)/(ε
×
1)
35.式中，a＝(amax-a700)ph1.0-(amax-a700)ph4.5；以矢车菊素-3-葡萄糖苷为花苷标准，mw＝449.38，df＝稀释倍数，ε＝摩尔消光系数；1＝光程(1cm)。
36.一、花苷制备
37.实施例1
38.(1)取新鲜的蓝香水莲花花瓣称重破碎，加入其质量12倍的水，煮沸提取2次，每次提取2h，提取后过滤得到提取液。
39.(2)将步骤(1)的提取液经d101大孔树脂上样吸附(大孔树脂填料量为香水莲花质量2倍的体积)，上样流速为1bv/h，上样完成后用树脂体积2倍量的水冲洗树脂柱，再依次用树脂体积2倍量的30％、60％、90％乙醇水溶液以2bv/h的流速冲洗得到洗脱液；
40.(3)取步骤(2)的洗脱液，于50℃-80℃减压浓缩并干燥，得到粗提物1。
41.(4)取步骤(3)的粗提物1，加入粗提物1质量5倍的乙醇，并加热至60℃搅拌1.5h溶解，冷却至室温后过滤，滤液50-80℃减压浓缩并干燥，得到粗提物2。
42.(5)取步骤(4)的粗提物2，用粗提物2质量3倍的乙醇溶解，经c18反相硅胶柱吸附后(c18反相硅胶的填料量为粗提物2质量50倍的体积)，依次用树脂体积2倍量的95％、80％、50％甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液，浓缩至粗提物2质量3倍的体积，待花苷结晶析出，过滤得到花苷固体，测得含量为61.2％。
43.实施例2
44.(1)取新鲜的粉香水莲花花瓣称重破碎，加入其质量8倍的水，煮沸提取1次，每次提取1h，提取后过滤得到提取液。
45.(2)将步骤(1)的提取液经ab-8大孔树脂上样吸附(大孔树脂填料量为香水莲花质量1倍的体积)，上样流速为0.5bv/h，上样完成后用树脂体积1倍量的水冲洗树脂柱，再依次用树脂体积1倍量的20％、80％乙醇水溶液以0.5bv/h的流速冲洗得到洗脱液；
46.(3)取步骤(2)的洗脱液，于50℃-80℃减压浓缩并干燥，得到粗提物1。
47.(4)取步骤(3)的粗提物1，加入粗提物1质量2倍的乙醇，并加热至50℃搅拌1h溶解，冷却至室温后过滤，滤液50-80℃减压浓缩并干燥，得到粗提物2。
48.(5)取步骤(4)的粗提物2，用粗提物2质量1倍的乙醇溶解，经c18反相硅胶柱吸附后(c18反相硅胶的填料量为粗提物2质量10倍的体积)，依次用树脂体积1倍量的90％、60％、10％甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液，浓缩至粗提物2质量1倍的体积，待花苷结晶析出，过滤得到花苷固体，测得含量为54.6％。
49.实施例3
50.(1)取干燥的蓝香水莲花花瓣称重破碎，加入其质量20倍的水，煮沸提取4次，每次提取5h，提取后过滤得到提取液。
51.(2)将步骤(1)的提取液经dm103大孔树脂上样吸附(大孔树脂填料量为香水莲花质量5倍的体积)，上样流速为4bv/h，上样完成后用树脂体积5倍量的水冲洗树脂柱，再依次用树脂体积3倍量的30％乙醇、3倍量的80％乙醇、4倍量的95％乙醇水溶液以4bv/h的流速冲洗得到洗脱液；
52.(3)取步骤(2)的洗脱液，于50℃-80℃减压浓缩并干燥，得到粗提物1。
53.(4)取步骤(3)的粗提物1，加入粗提物1质量10倍的乙醇，并加热至70℃搅拌3h溶解，冷却至室温后过滤，滤液50-80℃减压浓缩并干燥，得到粗提物2。
54.(5)取步骤(4)的粗提物2，用粗提物2质量10倍的乙醇溶解，经c18反相硅胶柱吸附后(c18反相硅胶的填料量为粗提物2质量200倍的体积)，依次用树脂体积6倍量的95％、7倍量的70％、7倍量的50％甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液，浓缩至粗提物2质量5倍的体积，待花苷结晶析出，过滤得到花苷固体，测得含量为51.3％。
55.实施例4
56.(1)取新鲜的紫香水莲花花瓣称重破碎，加入其质量10倍的水，煮沸提取2次，每次提取1h，提取后过滤得到提取液。
57.(2)将步骤(1)的提取液经d101大孔树脂上样吸附(大孔树脂填料量为香水莲花质量2倍的体积)，上样流速为0.5bv/h，上样完成后用树脂体积1倍量的水冲洗树脂柱，再依次用树脂体积2倍量的40％、90％乙醇水溶液以1bv/h的流速冲洗得到洗脱液；
58.(3)取步骤(2)的洗脱液，于50℃-80℃减压浓缩并干燥，得到粗提物1。
59.(4)取步骤(3)的粗提物1，加入粗提物1质量4倍的乙醇，并加热至55℃搅拌1h溶解，冷却至室温后过滤，滤液50-80℃减压浓缩并干燥，得到粗提物2。
60.(5)取步骤(4)的粗提物2，用粗提物2质量2倍的乙醇溶解，经c18反相硅胶柱吸附后(c18反相硅胶的填料量为粗提物2质量20倍的体积)，依次用树脂体积1倍量的95％、2倍量的60％、2倍量的20％甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液，浓缩至粗提物2质量1倍的体积，待花苷结晶析出，过滤得到花苷固体，测得含量为53.6％。
61.实施例5
62.(1)取新鲜的粉香水莲花花瓣称重破碎，加入其质量15倍的水，煮沸提取3次，每次提取3h，提取后过滤得到提取液。
63.(2)将步骤(1)的提取液经dm103大孔树脂上样吸附(大孔树脂填料量为香水莲花质量4倍的体积)，上样流速为2bv/h，上样完成后用树脂体积3倍量的水冲洗树脂柱，再依次用树脂体积2倍量的30％、3倍量的70％、3倍量的90％乙醇水溶液以3bv/h的流速冲洗得到洗脱液；
64.(3)取步骤(2)的洗脱液，于50℃-80℃减压浓缩并干燥，得到粗提物1。
65.(4)取步骤(3)的粗提物1，加入粗提物1质量8倍的乙醇，并加热至65℃搅拌2h溶解，冷却至室温后过滤，滤液50-80℃减压浓缩并干燥，得到粗提物2。
66.(5)取步骤(4)的粗提物2，用粗提物2质量6倍的乙醇溶解，经c18反相硅胶柱吸附后(c18反相硅胶的填料量为粗提物2质量100倍的体积)，依次用树脂体积5倍量的95％、70％、40％甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液，浓缩至粗提物2质量4倍的体积，待花苷结晶析出，过滤得到花苷固体，测得含量为58.2％。
67.二、抗氧化活性体外实验
68.1、样品液配制
69.精确称取样品(实施例1所制得的花苷、抗坏血酸vc)5mg分别用甲醇溶解，并定容到50ml容量瓶中，得到浓度100μg/ml的溶液，而后，分别取0.5、1、2、3、4、5ml溶液定容到10ml容量瓶中，配置成浓度5、10、20、30、40、50ug/ml的样品液，放入冰箱中避光冷藏，待用。
70.2、abts自由基清除实验
71.称取10.15mgabts溶于甲醇中，定容到25ml，配置成7.4mmol/labts储备液；再称取k2s2o8 70.28mg蒸馏水定容到100ml，配制成2.6mmol/l的k2s2o8储备液。分别各取25ml两储备液混合，避光反应12h。用磷酸缓冲液把abts溶液稀释成ph7.0的母液。取各浓度梯度样品溶液10μl和190μlabts母液加入到96微孔板中(a1)，以等量甲醇作为对照组(a0)，vc作阳性对照，每组平行试验3次，于酶标仪734nm下测定。
72.清除率计算：
73.清除率＝(1-a1/a0)
×
100％
74.3、dpph自由基清除实验
75.称取5mgdpph，用甲醇定容到100ml，冰箱内避光冷藏。取不同浓度样品各0.5ml，再取配好的1ml的dpph溶液混合，漩涡震荡15s，静置避光30min(b1)。再取每个浓度样品0.5ml各加入1ml甲醇，同等暗处放置30min(b2)。取0.5ml甲醇与1mldpph溶液混合，暗处静置，作为对照组(b0)，vc为阳性对照，每组平行3次。反应完成后，各取200μl于酶标仪517nm下测吸光度。
76.清除率计算：
77.清除率＝[1-(b1-b2)/b0]
×
100％
[0078]
4、实验结果
[0079][0080]
由实验结果可看出，本发明所制得的花苷对abts、dpph自由基都有一定的清除能力，且与其浓度呈明显的正相关关系。在清除abts、dpph自由基的实验中，花苷都表现出较强的清除能力，浓度为50μg/ml时，清除率达到96.8％，79.1％，且每个浓度下的清除率都明显高于vc。
[0081]
应当指出，以上所述仅是本发明的优选实施方式，仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
技术特征：
1.一种香水莲花中花苷的提取纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)取香水莲花，破碎，加入其质量8-20倍的水，煮沸提取1-4次，每次提取1-5h，提取后过滤得到提取液；(2)将步骤(1)的提取液经大孔树脂上样吸附，上样完成后用水冲洗树脂柱，再用一定浓度的乙醇水溶液冲洗，得到洗脱液；(3)取步骤(2)的洗脱液，减压浓缩并干燥，得到粗提物1；(4)取步骤(3)的粗提物1，加入一定量乙醇，加热溶解，冷却至室温后过滤，滤液减压浓缩并干燥，得到粗提物2；(5)取步骤(4)的粗提物2，用乙醇溶解，经c18反相硅胶柱吸附后，用一定浓度的甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液，浓缩，待花苷结晶析出，过滤，得到花苷固体。2.根据权利要求1所述的香水莲花中花苷的提取纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的香水莲花，选自新鲜或干燥的粉、红、黄、蓝、紫几种颜整花或花瓣中的一种或几种组合。3.根据权利要求1所述的香水莲花中花苷的提取纯化方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的大孔树脂，其型号选自ab-8、d101、nka-9、da201、dm130、hpd200、hpd400、lx-12、lx-32、lx-68中的一种或几种组合，填料量以香水莲花的质量计，为其质量1-5倍的体积。4.根据权利要求1所述的香水莲花中花苷的提取纯化方法，其特征在于，步骤(2)中，所述上样和乙醇水溶液冲洗，其流速为0.5-4bv/h；所述的用水冲洗树脂柱，用水量为树脂体积的1-5倍。5.根据权利要求1所述的香水莲花中花苷的提取纯化方法，其特征在于，步骤(2)中，所述一定浓度的乙醇水溶液，选自体积分数为20-95％中的一种或几种乙醇水溶液，若为多种乙醇水溶液，则按体积分数由低到高依次洗脱，总用量为树脂体积的2-10倍。6.根据权利要求1所述的香水莲花中花苷的提取纯化方法，其特征在于，步骤(4)中，所述一定量乙醇，其用量为粗提物1质量2-10倍的体积；所述加热溶解的温度为50-70℃，并且同时进行搅拌。7.根据权利要求1所述的香水莲花中花苷的提取纯化方法，其特征在于，步骤(5)中，所述用乙醇溶解，乙醇用量为粗提物2质量1-10倍的体积。8.根据权利要求1所述的香水莲花中花苷的提取纯化方法，其特征在于，步骤(5)中，所述的c18反相硅胶柱，其填料量为粗提物2质量10-200倍的体积。9.根据权利要求1所述的香水莲花中花苷的提取纯化方法，其特征在于，步骤(5)中，所述的甲醇水溶液，选自体积分数为10-95％中的一种或几种甲醇水溶液，若为多种甲醇水溶液，则按体积分数由高到低依次洗脱，总用量为c18反相硅胶体积的3-20倍。
技术总结
本发明公开了一种香水莲花中花苷的提取纯化方法，包括以香水莲花的整花或花瓣为原料，用水提取过滤后，经大孔树脂吸附饱和，用水洗脱杂质，之后使用乙醇溶液洗脱花苷，得到粗提物；粗提物经反相谱柱吸附，用甲醇溶液洗脱得到花苷溶液，最后花苷结晶析出。本发明工艺操作简单、能耗低，提高了香水莲花的综合利用价值，大孔树脂使用方便迅速，能重复利用，大大降低成本，本发明所述的制备方法可以用于香水莲花的开发与利用。以用于香水莲花的开发与利用。
