一种具备高效吸附和高效转化氮污染物功能的仿生底泥的制备方法
1.本发明涉及生物技术，特别涉及一种用于水体中氮污染物吸附和高效转化生态友好型仿生底泥制备方法。
背景技术：
2.当前，养殖户实施高密度、高投入、高产出的养殖方式，使得大量未消纳的饲料和鱼虾粪便进入到水产养殖水体中，成为水产养殖水体中有机污染物的主要来源。污染物质进入水体后经过被水体颗粒物的吸附、絮凝、沉淀以及生物吸收等多种方式最终沉积到底泥中并且逐渐积累，因此底泥被看作是水体中各种污染物质的最终储存场所，在不断的积累富集下，底泥中的有机物、氮、磷、重金属等污染物的浓度往往比上覆水中要高出很多倍，严重威胁着水体的生态环境安全，成为世界范围内的一个重要环境问题。
3.污水中过量的氮和磷是水体富营养化的主要原因，底泥对氮和磷的吸附和释放被认为是解决水产养殖可持续发展所面临的环境制约和资源利用问题的有效途径。底泥向上覆水释放氮、磷等元素是水质遭受污染的重要原因之一，因此底泥对氮、磷等污染物的转化对水质起到重要作用。传统化学法或物理化学法进行除磷脱氮，不仅运行费用高，也不适合污水处理量很大的城市。生物除磷脱氮技术由于处理成本低、管理方便、对环境副作用小等优点而得到广泛应用，因此利用生物法脱氮研究底泥对氮污染物的转化对水质净化、保护生态环境具有诸多现实意义。
技术实现要素：
4.发明目的：本发明提供一种用于水体中氮污染物吸附和高效转化生态友好型仿生底泥制备方法。
5.技术方案：本发明所述的用于水体中氮污染物吸附和高效转化生态友好型仿生底泥制备方法，包括以下步骤：
6.1)制备仿生底泥载体，优选方法如下：
7.(1)70％石英砂(过80目筛，以确保砂粒粒径小于0.2mm)，20％高岭土(600-1000目)，10％泥炭藓，泥炭藓需在60℃烘干箱烘干6-10h，然后用粉碎机打碎备用；
8.(2)将(1)中所述材料充分搅拌，再按料液比2∶1比例添加去离子水，充分搅拌均匀后静置1-2h后，去掉上层水，待用；
9.(3)碳、氮、磷源分别为葡萄糖、尿素、磷酸二氢钾，按100∶5∶1比例加入仿生底泥载体中，充分搅拌均匀，使仿生底泥载体具备能够提供微生物生长所需的必要条件。
10.2)获取具备高效转化氮污染物功能菌结构的活性污泥，优选方法如下：
11.(1)分别获取江苏如东小棚南美白对虾优质养殖环境活性污泥、江苏淮安污水处理厂活性污泥、江苏淮阴工学院学校生态池塘活性污泥，共3种；
12.(2)利用柱状取泥器分别采集，3种活性污泥利用柱状取泥器分别采集水下不同位
置的表层15-20cm厚的的底泥；
13.(3)实验室进行清除泥中石块、树枝等杂质，将同一种类不同位置的底泥充分搅拌均匀，静置1-2h，去掉上层水，装入密封袋，低温-20℃保存待用。
14.3)制备及改性氮吸附材料沸石粉，优选方法如下：
15.(1)对市场上现有多种沸石粉进行调研判断，进行实验室验证；
16.(2)多种沸石粉对氮污染物的吸附能力，选取最优；
17.(3)对吸附氮污染物能力最优的沸石粉进行改性处理，分别进行盐改性、酸改性、碱改性、热改性等方式对沸石粉进行改性处理，获取沸石粉对氮污染物吸附能力最佳的改性条件。
18.4)仿生底泥模型构建，优选方法如下：
19.(1)将制备完成的仿生底泥载体分别与3种不同的活性污泥按照(1-2)∶1比例均匀混合，从而获得3种不同的仿生底泥模型；
20.(2)进一步在3种不同的仿生底泥模型分别加入相应的碳、氮、磷源，使其具有能够为微生物提供生存和生长的环境条件。
21.5)构建及培养驯化“仿生底泥-水”两相系统，优选方法如下：
22.(1)按20-40％仿生底泥，虹吸法加入60-80％去离子水组合置于烧杯中，ph：6.5-7.5，构建“仿生底泥-水”两相系统；
23.(2)将烧杯用双层保鲜膜密封，然后静置1-2h；
24.(3)将密封的烧杯置于生化培养箱内培养，培养条件：避光、厌氧、25-32℃；
25.(4)每3天进行一次虹吸法换水，换水量为40-70％，并添加碳、氮、磷源；
26.(5)每3天进行一次取仿生底泥泥样10-30g，进行稀释涂布平板法，测定仿生底泥中菌生物量。
27.6)筛选获取氮污染物转化能力高的仿生底泥模型，优选方法如下：
28.(1)对培养驯化后的仿生底泥进行三态氮(氨氮、硝态氮、亚硝态氮)模拟污水验证仿生底泥模型对氮污染物转化的能力；
29.(2)获取具备氮污染物转化能力最高的仿生底泥模型；
30.(3)对氮污染物转化能力最高的仿生底泥模型进行misseq亚基因组测序和生物信息学分析，活性污泥中的微生物落结构分析研究不同菌种的相对分布。
31.7)在仿生底泥模型中添加氮吸附材料，优选方法如下：
32.(1)对沸石粉进行打碎过筛，添加沸石粉于氮污染物转化能力最高的仿生底泥模型中，验证其对氮污染物吸附能力；
33.(2)对吸附氮污染物能力最优的沸石粉进行改性处理，分别进行盐改性、酸改性、碱改性、热改性等方式对沸石粉进行改性处理，获取沸石粉对氮污染物吸附能力最佳的改性条件。
34.(3)改性后沸石粉按照不同剂量加入仿生底泥模型中，确定最佳剂量；
35.(4)上述验证方法选用三态氮模拟污水，验证添加氮吸附材料后的仿生底泥的氮吸附能力。
36.本发明通过制备构建高效转化氮污染物功能的生态友好型仿生底泥，能够有效控制底泥向上覆水中氮污染物的释放，以及降低水体中氨氮和亚硝酸盐等有害物质。通过参
考经济合作与发展组织(oecd)化学品测试准则中所提供的方法，制备仿生底泥载体，通过对仿生底泥载体进行优化、改性。从优良的水产养殖环境、自然生态池塘、污水处理厂中获得具备高效转化氮污染物功能菌结构优良活性污泥。仿生底泥载体与优良活性污泥有机结合，再复配上氮吸附材料沸石粉，使仿生底泥模型具有高效氮污染物吸附、及转化的水质净化功能。
37.本发明创新点在于将人工底泥载体与筛选获得优良活性污泥进行组合，进一步有机复配氮吸附材料，建立高效转化氮污染物的仿生底泥技术，使仿生底泥模型菌结构丰富，且具备高效吸附和转化氮污染物的功能。传统的水产养殖底泥结构单一，随着饵料残渣和粪便等有机物的积累，超过传统底泥对有机物的转化能力，会向水体中释放大量的氮污染物，导致水体污染，妨害养殖动物健康生长。本发明所述仿生底泥模型制，多孔结构材料为载体，吸附能力强，驯化选育功能菌，氮转化效率高，因此是具有高效吸附和高效转化氮污染物功能的仿生底泥模型。该技术未来可用于高密度水产养殖和水处理等领域，具有较广的应用前景。
38.有益效果：本发明与现有技术相比，具有如下优势：本发明的生态友好型仿生底泥的制备方法是基于从有优良水产养殖环境、自然生态池塘、污水处理厂筛选获得的活性污泥，对其进行菌分析，筛选获得具备高效氮污染物转化功能菌结构的活性污泥。将“人工底泥”和“活性污泥”有机复配，形成“仿生底泥模型”。将该模型与水体结合建立“仿生底泥-水”两相系统，添加氮污染物吸附材料，进行实验室验证，研究其对水质的净化功能，未来可用于水产养殖、水质净化处理等领域，具有较广的应用前景。
附图说明
39.图1是本发明工艺的技术路线图；
40.图2是仿生底泥在24h内对水体中氨氮的去除能力示意图；
41.图3是仿生底泥在24h内对水体中硝态氮的去除能力示意图；
42.图4是仿生底泥在24h内对水体中亚硝态氮的去除能力示意图。
具体实施方式
43.实施例1：
44.江苏如东小棚南美白对虾养殖环境活性污泥、江苏淮安污水处理厂活性污泥、江苏淮阴工学院学校池塘活性污泥，与仿生底泥载体复配构建仿生底泥模型。
45.(1)1000ml仿生底泥载体与1000ml活性污泥以及相应的碳、氮、磷源充分搅拌均匀，静止1-2h；
46.(2)去掉上层水，分装至5个2000ml烧杯，每个烧杯置于400ml仿生底泥模型，用虹吸法加入去离子水1600ml，用双层保鲜膜密封烧杯杯口。
47.实施例2：仿生底泥模型培养驯化。
48.(1)将密封完成的装有仿生底泥模型的烧杯置于生化培养箱，光照条件；避光，ph；6.5-7.5，厌氧条件，温度25-32℃，培养驯化周期30d。
49.(2)即仿生底泥模型置入培养箱起，每3天进行一次虹吸法换水，换水量约60％。按100∶5∶1比例添加葡萄糖、尿素、磷酸二氢钾。
50.实施例3：仿生底泥模型生物量检测
51.(1)每3天进行一次仿生底泥模型取样，每个烧杯取样量10-30g，将每类仿生底泥模型所取得所有的样品进行混匀，对样品进行稀释涂布平板法梯度检测仿生底泥模型中生物量的变化。
52.(2)仿生底泥样品培养基：牛肉膏3g，氯化钠5g，蛋白胨10g，琼脂20g，去离子水1000ml，ph：7.0-7.4。
53.(3)取混匀后的样品10g，进行加去离子水梯度稀释，取10-3
、10-4
、10-5
、10-6
四个浓度，每个浓度做三个平行，进行平板涂布，共做两组，一组为好氧组，一组为厌氧组，置于37℃培养箱培养12-24h。
54.(4)每三天检测一次生物量情况，共计10次，根据生物量的生长曲线观察仿生底泥模型中生物量的生长情况，目的在于活性污泥中微生物能够附着生长在仿生底泥载体中，使仿生底泥模型具有丰富的菌结构。
55.实施例4：仿生底泥模型去除三态氮能力验证
56.(1)仿生底泥培养驯化完成后，进行洗泥操作，目的在于去除“仿生底泥——水”两相系统中现存氮污染物。用虹吸法将水体排除，再加入等量去离子水，进行充分搅拌，使仿生底泥载体与水体完全混合，然后静置3-5h，待底泥与水体完全分离，上覆水澄清，用虹吸法将水体移除。重复上述三遍洗泥步骤，洗泥完成。
57.(2)用氯化铵、硝酸钾、亚硝酸钠模拟配制氨氮、硝态氮、亚硝态氮污水，每1000ml去离子水中加入0.2mg亚硝酸钠，4mg硝酸钾，80mg氯化铵。
58.(3)将三态氮模拟污水用虹吸法加入到洗净后的仿生底泥模型烧杯中，模拟水产养殖环境，烧杯杯口不密封，进行28-30℃，自然光环境条件。
59.(4)采用纳氏试剂分光光度法，测定氨氮含量；α—萘胺分光光度法，测定亚硝态氮含量；紫外分光光度法，测定硝态氮含量。
60.(5)分别检测2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h时间段，观察仿生底泥模型去除三态氮的综合能力。
61.(6)从3种仿生底泥模型中选取去除三态氮的综合能力最强的仿生底泥模型，进行misseq亚基因组测序和生物信息学分析，分析仿生底泥模型中的微生物落结构分析研究不同菌种的相对分布。
62.实施例5：强化型仿生底泥模型制备
63.(1)在去除三态氮的综合能力最强的仿生底泥模型中添加氮吸附材料-沸石粉，继续检测其对三态氮的去除能力。
64.(2)对氮吸附材料-沸石粉别进行盐改性、酸改性、碱改性、热改性等方式对沸石粉进行改性处理，获取沸石粉对氮污染物吸附能力最佳的改性条件。
65.(3)添加不同剂量改性后的沸石粉于仿生底泥模型中，确定去除三态氮能力的最佳剂量。
66.(4)从而构建具备菌结构丰富且具有高效吸附、抑制、转化氮污染物功能的仿生底泥模型，建立仿生底泥技术。
67.持续对上述实施例实验，实验验证了24h内仿生底泥模型对氨氮、硝态氮、亚硝态氮的吸附、转化能力影响效果。图2表示三种仿生底泥模型对氨氮去除能力的实验验证效
果，在无仿生底泥模型的对照组中，对氨氮的吸附、转化能力在6h最高，为71％。生态池塘仿生底泥模型c在4h时最高，达到87％。南美白对虾仿生底泥模型x在4h时去除率达到85％，随着时间推移，在24h时达到90％，对比对照组，对氨氮的吸附、转化能力提高了19％。综合比较对照组与三种仿生底泥模型，南美白对虾仿生底泥模型x对氨氮的吸附、转化能力具有较明显的效果(图2)。
68.图3表示三种仿生底泥模型对硝态氮去除能力的实验验证效果，在无仿生底泥模型的对照组中，对硝态氮的吸附、转化能力在4h最高，为62％。生态池塘仿生底泥模型c与南美白对虾仿生底泥模型x在24h内的硝态氮含量随时间推移逐渐减低，在24h时全部去除，去除率达到100％，对比对照组去除率提高了38％。综合比较对照组与三种仿生底泥模型，南美白对虾仿生底泥模型x与生态池塘仿生底泥模型c对硝态氮的吸附、转化能力具有明显的效果(图3)。
69.图4表示三种仿生底泥模型对亚硝态氮去除能力的实验验证效果，在无仿生底泥模型的对照组中，对亚硝态氮几乎不具有吸附、转化能力，在24h亚硝态氮含量反而增加了85％。生态池塘仿生底泥模型c与南美白对虾仿生底泥模型x在8h时候亚硝态氮达到峰值，但此时仿生底泥模型x中亚硝态氮含量明显低于仿生底泥模型c，但随着实验时间的退推移，两种仿生底泥模型在24h时都能将亚硝态氮完全去除，去除率达100％，比对照组去除率提高了185％。综合比较对照组与三种仿生底泥模型，南美白对虾仿生底泥模型x与生态池塘仿生底泥模型c对亚硝态氮的吸附、转化能力具有显著的效果(图4)。
70.在本发明人工构建仿生底泥模型中，综合分析三种仿生底泥模型对去除三态氮的吸附、转化的综合能力，南美白对虾仿生底泥模型x对氨氮、硝态氮、亚硝态氮的综合吸附、转化能力效果最显著。可以对氮污染物进行高效转化，极大地改善养殖水质。仿生底泥模型技术未来可用于高密度水产养殖和水处理等领域，具有较广的应用前景。
技术特征：
1.一种用于水体中氮污染物吸附和高效转化生态友好型仿生底泥制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)制备仿生底泥载体、获取具备高效氮转化功能菌结构的活性污泥、制备及改性氮吸附材料沸石粉；2)将仿生底泥载体与具备高效氮转化功能菌结构的活性污泥按比例复配，搅拌均匀，构建仿生底泥模型；3)将碳、氮和磷源，按比例添加于仿生底泥模型中；4)将仿生底泥模型与去离子水组合构建仿生底泥-水两相系统；5)对仿生底泥-水两相系统进行培养驯化；6)通过仿生底泥-水两相系统，筛选获取氮污染物转化能力高的仿生底泥模型；7)在驯化后的仿生底泥模型中添加氮吸附材料，检测对三态氮的去除能力。2.根据权利要求1所述的用于水体中氮污染物吸附和高效转化生态友好型仿生底泥制备方法，其特征在于，步骤1)中，制备仿生底泥载体的方法如下：1)人工底泥由70％石英砂、20％高岭土和10％泥炭藓，混合，搅拌；2)搅拌后的复合料与去离子水按2∶1比例均匀混合并搅拌。3.根据权利要求1所述的用于水体中氮污染物吸附和高效转化生态友好型仿生底泥制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述获取具备高效氮转化功能菌结构的活性污泥的方法如下：1)分别采集3种活性污泥；2)分别采集3种活性污泥水下不同位置的表层15-20cm厚的底泥，清除泥中杂质，静置1-2h，去掉上层水，装入密封袋，于-20℃保存待用。4.根据权利要求1所述的用于水体中氮污染物吸附和高效转化生态友好型仿生底泥制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述制备及改性氮吸附材料沸石粉的方法如下：1)选取最优吸附能力的沸石粉；2)对吸附氮污染物能力最优的沸石粉进行改性处理，分别进行盐改性、酸改性、碱改性、热改性，获取沸石粉对氮污染物吸附能力最佳的改性条件。5.根据权利要求1所述的用于水体中氮污染物吸附和高效转化生态友好型仿生底泥制备方法，其特征在于，步骤3)中，所述碳、氮、磷源分别为：葡萄糖、尿素、磷酸二氢钾。6.根据权利要求1所述的用于水体中氮污染物吸附和高效转化生态友好型仿生底泥制备方法，其特征在于，步骤4)中，构建仿生底泥-水两相系统方法如下：1)按20-40％仿生底泥模型，虹吸法加入60-80％去离子水组合置于烧杯中，ph：6.5-7.5，构建仿生底泥-水两相系统；2)将密封，静止。7.根据权利要求1或6所述的用于水体中氮污染物吸附和高效转化生态友好型仿生底泥制备方法，其特征在于，步骤5)中，对仿生底泥-水两相系统进行培养驯化方法如下：1)密封后置于生化培养箱内培养，培养条件：避光、厌氧、25-32℃；2)每3天一次虹吸法换水，换水量为40-70％，并添加碳、氮、磷源；3)每3天一次取样10-30g，稀释涂布平板法测定仿生底泥中菌生物量。8.根据权利要求1或7所述的用于水体中氮污染物吸附和高效转化生态友好型仿生底
泥制备方法，其特征在于，步骤6)中，筛选获取氮污染物转化能力高的仿生底泥模型具体方法如下：1)对培养驯化后的仿生底泥进行三态氮模拟污水去除能力验证，三态氮包括氨氮、硝态氮、亚硝态氮；2)获取具备氮污染物转化能力最高的仿生底泥模型；3)对氮污染物转化能力最高的仿生底泥模型进行misseq亚基因组测序和生物信息学分析，分析仿生底泥模型中的微生物落结构分析研究不同菌种的相对分布。9.根据权利要求1或8所述的用于水体中氮污染物吸附和高效转化生态友好型仿生底泥制备方法，其特征在于，步骤7)中，添加氮吸附材料方法如下：1)沸石粉打碎过筛，添加于氮污染物转化能力最高的仿生底泥模型中，验证其对但污染物吸附能力；2)对沸石粉进行盐改性、酸改性、碱改性或热改性，确定最佳改性条件；3)改性后沸石粉按照不同剂量加入仿生底泥模型中，确定最佳剂量。
技术总结
本发明公开一种用于水体中氮污染物吸附和高效转化生态友好型仿生底泥制备方法，制备仿生底泥载体、获取具备高效氮转化功能菌结构的活性污泥、制备及改性氮吸附材料沸石粉；仿生底泥载体与具备高效氮转化功能菌结构的活性污泥按比例复配，构建仿生底泥模型；将碳、氮和磷源，按比例添加于仿生底泥模型中；将仿生底泥模型与去离子水组合构建仿生底泥-水两相系统；系统驯化；筛选获取氮污染物转化能力高的仿生底泥模型；驯化后的仿生底泥模型中添加氮吸附材料，检测对三态氮的去除能力。上述仿生底泥可利用仿生底泥本身的多孔吸附结构特征，吸附氮污染物；驯化培养得到的丰富氮转化菌，高效转化氮污染物，改善养殖水质。改善养殖水质。改善养殖水质。
