大黄鱼、小黄鱼及其制品数字PCR鉴伪方法与流程
大黄鱼、小黄鱼及其制品数字pcr鉴伪方法
技术领域
1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及大黄鱼、小黄鱼及其制品数字pcr鉴伪方法。
背景技术：
2.大黄鱼(larimichthys crocea)和小黄鱼(larimichthys polyactis)统称为黄鱼，又名黄花鱼，是我国重要的海产经济鱼类，在沿海海域均有分布，因口味鲜美、营养丰富，深受消费者所喜爱。
3.然而，全球范围内海产鱼类市场错标虚标、掺假的现象非常普遍，位列食品掺假的首位。归结其原因，一方面是因为鱼类品种繁多，部分种类形态相近、组织结构相似，难以分辨识别，导致错标虚标现象时有发生；另一方面，由于鱼类品质不同，价格差异较大，不法商贩在利益驱动下故意以品质价格较低的鱼类假冒伪劣、掺假混杂。近年来，关于“染黄鱼”、假冒黄鱼的事件时常曝出。在冰鲜鱼销售方面，与大、小黄鱼体型外观近似的黄姑鱼、白姑鱼、三牙鱼等是常用的替代品，电子商城、网络销售平台同一产品标注黄鱼、黄花鱼、黄姑鱼等现象也屡见不鲜，为了泽外观上更加相近，甚至使用具有致癌风险的黄偶氮染料如碱性黄、碱性橙等进行染。另外，在鱼类深加工制品方面，如鱼片、鱼糜、鱼丸、鱼香肠、鱼排、鱼干、鱼翅、鱼肚、鱼罐头等，由于不具备原有外观特征及组织结构形态，更是假冒伪劣的重灾区。由此可见，包括大、小黄鱼在内的鱼类掺假现象，不仅扰乱市场秩序，影响社会形象，损害消费者合法权益，而且存在潜在的食用安全隐患，迫切需要实施市场监管，打击不法行为。因此，开发准确可靠的鱼源性成分鉴别技术具有重要意义。
4.目前，鱼类产品真假鉴别方法主要有形态观测法、波谱分析法、蛋白分析法以及分子生物学法等，其中，以遗传物质dna为分析对象的分子生物学法是最为理想的方案也是鱼类真假鉴别最常用的方法，这是由于dna分子具有高度的稳定性和物种特异性，相对于其他方法而言受外界影响因素较小。当前，在分子生物学pcr分析技术中，数字pcr技术因具有绝对定量的性能，被视为新一代pcr技术,在食品掺假比例分析中具有更大优势。
5.食品质量与安全一直是社会关注的焦点。目前国内外，对于食品质量与安全尚未有有效的、高可信度的大、小黄鱼及其制品成分真实性检测方法。为了整治黄鱼类产品掺假掺杂、假冒伪劣的现象，维护消费者权益，确保食品安全，开发准确可靠的大、小黄鱼及其制品真伪鉴定方法至关重要。
技术实现要素：
6.本发明的目的是针对现有技术存在的不足，提供一种大黄鱼、小黄鱼及其制品数字pcr鉴伪方法。数字pcr具有绝对定量能力，无需借助标准品直接获得样品中目标基因的拷贝数。本发明为大、小黄鱼及其制品真实性鉴别提供了新方法。
7.为实现上述目的，本发明大黄鱼、小黄鱼及其制品数字pcr鉴伪方法，通过数字pcr技术对大黄鱼、小黄鱼成分进行检测，包括以下步骤：
8.s1、分别针对大黄鱼、小黄鱼线粒体细胞素b(cytb)保守序列片段设计上游引物、下游引物和探针；
9.s2、样本dna提取：选取样本后，经剪碎或研磨、混合均匀后，采用ctab法进行dna提取，或采用试剂盒进行抽提；
10.s3、采用数字pcr反应体系，其总量为20μl，反应体系使用70μl微滴生成油借助微滴生成仪生成微滴，转移至96孔板密封后进行扩增，其中数字pcr扩增参数如下：
11.第一步：95℃变性5min；
12.第二步：94℃变性30s，60℃退火/延伸60s，循环40次；
13.第三步：98℃变性10min，4℃保存，转移到微滴读取仪中，选择相应的荧光通道进行读取；
14.s4、结果判别：根据体系中阴性扩增体系终点荧光值设定荧光的阈限值；阈限值需明确区分扩增体系中的阴性微滴和阳性微滴，若样品扩增终点荧光信号超过阈限值，则表明目标成分检出；若样品扩增终点荧光信号低于阈限值，则表明目标成分未检出。
15.作为上述方案的进一步地改进，所述步骤s1中的引物及探针序列如下所示：
16.大黄鱼cytb基因：
17.上游引物：5＇-ggcctgaactcggatataga-3＇；
18.下游引物：5＇-aagagagctagggtggtaag-3＇；
19.探针：5＇-agaccttctaggctttgcaatcctca-3＇；
20.小黄鱼cytb基因：
21.上游引物：5＇-tcatccgttgcacacatc-3＇；
22.下游引物：5＇-tggaggtagaggcagataaa-3＇；
23.探针：5＇-tgactcatccgaaaccttcatgccaa-3＇。
24.作为上述方案的进一步地改进，所述步骤s3中的总量为20μl体系组成包括：数字pcr反应液dd pcr supermix for probes(no dutp)10μl，浓度为20μmol的大黄鱼、小黄鱼线粒体细胞素b(cytb)两种上游引物各0.9μl，浓度为20μmol的两种下游引物各0.9μl，浓度为10μmol的两种探针各0.5μl，加入模板dna1-3μl，补充ddh2o至20μl。
25.作为上述方案的进一步地改进，所述5＇端为fam、hex/vic两组中各选其中1组进行标记，3＇端使用bhq1或bhq2标记。
26.本发明的有益效果为：这种大黄鱼、小黄鱼及其制品数字pcr鉴伪方法采用多重荧光定量pcr鉴别方法，针对大黄鱼、小黄鱼保守dna序列片段以及鱼类通用内参基因设计引物和taqman探针，通过使用相应的引物和相应的标记有不同荧光信号的探针，在同一个反应体系中实现大黄鱼、小黄鱼两种成分同时检测，具有通量高的优势；数字pcr由于具有绝对定量能力，所有无需标准品直接获得样品中目标基因的拷贝数。
附图说明
27.图1是本发明实施例黄姑鱼阴性对照扩增体系微滴分散图；
28.图2是本发明实施例中大、小黄鱼dna混合样本扩增体系微滴分散图；
29.图3是本发明实施例中大、小黄鱼dna混合样本样本二维散点图；
30.图4是本发明实施例中大、小黄鱼鱼糜制品样本扩增体系微滴分散图；
31.图5是本发明实施例中大、小黄鱼鱼糜制品样本二维散点图；
32.其中：ch1为大黄鱼cytb，ch2为小黄鱼cytb。
具体实施方式
33.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
34.实施例1
35.大黄鱼、小黄鱼及其制品数字pcr鉴伪方法，通过数字pcr技术对大黄鱼、小黄鱼成分进行检测，包括以下步骤：
36.s1、分别针对大黄鱼、小黄鱼线粒体细胞素b(cytb)保守序列片段设计上游引物、下游引物和探针，引物及探针序列如下所示：
37.大黄鱼cytb基因：
38.上游引物：5＇-ggcctgaactcggatataga-3＇；
39.下游引物：5＇-aagagagctagggtggtaag-3＇；
40.探针：5＇-agaccttctaggctttgcaatcctca-3＇；
41.小黄鱼cytb基因：
42.上游引物：5＇-tcatccgttgcacacatc-3＇；
43.下游引物：5＇-tggaggtagaggcagataaa-3＇；
44.探针：5＇-tgactcatccgaaaccttcatgccaa-3＇；
45.大黄鱼、小黄鱼线粒体细胞素b(cytb)所用探针5＇分别用fam、vic标记，3＇端分别用bhq1标记。
46.s2、选取样本后，经剪碎或研磨、混合均匀后，采用ctab法进行dna提取，或采用试剂盒进行抽提；
47.s3、数字pcr反应体系总量为20μl，包括：数字pcr反应液dd pcr supermix for probes(no dutp)10μl，浓度为20μmol的大黄鱼、小黄鱼线粒体细胞素b(cyt b)两种上游引物各0.9μl，浓度为20μmol的两种下游引物各0.9μl，浓度为10μmol的两种探针各0.5μl，加入模板dna1-3μl，补充ddh2o至20μl。每反应体系使用70μl微滴生成油借助微滴生成仪生成微滴，转移至96孔板密封后进行扩增。数字pcr扩增参数：第一步：95℃变性5min；第二步：94℃变性30s，60℃退火/延伸60s，循环40次；第三步：98℃变性10min，4℃保存。转移到微滴读取仪中，选择相应的荧光通道进行读取；
48.s4、结果判别：根据体系中阴性扩增体系终点荧光值设定荧光的阈限值；阈限值需明确区分扩增体系中的阴性微滴和阳性微滴，若样品扩增终点荧光信号超过阈限值，则表明目标成分检出；若样品扩增终点荧光信号低于阈限值，则表明目标成分未检出。
49.实施例2
50.利用海洋动物组织提取试剂盒分别提取大黄鱼、小黄鱼、黄姑鱼dna，将大、小黄鱼dna按比例稀释混合，按本发明所提供的数字pcr方法进行扩增，所用反应体系包括：数字pcr反应液dd pcr supermix for probes(no dutp)10μl，浓度为20μmol的大黄鱼、小黄鱼
线粒体细胞素b(cytb)两种上游引物各0.9μl，浓度为20μmol的两种下游引物各0.9μl，浓度为10μmol的两种探针各0.5μl，加入模板dna 2μl，补充ddh2o至20μl。同时，以黄姑鱼dna设置阴性对照。每个反应体系使用70μl微滴生成油借助微滴生成仪生成微滴，转移至96孔板密封后进行扩增。数字pcr扩增参数：第一步：95℃变性5min；第二步：94℃变性30s，60℃退火/延伸60s，循环40次；第三步：98℃变性10min，4℃保存。转移到微滴读取仪中，选择相应的荧光通道进行读取。其中，图1为黄姑鱼阴性对照扩增体系微滴分散图，图2为大、小黄鱼dna混合样本扩增体系微滴分散图，图3为大、小黄鱼dna混合样本二维散点图。
51.图1可以看出阴性扩增体系两个荧光通道终点荧光值仅有一条区带且信号较低；而图2样本扩增体系中两个荧光通道各有两条区带，其中荧光信号低的区带为阴性微滴，荧光信号低的区带为阳性微滴，表明两通道结果均为检出，即检出大黄鱼和小黄鱼成分,根据样本微滴数分析，在10255个微滴中，大黄鱼微滴数为7128、小黄鱼微滴数为3816；图3二维散点图中，则进一步显示样本微滴分布即微滴中包含两种信号的微滴个数为2687，仅包含大黄鱼荧光信号微滴个数为4441，仅包含大黄鱼荧光信号微滴个数为1129，不含有荧光信号的微滴个数为1998。
52.实施例3
53.取随机混合的大、小黄鱼鱼糜制品，按照ctab法进行提取dna，稀释100倍，按本发明所提供的数字pcr方法进行扩增，所用反应体系包括：数字pcr反应液dd pcr supermix for probes(no dutp)10μl，浓度为20μmol的大黄鱼、小黄鱼线粒体细胞素b(cytb)两种上游引物各0.9μl，浓度为20μmol的两种下游引物各0.9μl，浓度为10μmol的两种探针各0.5μl，加入模板dna 2μl，补充ddh2o至20μl。每个反应体系使用70μl微滴生成油借助微滴生成仪生成微滴，转移至96孔板密封后进行扩增。数字pcr扩增参数：第一步：95℃变性5min；第二步：94℃变性30s，60℃退火/延伸60s，循环40次；第三步：98℃变性10min，4℃保存。转移到微滴读取仪中，选择相应的荧光通道进行读取。其中，图4为大、小黄鱼鱼糜制品样本扩增体系微滴分散图，图5为大、小黄鱼鱼糜制品样本二维散点图。
54.图4大、小黄鱼鱼糜制品样本扩增体系中两个荧光通道各有两条区带，其中荧光信号低的区带为阴性微滴，荧光信号低的区带为阳性微滴，表明两通道结果均为检出，即检出大黄鱼和小黄鱼成分,根据样本微滴数分析，在14693个微滴中，大黄鱼微滴数为1683、小黄鱼微滴数为1445；图5大、小黄鱼鱼糜制品样本二维散点图中，则进一步显示样本微滴分布即微滴中包含两种信号的微滴个数为246，仅包含大黄鱼荧光信号微滴个数为1437，仅包含大黄鱼荧光信号微滴个数为1199，不含有荧光信号的微滴个数为11811。
55.以上所述实施例而已并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
技术特征：
1.大黄鱼、小黄鱼及其制品数字pcr鉴伪方法，其特征在于：通过数字pcr技术对大黄鱼、小黄鱼成分进行检测，包括以下步骤：s1、分别针对大黄鱼、小黄鱼线粒体细胞素b(cytb)保守序列片段设计上游引物、下游引物和探针；s2、样本dna提取：选取样本后，经剪碎或研磨、混合均匀后，采用ctab法进行dna提取，或采用试剂盒进行抽提；s3、采用数字pcr反应体系，其总量为20μl，反应体系使用70μl微滴生成油借助微滴生成仪生成微滴，转移至96孔板密封后进行扩增，其中数字pcr扩增参数如下：第一步：95℃变性5min；第二步：94℃变性30s，60℃退火/延伸60s，循环40次；第三步：98℃变性10min，4℃保存，转移到微滴读取仪中，选择相应的荧光通道进行读取；s4、结果判别：根据体系中阴性扩增体系终点荧光值设定荧光的阈限值；阈限值需明确区分扩增体系中的阴性微滴和阳性微滴，若样品扩增终点荧光信号超过阈限值，则表明目标成分检出；若样品扩增终点荧光信号低于阈限值，则表明目标成分未检出。2.根据权利要求1所述的一种大黄鱼、小黄鱼及其制品数字pcr鉴伪方法，其特征在于：所述步骤s1中的引物及探针序列如下所示：大黄鱼cytb基因：上游引物：5＇-ggcctgaactcggatataga-3＇；下游引物：5＇-aagagagctagggtggtaag-3＇；探针：5＇-agaccttctaggctttgcaatcctca-3＇；小黄鱼cytb基因：上游引物：5＇-tcatccgttgcacacatc-3＇；下游引物：5＇-tggaggtagaggcagataaa-3＇；探针：5＇-tgactcatccgaaaccttcatgccaa-3＇。3.根据权利要求1所述的大黄鱼、小黄鱼及其制品数字pcr鉴伪方法，其特征在于：所述步骤s3中的总量为20μl体系组成包括：数字pcr反应液dd pcr supermix for probes(no dutp)10μl，浓度为20μmol的大黄鱼、小黄鱼线粒体细胞素b(cytb)两种上游引物各0.9μl，浓度为20μmol的两种下游引物各0.9μl，浓度为10μmol的两种探针各0.5μl，加入模板dna1-3μl，补充ddh2o至20μl。4.根据权利要求2所述的大黄鱼、小黄鱼及其制品数字pcr鉴伪方法，其特征在于：所述5＇端为fam、hex/vic两组中各选其中1组进行标记，3＇端使用bhq1或bhq2标记。
技术总结
本发明公开了大黄鱼、小黄鱼及其制品数字PCR鉴伪方法，利用数字PCR技术对大黄鱼、小黄鱼成分进行检测，包括如下步骤：(1)大黄鱼、小黄鱼以及鱼类内参基因引物及其荧光探针设计与修饰；(2)样品DA提取；(3)数字PCR反应体系配制、微滴生成、扩增参数设置以及微滴读取；(4)数字PCR结果判别。本发明为大黄鱼、小黄鱼及其制品鱼源性成分真伪识别提供准确可靠的分析方法，能够实现大黄鱼、小黄鱼两种成分同时快速检出，数字PCR具有绝对定量能力，可以不借助标准品直接获得样品中目标基因的拷贝数。借助标准品直接获得样品中目标基因的拷贝数。借助标准品直接获得样品中目标基因的拷贝数。
