一种体外诱导IPS细胞分化生成人神经元的方法与流程
一种体外诱导ips细胞分化生成人神经元的方法
技术领域
1.本发明涉及细胞分化培养技术领域，具体为一种体外诱导ips细胞分化生成人神经元的方法。
背景技术：
2.多能干细胞(pscs)具有独特的自我更新能力和多系分化潜能，包括诱导性多能干细胞(ipscs)。人类pscs，特别是来源于疾病患者的ipscs，在组织再生医学中的有着多种应用，包括疾病模型的建立，新型药物的研发以及细胞替代疗法的开发，具有广阔的临床前景。ipscs在再生医学中的应用很大程度上依赖于高效的分化技术，即建立快速有效的方法将其诱导分化成特殊种系和功能完整的后代(例如:各种神经元亚型)。
3.目前基于化合物的ips分化相对缓慢且稳定性差，因此有必要提供一种能够高效分化ips细胞生成人神经元的方法。
技术实现要素：
4.针对上述情况，为弥补上述现有缺陷，本发明提供了一种可有效提高ips细胞分化速率的体外诱导ips细胞分化生成人神经元的方法。
5.本发明提供如下的技术方案：本发明提出的一种体外诱导ips细胞分化生成人神经元的方法，具体包括下列步骤：
6.步骤一、将融合度为70-80％的人诱导多能干细胞，加入mem/f12细胞培养液培养中，在30～38℃、4.5～5.5％的co2的培养箱中培养1天；
7.步骤二、吸弃mtesr1细胞培养液的上清液以除去未贴壁的细胞，加入神经诱导分化培养液，继续在30～38℃、4.5～5.5％的co2培养箱中培养4～5天得到p1代的神经干细胞，培养过程中隔天换液；
8.步骤三、将聚鸟氨酸、雷帕霉素添加至培养皿内，之后加入mem/f12培养基，在32～38℃、4.5～5.5％的co2的培养箱中培养1h，将p1代的神经干细胞接种到培养皿中培养6～7天，得到p2代的神经干细胞，培养过程中每间隔2天更换一次培养基；
9.步骤四、将p2代的神经干细胞转移至细胞分化培养液内培养10～12天，并加入分散酶将细胞消化并悬浮培养于细胞分化培养液内，得到p3代的神经干细胞；
10.步骤五、采用accutase细胞消化液将p3代的神经干细胞消化3～8分钟后贴壁，神经元贴壁培养液中培养12～15天可以得到成熟的神经元。
11.作为优选地，步骤一的mem/f12细胞培养液中添加有rock抑制剂。
12.进一步地，所述神经诱导分化培养液包括mem/f12培养基、0.5
×
n2细胞添加剂、0.5
×
b27细胞添加剂和1
×
glutamax细胞添加剂。
13.进一步地，步骤三中p1代的神经干细胞的接种密度为3.0
×
104～4.2
×
104个细胞/cm2。
14.进一步地，所述细胞分化培养液包括dmem/f12培养基、0.5
×
n2细胞添加剂、0.5
×
b27细胞添加剂和1
×
glutamax细胞添加剂。
15.进一步地，所述神经元贴壁培养液包括mem/f12培养基、1
×
n2细胞添加剂、1
×
b27细胞添加剂、脑源性神经营养因子10ng/ml、神经胶质细胞源性神经营养因子10ng/ml、促红细胞生成素1μm和l-抗坏血酸200μm。
16.采用上述结构本发明取得的有益效果如下：本发明提出的一种体外诱导ips细胞分化生成人神经元的方法，培养、诱导、分化操作简单，从ips细胞起始，在体外培养中简便、快速、高效的诱导分化到成熟神经元。
具体实施方式
17.下面将结合本发明的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
18.实施例1
19.一种体外诱导ips细胞分化生成人神经元的方法，具体包括下列步骤：
20.步骤一、将融合度为70-80％的人诱导多能干细胞，加入mem/f12细胞培养液培养中，在37℃、5％的co2的培养箱中培养1天，mem/f12细胞培养液中添加有rock抑制剂；
21.步骤二、吸弃mtesr1细胞培养液的上清液以除去未贴壁的细胞，加入神经诱导分化培养液，继续在37℃、5％的co2培养箱中培养4天得到p1代的神经干细胞，培养过程中隔天换液，所述神经诱导分化培养液包括mem/f12培养基、0.5
×
n2细胞添加剂、0.5
×
b27细胞添加剂和1
×
glutamax细胞添加剂；
22.步骤三、将聚鸟氨酸、雷帕霉素添加至培养皿内，之后加入mem/f12培养基，在37℃、5％的co2的培养箱中培养1h，将p1代的神经干细胞接种到培养皿中培养6天，p1代的神经干细胞的接种密度为3.6
×
104个细胞/cm2，得到p2代的神经干细胞，培养过程中每间隔2天更换一次培养基；
23.步骤四、将p2代的神经干细胞转移至细胞分化培养液内培养10天，并加入分散酶将细胞消化并悬浮培养于细胞分化培养液内，得到p3代的神经干细胞，所述细胞分化培养液包括dmem/f12培养基、0.5
×
n2细胞添加剂、0.5
×
b27细胞添加剂和1
×
glutamax细胞添加剂；步骤五、采用accutase细胞消化液将p3代的神经干细胞消化3～8分钟后贴壁，神经元贴壁培养液中培养12天可以得到成熟的神经元，所述神经元贴壁培养液包括mem/f12培养基、1
×
n2细胞添加剂、1
×
b27细胞添加剂、脑源性神经营养因子10ng/ml、神经胶质细胞源性神经营养因子10ng/ml、促红细胞生成素1μm和l-抗坏血酸200μm。
24.实施例2
25.一种体外诱导ips细胞分化生成人神经元的方法，具体包括下列步骤：
26.步骤一、将融合度为70-80％的人诱导多能干细胞，加入mem/f12细胞培养液培养中，在30℃、4.5％的co2的培养箱中培养1天，mem/f12细胞培养液中添加有rock抑制剂；
27.步骤二、吸弃mtesr1细胞培养液的上清液以除去未贴壁的细胞，加入神经诱导分化培养液，继续在30℃、4.5％的co2培养箱中培养5得到p1代的神经干细胞，培养过程中隔天换液，所述神经诱导分化培养液包括mem/f12培养基、0.5
×
n2细胞添加剂、0.5
×
b27细胞
添加剂和1
×
glutamax细胞添加剂；
28.步骤三、将聚鸟氨酸、雷帕霉素添加至培养皿内，之后加入mem/f12培养基，在32℃、4.5％的co2的培养箱中培养1h，将p1代的神经干细胞接种到培养皿中培养6天，p1代的神经干细胞的接种密度为3.0
×
104个细胞/cm2，得到p2代的神经干细胞，培养过程中每间隔2天更换一次培养基；
29.步骤四、将p2代的神经干细胞转移至细胞分化培养液内培养10天，并加入分散酶将细胞消化并悬浮培养于细胞分化培养液内，得到p3代的神经干细胞，所述细胞分化培养液包括dmem/f12培养基、0.5
×
n2细胞添加剂、0.5
×
b27细胞添加剂和1
×
glutamax细胞添加剂；
30.步骤五、采用accutase细胞消化液将p3代的神经干细胞消化3～8分钟后贴壁，神经元贴壁培养液中培养12天可以得到成熟的神经元，述神经元贴壁培养液包括mem/f12培养基、1
×
n2细胞添加剂、1
×
b27细胞添加剂、脑源性神经营养因子10ng/ml、神经胶质细胞源性神经营养因子10ng/ml、促红细胞生成素1μm和l-抗坏血酸200μm。
31.实施例3
32.一种体外诱导ips细胞分化生成人神经元的方法，具体包括下列步骤：
33.步骤一、将融合度为70-80％的人诱导多能干细胞，加入mem/f12细胞培养液培养中，在38℃、5.5％的co2的培养箱中培养1天，mem/f12细胞培养液中添加有rock抑制剂；
34.步骤二、吸弃mtesr1细胞培养液的上清液以除去未贴壁的细胞，加入神经诱导分化培养液，继续在38℃、5.5％的co2培养箱中培养5天得到p1代的神经干细胞，培养过程中隔天换液，所述神经诱导分化培养液包括mem/f12培养基、0.5
×
n2细胞添加剂、0.5
×
b27细胞添加剂和1
×
glutamax细胞添加剂；
35.步骤三、将聚鸟氨酸、雷帕霉素添加至培养皿内，之后加入mem/f12培养基，在38℃、5.5％的co2的培养箱中培养1h，将p1代的神经干细胞接种到培养皿中培养7天，p1代的神经干细胞的接种密度为4.2
×
104个细胞/cm2，到p2代的神经干细胞，培养过程中每间隔2天更换一次培养基；
36.步骤四、将p2代的神经干细胞转移至细胞分化培养液内培养2天，并加入分散酶将细胞消化并悬浮培养于细胞分化培养液内，得到p3代的神经干细胞，所述细胞分化培养液包括dmem/f12培养基、0.5
×
n2细胞添加剂、0.5
×
b27细胞添加剂和1
×
glutamax细胞添加剂；
37.步骤五、采用accutase细胞消化液将p3代的神经干细胞消化3～8分钟后贴壁，神经元贴壁培养液中培养15天可以得到成熟的神经元，述神经元贴壁培养液包括mem/f12培养基、1
×
n2细胞添加剂、1
×
b27细胞添加剂、脑源性神经营养因子10ng/ml、神经胶质细胞源性神经营养因子10ng/ml、促红细胞生成素1μm和l-抗坏血酸200μm。
38.要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物料或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物料或者设备所固有的要素。
39.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
技术特征：
1.一种体外诱导ips细胞分化生成人神经元的方法，其特征在于，具体包括下列步骤：步骤一、将融合度为70-80％的人诱导多能干细胞，加入mem/f12细胞培养液培养中，在30～38℃、4.5～5.5％的co2的培养箱中培养1天；步骤二、吸弃mtesr1细胞培养液的上清液以除去未贴壁的细胞，加入神经诱导分化培养液，继续在30～38℃、4.5～5.5％的co2培养箱中培养4～5天得到p1代的神经干细胞，培养过程中隔天换液；步骤三、将聚鸟氨酸、雷帕霉素添加至培养皿内，之后加入mem/f12培养基，在32～38℃、4.5～5.5％的co2的培养箱中培养1h，将p1代的神经干细胞接种到培养皿中培养6～7天，得到p2代的神经干细胞，培养过程中每间隔2天更换一次培养基；步骤四、将p2代的神经干细胞转移至细胞分化培养液内培养10～12天，并加入分散酶将细胞消化并悬浮培养于细胞分化培养液内，得到p3代的神经干细胞；步骤五、采用accutase细胞消化液将p3代的神经干细胞消化3～8分钟后贴壁，神经元贴壁培养液中培养12～15天可以得到成熟的神经元。2.根据权利要求1所述的一种体外诱导ips细胞分化生成人神经元的方法，其特征在于，步骤一的mem/f12细胞培养液中添加有rock抑制剂。3.根据权利要求1所述的一种体外诱导ips细胞分化生成人神经元的方法，其特征在于，所述神经诱导分化培养液包括mem/f12培养基、0.5
×
n2细胞添加剂、0.5
×
b27细胞添加剂和1
×
glutamax细胞添加剂。4.根据权利要求1所述的一种体外诱导ips细胞分化生成人神经元的方法，其特征在于，步骤三中p1代的神经干细胞的接种密度为3.0
×
104～4.2
×
104个细胞/cm2。5.根据权利要求1所述的一种体外诱导ips细胞分化生成人神经元的方法，其特征在于，所述细胞分化培养液包括dmem/f12培养基、0.5
×
n2细胞添加剂、0.5
×
b27细胞添加剂和1
×
glutamax细胞添加剂。6.根据权利要求1所述的一种体外诱导ips细胞分化生成人神经元的方法，其特征在于，所述神经元贴壁培养液包括mem/f12培养基、1
×
n2细胞添加剂、1
×
b27细胞添加剂、脑源性神经营养因子10ng/ml、神经胶质细胞源性神经营养因子10ng/ml、促红细胞生成素1μm和l-抗坏血酸200μm。
技术总结
本发明公开了一种体外诱导IPS细胞分化生成人神经元的方法，具体包括下列步骤：步骤一、将人诱导多能干细胞，加入MEM/F12细胞培养液培养中培养；步骤二、吸弃mTeSR1细胞培养液的上清液以除去未贴壁的细胞，加入神经诱导分化培养液中培养；步骤三、将聚鸟氨酸、雷帕霉素添加至培养皿内，之后加入MEM/F12培养基进行培养；步骤四、转移至细胞分化培养液内培养；步骤五、采用Accutase细胞消化液进行培养。本发明涉及细胞分化培养技术领域，具体提供了一种可有效提高IPS细胞分化速率的体外诱导IPS细胞分化生成人神经元的方法。分化生成人神经元的方法。
