一种培养人嗅黏膜间充质干细胞的试剂盒及培养方法与流程
1.本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种培养人嗅黏膜间充质干细胞的试剂盒及培养方法。
背景技术：
2.1998年huard等人从人嗅黏膜中分离培养出一种可以向神经元与非神经细胞分化的细胞，后续被认为是嗅黏膜间充质干细胞(om-mscs)。om-mscs广泛存在于鼻中隔或侧壁的上、中、下鼻甲的鼻黏膜的固有层内。多项研究证实，该细胞不仅具有其他类型间充质干细胞的基本特性，并且相比于其他类型的间充质干细胞，om-mscs具有取材方便，来源稳定，更容易向神经元及其他神经细胞分化的优势。om-mscs在组织工程，再生医学和细胞免疫领域具有广阔的应用前景。然而，目前培养om-mscs的方法多用自体血清及胎牛血清作为营养来源，若将培养的细胞应用于人体，其风险极大，如：朊病毒感染、人体抗牛血清蛋白抗体的产生等。因此，迫切需要一种全程无血清的培养om-mscs的方法减少疾病传播的风险，并能保持干细胞纯度，增殖及分化能力。
技术实现要素：
3.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种培养人嗅黏膜间充质干细胞的试剂盒及培养方法，全程无血清培养条件下处理的om-mscs仍能维持干细胞的增殖和分化能力。
4.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
5.本发明提供了一种培养人嗅黏膜间充质干细胞的试剂盒，包括独立包装的无血清培养基、无血清胰酶终止液和无血清冻存液；
6.所述无血清培养基以dmem/f12为基础培养基，还包括谷氨酰胺600μg/ml、hepes 2nm、丙酮酸钠60μg/ml、层粘蛋白50μg/ml、氢化可的松1μg/ml、人重组白蛋白1mg/ml、重组人胰岛素20μg/ml、重组人转铁蛋白0.5ng/ml、β-甘油磷酸4mg/ml、胆固醇5μg/ml、生物素20μg/ml、肝素钠4iu/ml、维生素b1210μg/ml、维生素e10μg/ml、维生素c 50μg/ml、干细胞营养液(v/v)5％、成纤维细胞生长因子20ng/ml、gm-csf 10ng/ml、egf 20ng/ml和β-fgf 20ng/ml；
7.所述无血清胰酶终止液包括pbs缓冲液和抑肽酶溶液20μg/ml；
8.所述无血清冻存液包括以下体积百分含量的组分：dmso 10％、白蛋白溶液30％、右旋糖酐40葡萄糖注射液20％、复方电解质注射液20％和葡萄糖氯化钠注射液20％。
9.本发明提供了一种人嗅黏膜充间质干细胞的培养方法，包括以下步骤：将采集的人嗅黏膜样本清洗后剪碎，与上述试剂盒中的无血清培养基混合培养，纯化出人嗅黏膜充间质干细胞，得p0代细胞；
10.将p0代细胞培养至70～80％融合度时，用胰酶消化，利用上述试剂盒中的无血清胰酶终止液终止，离心后用所述无血清培养基重悬沉淀，得p1代细胞；利用所述p1代细胞进行与p1代相同的操作，进行代数扩增；
11.将获得的p0代至p4代的细胞在所述离心后，利用上述试剂盒中的无血清冻存液进行重悬，而后进行冻存。
12.优选的，所述人嗅黏膜样本采集自上鼻甲及中鼻甲靠上部外侧黏膜组织。
13.优选的，所述清洗包括将采集的嗅黏膜样本用青霉素和生理盐水的混合溶液清洗3遍；所述青霉素和生理盐水的体积比为1:1。
14.优选的，采用组织块反复重新贴壁的方法纯化出人嗅黏膜充间质干细胞；
15.在纯化出所述人嗅黏膜充间质干细胞后，还包括每3天更换一次所述无血清培养基。
16.优选的，所述冻存包括，依次经4℃冷藏1h，-20℃冷冻4h，转移至液氮上层，8～12h后转移至液氮下层。
17.优选的，对经所述冻存后的人嗅黏膜充间质干细胞进行复苏，包括：采用37℃水浴复温，融化的细胞悬液与所述无血清培养基混合，离心收集沉淀，用无血清冻存液重悬。
18.优选的，所述离心的转速为1000rpm，时间为5min。
19.本发明还提供了利用上述培养方法培养得到的人嗅黏膜充间质干细胞在获得成骨、成脂或成软骨细胞中的应用。
20.有益效果：本发明提供了一种培养人嗅黏膜间充质干细胞的试剂盒，包括独立包装的无血清培养基、无血清胰酶终止液和无血清冻存液，使得om-mscs在分离纯化、培养扩增、储存与复苏全程无血清。利用本发明所述试剂盒，在om-mscs的分离纯化、培养扩增、储存与复苏全过程中，优化操作步骤，简化培养流程，可获得纯度更高的om-mscs。本发明自获取鼻黏膜后全程不涉及自体血清或胎牛血清，使用了化学成分明确的无血清培养基，避免了疾病的传播。应用该无血清培养基与10％fbs培养基在形态上相似，均呈梭形，螺旋状生长，并具有间充质干细胞的增殖能力。流式细胞仪对om-msc的表面标志物检测显示与10％fbs培养一致。无血清培养的细胞高表达间充质干细胞标志物(cd73，cd90，cd105)以及om-mscs的特殊标志物，不表达造血干细胞标志物(cd34，cd45)。并且无血清培养om-mscs在成脂和成骨能力上与10％fbs培养的om-mscs相近。综上可见，无血清培养的细胞符合om-msc鉴定标准，与10％fbs培养的om-msc在形态，生长方式，细胞表型，分化能力等方面一致，全程无血清培养方法可用于om-msc培养，实现om-mscs的体外大量扩增，对未来的临床应用意义重大。
附图说明
21.图1为10％血清与无血清培养p4代om-msc形态对比；
22.图2为10％血清与无血清培养p4代om-msc流式表型对比；
23.图3为10％血清与无血清培养p4代om-msc的诱导分化结果对比。
具体实施方式
24.本发明提供了一种培养人嗅黏膜间充质干细胞的试剂盒，包括独立包装的无血清培养基、无血清胰酶终止液和无血清冻存液；
25.所述无血清培养基以dmem/f12为基础培养基，还包括谷氨酰胺600μg/ml、hepes 2nm、丙酮酸钠60μg/ml、层粘蛋白50μg/ml、氢化可的松1μg/ml、人重组白蛋白1mg/ml、重组
人胰岛素20μg/ml、重组人转铁蛋白0.5ng/ml、β-甘油磷酸4mg/ml、胆固醇5μg/ml、生物素20μg/ml、肝素钠4iu/ml、维生素b12 10μg/ml、维生素e 10μg/ml、维生素c 50μg/ml、干细胞营养液(v/v)5％、成纤维细胞生长因子20ng/ml、gm-csf 10ng/ml、egf 20ng/ml和β-fgf 20ng/ml；
26.所述无血清胰酶终止液包括pbs缓冲液、抑肽酶溶液20μg/ml；
27.所述无血清冻存液包括以下体积百分含量的成分：dmso 10％、白蛋白溶液30％、右旋糖酐40葡萄糖注射液20％、复方电解质注射液20％和葡萄糖氯化钠注射液20％。
28.本发明所述成纤维细胞生长因子、gm-csf、egf和β-fgf促进om-mscs生长与增殖。
29.本发明提供了一种人嗅黏膜充间质干细胞的培养方法，包括以下步骤：将采集的人嗅黏膜样本清洗后剪碎，与上述试剂盒中的无血清培养基混合培养，纯化出人嗅黏膜充间质干细胞，得p0代细胞；
30.将p0代细胞培养至70-80％融合度时，用胰酶消化，利用上述试剂盒中的无血清胰酶终止液终止，离心后用所述无血清培养基重悬沉淀，得p1代细胞；利用所述p1代细胞进行与p1代相同的操作，直至得p4代细胞；
31.将获得的p0代至p4代的细胞在所述离心后，利用上述试剂盒中的无血清冻存液进行重悬，而后进行冻存。
32.本发明所述人嗅黏膜样本，优选采集自上鼻甲及中鼻甲靠上部外侧黏膜组织，且在采集前，优选还包括排除hiv、梅毒及呼吸道病毒等传染病。本发明所述采集优选包括在局部麻醉后，使用筛窦咬钳取鼻腔特殊部位组织，将夹取的嗅黏膜放入专用嗅黏膜保存液中，充分混匀后送入实验室培养。本发明所述专用嗅黏膜保存液优选为上述无血清培养基。
33.本发明对采集的人嗅黏膜样本进行清洗，所述清洗优选包括将采集的嗅黏膜样本用青霉素和生理盐水的混合溶液清洗3遍，直至血迹洗净；所述青霉素和生理盐水的体积比为1:1。本发明优选将清洗后的人嗅黏膜样本，用无菌眼科剪剪成约1mm3大小的组织块，并将剪碎的组织块与配置的无血清培养基充分混合种植于细胞培养瓶，置于37℃，5％co2的培养箱中培养。在本发明所述培养方式下，7天后组织块周围可见细胞爬出，利用专用纯化方法将om-mscs纯化，纯化出后优选每3天更换一次无血清培养基。本发明所述专用纯化方法优选包括组织块反复重新贴壁的方法，具体为：嗅黏膜组织块贴壁后首先可见表皮细胞，成纤维细胞，om-mscs等细胞同时爬出，细胞成分复杂；当细胞覆盖范围接近瓶底40％时，将组织块取出，重新用无血清培养基贴壁到新培养瓶，反复操作2-3次，可见纯度较高的om-mscs爬出。
34.本发明将纯化出的细胞记作p0代细胞，将所述p0代细胞培养融合为70-80％时，用胰酶消化后充分，予以无血清胰酶终止液终止，1000rpm，5min离心后收集沉淀，用无血清培养基重悬在新的培养瓶，记作p1代细胞。重复上述操作，培养至p4代待用。
35.在本发明中，获得的p0-p4代的细胞均可以采用胰酶消化充分后，予以无血清胰酶终止液终止，1000rpm离心后收集沉淀重悬在无血清冻存液中，细胞浓度为1
×
106/ml。经过4℃冷藏1h，-20℃冷冻4h后，转移至液氮上层，过夜(8～12h)后转移至液氮下层以储存人嗅黏膜间充质干细胞。
36.本发明还包括对经所述冻存后的人嗅黏膜充间质干细胞进行复苏，优选包括：采用37℃水浴复温，融化的细胞悬液与所述无血清培养基混合，离心收集沉淀，用无血清冻存
液重悬。本发明所述离心的转速优选为1000rpm，时间为5min。
37.本发明优选还包括对获取的人嗅黏膜间充质干细胞进行鉴定，更优选包括利用流式细胞仪检测人嗅黏膜间充质干细胞表型，包括cd34、cd45、cd73、cd90、cd105和间充质干细胞特殊标志物。
38.利用本发明所述方法培养得到的人嗅黏膜间充质干细胞，在成骨、成脂及成软骨诱导分化培养基中，可完成细胞分化，从而得到对应的分化细胞。
39.本发明还提供了利用上述培养方法培养得到的人嗅黏膜充间质干细胞在获得成骨、成脂或成软骨细胞中的应用。
40.本发明对所述成骨、成脂或成软骨细胞的分化诱导方法并没有特殊限定，利用本领域的常规方法进行分化诱导即可。
41.下面结合实施例对本发明提供的一种培养人嗅黏膜间充质干细胞的试剂盒及培养方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
42.实施例1
43.1.专用无血清培养基、无血清胰酶终止液、无血清冻存液的配置；
44.a.专用无血清培养基：dmem/f12+谷氨酰胺600μg/ml+hepes 2nm+丙酮酸钠60μg/ml+层粘蛋白50μg/ml+氢化可的松1μg/ml+人重组白蛋白1mg/ml+重组人胰岛素20μg/ml+重组人转铁蛋白0.5ng/ml+β-甘油磷酸4mg/ml+胆固醇5μg/ml+生物素20μg/ml+肝素钠4iu/ml+维生素b12 10μg/ml+维生素e 10μg/ml+维生素c 50μg/ml+干细胞营养液(v/v)5％+成纤维细胞生长因子20ng/ml+gm-csf 10ng/ml+egf 20ng/ml+β-fgf 20ng/ml；
45.b.无血清胰酶终止液：pbs缓冲液+抑肽酶溶液20μg/ml；
46.c.无血清冻存液(v/v)：dmso 10％+白蛋白溶液30％+右旋糖酐40葡萄糖注射液20％+复方电解质注射液20％+葡萄糖氯化钠注射液20％。
47.2.人嗅黏膜样本采集，具体采集步骤为:
48.a.样本来源为鼻黏膜正常的健康成人，年龄为20至60岁，采集鼻黏膜前患者应排除hiv、梅毒及呼吸道病毒等传染病。取鼻黏膜前三天，修剪鼻毛并用氯霉素滴鼻进行鼻腔准备。
49.b.鼻腔准备三天后，对患者鼻腔全面清洗并消毒，用丁卡因与生理盐水的比值1.2％-1.5％的棉片用状镊塞入病员鼻腔中进行局部麻醉，麻醉2次，每次5-8min。
50.c.麻醉完全后使用筛窦咬钳取鼻腔特殊部位组织，将夹取的嗅黏膜放入专用嗅黏膜保存液中，充分混匀后送入实验室培养。
51.3.人嗅黏膜间充质干细胞的分离纯化，具体步骤为：
52.a.将鼻黏膜从试管放置于培养皿上，用青霉素与生理盐水配比1比1清洗3遍，直至血迹清洗干净。
53.b.用无菌眼科剪将洗净的鼻黏膜剪成约1mm3大小的组织块，并将剪碎的组织块与配置的无血清培养基充分混合种植于细胞培养瓶，置于37℃，5％co2的培养箱中培养。
54.c.7天后组织块周围可见杂细胞爬出，组织块反复重新贴壁直至om-mscs爬出，每3天更换一次无血清培养基。待细胞融合达到70％时，予以传代培养，记作p1。
55.4.人嗅黏膜间充质干细胞的培养与扩增，具体步骤为：培养的细胞融合度为80％时，去除上清，添加胰酶消化充分，按照1∶2的体积比添加无血清胰酶终止液充分混匀，收集
细胞悬液，以1000rpmin，5min离心，收集沉淀，用无血清冻存液重悬在新的培养瓶上，记相应代数。重复上述操作，培养至p4待用。
56.5.人嗅黏膜间充质干细胞的储存与复苏，具体步骤为：
57.a.获得的p0-p4代的细胞均可以去除上清，添加胰酶消化充分，按照1∶2的比例添加无血清胰酶终止液充分混匀，收集细胞悬液，以rpm离心，收集沉淀，重悬在无血清冻存液中，细胞浓度为1
×
106/ml。经过4℃冷藏1h，-20℃冷冻4h后，转移至液氮上层，过夜后转移至液氮下层，以储存人嗅黏膜间充质干细胞。
58.b.液氮冻存的人嗅黏膜间充质干细胞，采用37℃水浴快速复温，融化的细胞悬液添加至10ml无血清培养基中，离心1000转/min离心后收集沉淀，用无血清培养基重悬到新的培养皿中，以复苏人嗅黏膜间充质干细胞。
59.6.人嗅黏膜间充质干细胞的鉴定，具体步骤为：
60.a.采用上述相同步骤，将其中无血清培养基替换为dmem/f12培养基加10％胎牛血清后，获取p4代人嗅黏膜间充质干细胞(10％fbs培养om-mscs)，并与采用上述发明获得的p4代全程无血清培养的人嗅黏膜间充质干细胞(全程无血清培养om-mscs)进行对比。如图1所示，两种培养基培养的人om-mscs在光镜下均为梭型，呈螺旋状生长。
61.b.利用流式细胞仪鉴定om-msc细胞表型，包括：普通间充质干细胞标志物：cd34，cd45，cd73，cd90，cd105，om-msc特殊标志物。如图2所示，两种培养基培养的人om-mscs均表达cd73，cd90，cd105及om-msc特殊标志物，低表达cd34，cd45。并且全程无血清培养的p4代om-mscs表达cd73、cd90明显高于血清培养om-mscs。
62.c.取p4代细胞，加入成脂、成骨及成软骨分化诱导剂后，培养足够天数后分别进行油红o，茜素红及阿尔辛蓝染。如图3所示两种培养基培养的人om-mscs均能向脂肪、骨及软骨分化。
63.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
技术特征：
1.一种培养人嗅黏膜间充质干细胞的试剂盒，其特征在于，包括独立包装的无血清培养基、无血清胰酶终止液和无血清冻存液；所述无血清培养基以dmem/f12为基础培养基，还包括谷氨酰胺600μg/ml、hepes 2nm、丙酮酸钠60μg/ml、层粘蛋白50μg/ml、氢化可的松1μg/ml、人重组白蛋白1mg/ml、重组人胰岛素20μg/ml、重组人转铁蛋白0.5ng/ml、β-甘油磷酸4mg/ml、胆固醇5μg/ml、生物素20μg/ml、肝素钠4iu/ml、维生素b1210μg/ml、维生素e10μg/ml、维生素c 50μg/ml、体积百分含量为5％的干细胞营养液、成纤维细胞生长因子20ng/ml、gm-csf 10ng/ml、egf 20ng/ml和β-fgf 20ng/ml；所述无血清胰酶终止液包括pbs缓冲液和抑肽酶溶液20μg/ml；所述无血清冻存液包括以下体积百分含量的成分：dmso 10％、白蛋白溶液30％、右旋糖酐40葡萄糖注射液20％、复方电解质注射液20％和葡萄糖氯化钠注射液20％。2.一种人嗅黏膜充间质干细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：将采集的人嗅黏膜样本清洗后剪碎，与权利要求1所述试剂盒中的无血清培养基混合培养，纯化出人嗅黏膜充间质干细胞，得p0代细胞；将p0代细胞培养至70～80％融合度时，用胰酶消化，利用权利要求1所述试剂盒中的无血清胰酶终止液终止，离心后用所述无血清培养基重悬沉淀，得p1代细胞；利用所述p1代细胞进行与p1代相同的操作，进行代数扩增；将获得的细胞在所述离心后，利用权利要求1所述试剂盒中的无血清冻存液进行重悬，而后进行冻存。3.根据权利要求2所述培养方法，其特征在于，所述人嗅黏膜样本采集自上鼻甲及中鼻甲靠上部外侧黏膜组织。4.根据权利要求2所述培养方法，其特征在于，所述清洗包括将采集的嗅黏膜样本用青霉素和生理盐水的混合溶液清洗3遍；所述青霉素和生理盐水的体积比为1:1。5.根据权利要求2所述培养方法，其特征在于，采用组织块反复重新贴壁的方法纯化出人嗅黏膜充间质干细胞；在纯化出所述人嗅黏膜充间质干细胞后，还包括每3天更换一次所述无血清培养基。6.根据权利要求2所述培养方法，其特征在于，所述冻存包括，依次经4℃冷藏1h，-20℃冷冻4h，转移至液氮上层，8～12h后转移至液氮下层。7.根据权利要求2或6所述培养方法，其特征在于，对经所述冻存后的人嗅黏膜充间质干细胞进行复苏，包括：采用37℃水浴复温，融化的细胞悬液与所述无血清培养基混合，离心收集沉淀，用无血清冻存液重悬。8.根据权利要求7所述培养方法，其特征在于，所述离心的转速为1000rpm，时间为5min。9.利用权利要求2～8任一项所述培养方法培养得到的人嗅黏膜充间质干细胞在获得成骨、成脂或成软骨细胞中的应用。
技术总结
本发明提供了一种培养人嗅黏膜间充质干细胞的试剂盒及培养方法，涉及细胞培养技术领域。本发明所述试剂盒提供了全套无血清的试剂，可保证人嗅黏膜间充质干细胞全程无血清分离纯化、培养扩增、储存与复苏。本方法采用全程无血清方法处理人嗅黏膜间充质干细胞，在形态、纯度以及分化能力上与10％胎牛血清培养的人嗅黏膜间充质干细胞无明显差异。人嗅黏膜间充质干细胞无明显差异。人嗅黏膜间充质干细胞无明显差异。
