一种体外诱导IPS细胞分化生成人胰岛β细胞的方法与流程
一种体外诱导ips细胞分化生成人胰岛
β
细胞的方法
技术领域
1.本发明涉及生物工程技术领域，具体为一种体外诱导ips细胞分化生成人胰岛β细胞的方法。
背景技术：
2.胰岛β细胞一般指胰岛b细胞，胰岛b细胞属于胰岛细胞的一种，属内分泌细胞，约占胰岛细胞总数的70％，主要位于胰岛中央部，能分泌胰岛素，起调节血糖含量的作用。胰岛b细胞功能受损，胰岛素分泌绝对或相对不足，从而引发糖尿病。通过移植从脑死亡器官捐献者的胰腺中分离的β细胞，可以恢复糖尿病患者的胰岛素分泌。然而，这种方法并没有被广泛引入，因为需要来自至少两个供体的细胞来治愈一个糖尿病患者。
3.长期以来，人们一直在尝试从干细胞中产生功能性β细胞，多潜能干细胞是一种具有自我复制能力且在一定条件下可以分化成多种靶向功能细胞的干细胞，多潜能干细胞的使用，已经逐渐成为人们寻胰岛β细胞替代物的新资源。然而，尽管多潜能干细胞能够解决供体细胞数量问题，但是在应用前还需要先将其诱导分化为功能性的胰岛素分泌细胞。因此，如何有效的实现ips细胞定向诱导分化为胰岛β细胞是重要的研究课题。
技术实现要素：
4.针对上述情况，为弥补上述现有缺陷，本发明提供了一种适合ips细胞定向培养的培养基，从而保证ips细胞高效定向分化成胰岛β细胞的体外诱导ips细胞分化生成人胰岛β细胞的方法。
5.本发明提供如下的技术方案：本发明提出的一种体外诱导ips细胞分化生成人胰岛β细胞的方法，具体包括下列步骤：
6.(1)准备ips细胞、培养基和诱导分化剂，所述培养基包括培养基a、培养基b、培养基c和培养基d，所述诱导分化剂包括诱导分化剂a、诱导分化剂b、诱导分化剂c和诱导分化剂d；
7.(2)向培养基a中加入诱导分化剂a，将ips细胞置于培养基a中，在体积百分含量为30℃、5％co2的培养箱内培养，培养2天后，弃去未贴壁细胞，得到细胞a；
8.(3)向培养基b中加入诱导分化剂b进行培养，将细胞a置于培养基b中，培养3天，得到分化细胞b；
9.(4)向培养基c中加入诱导分化剂c进行培养，将分化细胞b置于培养基c中，培养6天，得到分化细胞c；
10.(5)向培养基d中加入诱导分化剂d进行培养，将分化细胞c置于培养基d中，培养21天，得到胰岛β细胞；
11.所述培养基a为dmem/f12基础培养基，所述培养基b为dmem/f12培养基，所述培养基c为高糖dmem培养基，所述培养基d为df12培养基。
12.进一步地，所述诱导分化剂a包括碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、糖原合成酶激酶3
抑制剂和白细胞抑制因子。
13.进一步地，所述诱导分化剂b包括碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、抗坏血酸、hgf、胰岛素-转铁蛋白-硒、乙醇胺、表皮生长因子和视黄酸。
14.进一步地，所述诱导分化剂c包括碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、抗坏血酸、hgf、胰岛素-转铁蛋白-硒、乙醇胺、表皮生长因子、视黄酸、活化素a、三碘甲状腺原氨酸(t3)、alk5iii和硫酸锌。
15.进一步地，所述诱导分化剂d包括β细胞调节素、小檗碱bbr、尼克酰胺、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胰岛素-转铁蛋白-硒、乙醇胺、活化素a、三碘甲状腺原氨酸(t3)、alk5iii、硫酸锌、gsixx、毛喉素、艾塞那肽4、5羟胺和水溶性维生素e。
16.进一步地，所述ips细胞为来源于人体皮肤的ips细胞。
17.采用上述结构本发明取得的有益效果如下：本发明提出的一种体外诱导ips细胞分化生成人胰岛β细胞的方法，通过诱导分化剂与对应的培养基相配合，对ips细胞进行定向诱导分化，提高了ips细胞向胰岛β细胞的分化效率；且整个过程没有用到血清，有效的避免了动物源性病原体带来的风险，提高了临床应用的安全性。
具体实施方式
18.下面将结合本发明的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
19.一种体外诱导ips细胞分化生成人胰岛β细胞的方法，具体包括下列步骤：
20.(1)准备来源于人体皮肤的ips细胞、培养基和诱导分化剂，所述培养基包括培养基a、培养基b、培养基c和培养基d，所述诱导分化剂包括诱导分化剂a、诱导分化剂b、诱导分化剂c和诱导分化剂d；
21.(2)向培养基a中加入诱导分化剂a，将ips细胞置于培养基a中，在体积百分含量为30℃、5％co2的培养箱内培养，培养2天后，弃去未贴壁细胞，得到细胞a；
22.(3)向培养基b中加入诱导分化剂b进行培养，将细胞a置于培养基b中，培养3天，得到分化细胞b；
23.(4)向培养基c中加入诱导分化剂c进行培养，将分化细胞b置于培养基c中，培养6天，得到分化细胞c；
24.(5)向培养基d中加入诱导分化剂d进行培养，将分化细胞c置于培养基d中，培养21天，得到胰岛β细胞。
25.所述培养基a为dmem/f12基础培养基，所述诱导分化剂a包括碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、糖原合成酶激酶3抑制剂和白细胞抑制因子。
26.所述培养基b为dmem/f12培养基，所述诱导分化剂b包括碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、抗坏血酸、hgf、胰岛素-转铁蛋白-硒、乙醇胺、表皮生长因子和视黄酸。
27.所述培养基c为高糖dmem培养基，所述诱导分化剂c包括碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、抗坏血酸、hgf、胰岛素-转铁蛋白-硒、乙醇胺、表皮生长因子、视黄酸、活化素a、三碘甲状腺原氨酸(t3)、alk5iii和硫酸锌。
28.所述培养基d为df12培养基，所述诱导分化剂d包括β细胞调节素、小檗碱bbr、尼克酰胺、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胰岛素-转铁蛋白-硒、乙醇胺、活化素a、三碘甲状腺原氨酸(t3)、alk5iii、硫酸锌、gsixx、毛喉素、艾塞那肽4、5羟胺和水溶性维生素e。
29.本发明通过诱导分化剂a、诱导分化剂b、诱导分化剂c和诱导分化剂d辅助对应的培养基，能够显著提ips的诱导分化效率，促进体外分泌胰岛素细胞的成熟，通过该方法能够获得大量的、有功能的、成熟的、稳定的胰岛β细胞。
30.要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物料或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物料或者设备所固有的要素。
31.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
技术特征：
1.一种体外诱导ips细胞分化生成人胰岛β细胞的方法，其特征在于，具体包括下列步骤：(1)准备ips细胞、培养基和诱导分化剂，所述培养基包括培养基a、培养基b、培养基c和培养基d，所述诱导分化剂包括诱导分化剂a、诱导分化剂b、诱导分化剂c和诱导分化剂d；(2)向培养基a中加入诱导分化剂a，将ips细胞置于培养基a中，在体积百分含量为30℃、5％co2的培养箱内培养，培养2天后，弃去未贴壁细胞，得到细胞a；(3)向培养基b中加入诱导分化剂b进行培养，将细胞a置于培养基b中，培养3天，得到分化细胞b；(4)向培养基c中加入诱导分化剂c进行培养，将分化细胞b置于培养基c中，培养6天，得到分化细胞c；(5)向培养基d中加入诱导分化剂d进行培养，将分化细胞c置于培养基d中，培养21天，得到胰岛β细胞；所述培养基a为dmem/f12基础培养基，所述培养基b为dmem/f12培养基，所述培养基c为高糖dmem培养基，所述培养基d为df12培养基。2.根据权利要求1所述的一种体外诱导ips细胞分化生成人胰岛β细胞的方法，其特征在于，所述诱导分化剂a包括碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、糖原合成酶激酶3抑制剂和白细胞抑制因子。3.根据权利要求2所述的一种体外诱导ips细胞分化生成人胰岛β细胞的方法，其特征在于，所述诱导分化剂b包括碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、抗坏血酸、hgf、胰岛素-转铁蛋白-硒、乙醇胺、表皮生长因子和视黄酸。4.根据权利要求3所述的一种体外诱导ips细胞分化生成人胰岛β细胞的方法，其特征在于，所述诱导分化剂c包括碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、抗坏血酸、hgf、胰岛素-转铁蛋白-硒、乙醇胺、表皮生长因子、视黄酸、活化素a、三碘甲状腺原氨酸(t3)、alk5iii和硫酸锌。5.根据权利要求4所述的一种体外诱导ips细胞分化生成人胰岛β细胞的方法，其特征在于，所述诱导分化剂d包括β细胞调节素、小檗碱bbr、尼克酰胺、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胰岛素-转铁蛋白-硒、乙醇胺、活化素a、三碘甲状腺原氨酸(t3)、alk5iii、硫酸锌、gsixx、毛喉素、艾塞那肽4、5羟胺和水溶性维生素。6.根据权利要求1所述的一种体外诱导ips细胞分化生成人胰岛β细胞的方法，其特征在于，所述ips细胞为来源于人体皮肤的ips细胞。
技术总结
本发明公开了一种体外诱导IPS细胞分化生成人胰岛β细胞的方法，具体包括下列步骤：(1)准备IPS细胞、培养基和诱导分化剂；(2)培养基A和诱导分化剂A诱导分化，得到细胞A；(3)培养基B和诱导分化剂B诱导分化，得到细胞B；(4)培养基C和诱导分化剂C诱导分化，得到细胞C；(5)培养基D和诱导分化剂D诱导分化，得到胰岛β细胞。本发明涉及生物工程技术领域，具体提供了一种适合IPS细胞定向培养的培养基，从而保证IPS细胞高效定向分化成胰岛β细胞的体外诱导IPS细胞分化生成人胰岛β细胞的方法。IPS细胞分化生成人胰岛β细胞的方法。
