一种用于促进骨-软骨修复的复合水凝胶支架及其制备方法和应用
1.本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种用于促进骨-软骨修复的复合水凝胶支架及其制备方法和应用。
背景技术：
2.关节软骨缺损是全球导致残疾的主要原因之一。据统计，全球大概有3.55亿人患有关节疾病，60岁以上人的患病率更是高达50％。国内的发病率也逐年增高，并呈年轻化趋势，给家庭和个人造成了巨大的痛苦和经济负担。关节软骨是一种缺乏血管、淋巴和神经的高度分化的致密结缔组织，一旦损伤就很难自身修复。目前临床常用方法有：
①
外科常规疗法，主要适用于初期的关节软骨损伤。
②
微骨折法，通过在关节软骨缺损下的骨组织上钻孔释放骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells，bmscs)进行修复，修复后生成纤维软骨而非天然软骨，其耐磨性差。
③
手术移植法，虽是软骨损伤的有效途径，但限于自体骨源及异体骨的免疫排斥，难以大面积推广。综上所述，现有的方法存在诸多弊端，无法实现软骨缺损的有效。
3.软骨组织工程的发展为软骨缺损提供了新的途径。软骨组织自上而下由透明软骨层、钙化软骨层及软骨下骨层构成，在透明软骨层与钙化层交界处有一潮线结构，其主要作用是将相对较软的关节软骨组织与相对坚硬的钙化软骨连接在一起，在钙化软骨层的下方是软骨下骨平台，两层之间交错结合锚定，交界处形成的结构又被称作水泥线。关节软骨和软骨下骨共同组成了一个既相互依存又互相作用、既独立又统一的复合功能单元。全层软骨损伤时，由于特殊的解剖关系往往合并软骨下骨的损伤，因此软骨修复常常以骨和软骨缺损的共同修复为主。当前软骨组织工程主要围绕结构、功能及损伤修复之间的关系开展研究，通过结构仿生及理论模拟来揭示三者之间的相互作用关系。
4.随着软骨组织工程的发展，本领域的研究人员已经研发出多种的骨-软骨修复凝胶支架，例如，发明专利cn111773435b公开了一种用于关节软骨修复的双交联一体化无缝复合水凝胶支架，其在凝胶支架中间添加了聚电解质复合水凝胶膜层，实现了对软骨和软骨下骨微环境的隔离效应；发明专利cn111419479b公开了一种用于髋关节软骨修复的复合支架及其制备方法，复合支架遇到体内组织微环境的体液后，支架中的多孔镁成分氧化产生氢气，产生的气体受表面陶瓷膜的限制无法立即扩散，在局部形成气膜，形成稳定的隔离层，将成骨微环境与软骨微环境隔离开来，防止下方的成骨微环境中细胞、细胞因子进入软骨微环境，阻止软骨骨化发生，有效保持了软骨微环境的稳定，适用于大面积软骨修复，修复面积直径大于1厘米。发明专利cn108478871b公开了一体化骨-软骨修复支架及其制备方法，其中的修复支架能阻止血管侵入软骨层，提高骨层与软骨层之间连接的紧密性与稳定性，实现二者的生物结合，达到良好的修复效果。但是，上述制备的支架，还是无法最大程度的达到仿生的效果。
5.针对现有技术的不足，本发明提供了一种用于促进骨-软骨修复的复合水凝胶支
架，由下至上依次为软骨下骨层、钙化界面层和软骨层；各层的结构显著区别开。
技术实现要素：
6.本发明的首要目的在于为改善骨软骨缺损后修复困难，手段单一且愈合效果不佳等问题，创造性地发明了一种基于3d打印技术快速、批量化、规模化、个性化制作促进骨-软骨修复的复合水凝胶支架。
7.为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一种用于促进骨-软骨修复的复合水凝胶支架，由下至上依次为软骨下骨层、钙化界面层和软骨层；
8.所述的软骨下骨层为含有核酸适配体和羟基磷灰石的水凝胶；
9.所述的钙化界面层为水凝胶；
10.所述的软骨层为含有生化因子的水凝胶；
11.所述的水凝胶由海藻酸钠、丙烯酰胺、过硫酸铵和n'n-亚甲基双丙烯酰胺制备得到。
12.优选的，所述的羟基磷灰石为接枝双键的羟基磷灰石纤维，终浓度为30％～80％；其中羟基磷灰石纤维接枝双键的过程如下：
13.(1)配制体积比为9：1的乙醇溶液，并用醋酸缓冲液调节ph至4.0备用；
14.(2)在步骤(1)所得溶液中加入体积分数为5％的硅烷偶联剂kh570，室温下降解30min；
15.(3)在步骤(2)所得溶液中加入质量分数为40％的羟基磷灰石纤维，超声分散10min；
16.(4)步骤(3)所得的溶液在65℃水浴搅拌2h后，用步骤(1)所得溶液洗涤后烘箱干燥过夜。
17.优选的，所述的接枝双键的羟基磷灰石纤维的终浓度为40％～70％
18.优选的，所述的生化因子为sdf-1、pdgf、mcp-1、il-8、mip、tgf-β超家族、igf、vegf、fgf、hgf、egf、prp、epo、功能性多肽、外泌体中的一种或几种，所述的生化因子载入到缓释微球中。
19.优选的，所述的核酸适配体为核酸适配体hm69或核酸适配体apt19s。
20.优选的，所述的海藻酸钠和丙烯酰胺的比例为1～10：2～20溶解，海藻酸钠终浓度为1.5％～15％，所述的过硫酸铵终浓度为0.4～4.0wt％，所述的n'n-亚甲基双丙烯酰胺浓度为丙烯酰胺的6～60
‰
。
21.本发明的第二目的在于提供所述的复合水凝胶支架的制备方法，包括如下步骤：
22.(1)制备软骨下骨层水凝胶：将海藻酸钠和丙烯酰胺按照比例溶解于去离子水中；加入过硫酸铵和n'n-亚甲基双丙烯酰胺，避光搅拌；再加入接枝双键的羟基磷灰石纤维，避光搅拌过夜；
23.(2)制备钙化界面层水凝胶：将海藻酸钠和丙烯酰胺按照比例溶解于去离子水中；加入过硫酸铵和n'n-亚甲基双丙烯酰胺，避光搅拌；
24.(3)制备软骨层水凝胶：将海藻酸钠和丙烯酰胺按照比例溶解于去离子水中；加入过硫酸铵和n'n-亚甲基双丙烯酰胺，避光搅拌；再加入载生化因子缓释微球，避光搅拌；
25.(4)制备复合水凝胶支架：将步骤(1)、(2)和(3)制备得到的水凝胶按照顺序分别
装入3个3d打印料筒中，3d打印机按照预定参数打印；
26.(5)步骤(4)得到的复合水凝胶支架置于波长范围在10～380nm的uv灯下光照10～100min；浸泡于浓度为2～20mg/ml钙离子溶液中，过夜，即得。
27.优选的，步骤(4)所述的打印过程中使用电子喷雾装置进行初级网络交联。
28.优选的，步骤(4)所述的3d打印机为挤压式3d打印机。
29.本发明的第三目的在于提供所述的复合水凝胶支架在制备骨-软骨修复材料中的应用。
30.本发明具有以下有益效果：(1)本发明采用3d打印技术制作分层、梯度、功能化仿生软骨水凝胶，具有经济高效、操作简单、模式灵活、个性化等优点。(2)所制备的复合水凝胶支架的双网络结构由海藻酸钠和丙烯酰胺共同提供，丙烯酰胺提供初级网络支撑结构，海藻酸钠为功能化的修饰提供附着及终网络支撑结构，双键修饰羟基磷灰石纤维用以增加材料的物理性能及促进干细胞分化，核酸适配体用以募集干细胞，微球包裹的生化因子用以促进干细胞的分化、为干细胞迁移提供方向，它们共同作用以促进骨软骨缺损原位诱导再生。(3)本发明所述的复合水凝胶支架改善了骨软骨修复材料愈合性差，异源干细胞应用导致的免疫排斥反应等问题，具有良好的生物相容性，能够有效地促进骨软骨缺损原位诱导再生。
附图说明
31.图13d打印hs69支架照片
32.图2不同实施例制备的复合水凝胶支架的力学性能分析图
33.图3hs69复合水凝胶支架的扫描电镜图
34.图4骨软骨缺损修复大体表现与micro-ct三维重建图
35.图5不同实施例制备的复合水凝胶支架骨软骨愈合组织化学图
36.图6不同实施例制备的复合水凝胶支架骨软骨愈合免疫荧光组化图
具体实施方式
37.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
38.以下实施例中所述的.stl格式是在计算机图形应用系统中，用于表示三角形网格的一种文件格式。它的文件格式非常简单，应用很广泛。stl是最多快速原型系统所应用的标准文件类型。stl是用三角网格来表现3d cad模型。
39.以下实施例中所述的3d studio max，常简称为3ds max或max，是discreet公司开发的(后被autodesk公司合并)基于pc系统的三维动画渲染和制作软件。其前身是基于dos操作系统的3d studio系列软件。
40.本发明提供的分层、梯度、功能化仿生软骨水凝胶，以质量为基准，3d打印墨水里水：海藻酸钠：丙烯酰胺：接枝双键的羟基磷灰石的比例为：(100～1000):(1～30):(2～60):(30～800)。
41.原位诱导组织再生是利用宿主自身再生修复的潜能，通过对支架的生物物理和生化线索进行功能化设计，以调节细胞外微环境或驱动细胞重编程来诱导组织的再生。原位诱导组织再生的优势主要体现在：
①
不引入外源细胞，原位捕获自体细胞；
②
不经过体外培养，诱导自体细胞的增殖和分化；
③
利用支架的微环境，诱导干细胞的分化，实现缺损组织的再生。因此原位诱导组织再生可以解决外源干细胞应用所带来的上述问题，加之3d打印的技术优势，可实现软骨组织快速、低成本、个性化及规模化的制备，为其向临床应用转化创造了有利的条件。
42.以下实施例中，使用的核酸适配体为核酸适配体hm69，购自金斯瑞。
43.实施例1：一种用于促进骨-软骨修复的复合水凝胶支架(hs69水凝胶)的合成
44.(1)将质量分数为6％的丙烯酰胺(6.0g)、0.4％的过硫酸铵(0.4g)和丙烯酰胺质量6
‰
的n'n-亚甲基双丙烯酰胺(0.036g)溶解于100ml去离子水中，避光搅拌30分钟，得到初级水凝胶溶液；
45.(2)在步骤(1)所得溶液中加入质量分数为3％的海藻酸钠(3.0g)，避光搅拌12小时，得到混合物1；
46.(3)在步骤(2)所得溶液中加入载sdf-1的缓释微球(10g)，避光搅拌6小时，得到混合物2；
47.(4)将hm69(250nmol)接枝于步骤(2)所得溶液中，避光搅拌12小时，得到混合物3；
48.(5)在步骤(2)所得溶液加入6g接枝双键的羟基磷灰石，避光搅拌12小时，得到混合物4，在步骤(4)所得溶液中加入21g接枝双键的羟基磷灰石，避光搅拌12小时，得到混合物5；
49.(6)将步骤(4)，(5)所得混合物装入3d打印料筒中，3d打印机进行逐层打印，所述3d打印内容为1个30mm
×
30mm的平板，平板打印内容为6层机械层与引导长轴相互垂直，层内纤维间距为2.5mm，其中步骤混合物5为最底2层，混合物4为中间2层，混合物2为最上2层；
50.(7)打印过程中使用2％氯化钙溶液对水凝胶网络进行初级网络交联；
51.(8)打印完成后将步骤(7)所得样品再次置于的波长为285nm的uv灯下光照10分钟；
52.(9)将步骤(8)制得水凝胶浸泡于2％氯化钙溶液中，过夜保存。
53.实施例2：一种用于促进骨-软骨修复的复合水凝胶支架(hs69水凝胶)的合成
54.该实施例与实施例1相同，不同之处在于：步骤(1)制备的初级水凝胶溶液中丙烯酰胺的浓度为12％，过硫酸铵浓度为2％，n'n-亚甲基双丙烯酰胺浓度为丙烯酰胺浓度的30
‰
。
55.实施例3：一种用于促进骨-软骨修复的复合水凝胶支架(hs69水凝胶)的合成
56.该实施例与实施例1相同，不同之处在于：步骤(2)制备的混合物1中海藻酸钠的浓度为6％。
57.实施例4：一种用于促进骨-软骨修复的复合水凝胶支架的合成
58.该实施例与实施例1相同，不同之处在于：将步骤(3)中载sdf-1的缓释微球替换为载pdgf的微球(10g)。
59.实施例5：一种用于促进骨-软骨修复的复合水凝胶支架的合成
60.该实施例与实施例1相同，不同之处在于：将步骤(4)接枝核酸适配体hm69替换为
核酸适配体apt19s(250nmol)。
61.实施例6：双网络水凝胶(dn)的合成
62.该实施例与实施例1相同，不同之处在于：无步骤(3)、(4)、(5)，步骤(6)打印的混合物仅为混合物1。
63.实施例7：含有生化因子的双网络水凝胶(s-dn)的合成
64.该实施例与实施例1相同，不同之处在于：无步骤(4)、(5)，步骤(6)打印的混合物为混合物1和混合物2，其中混合物1为底下4层，混合物2为最上2层。
65.实施例8：含核酸适配体的水凝胶(69-dn)的合成
66.该实施例与实施例1相同，不同之处在于：无步骤(3)、(5)，步骤(6)打印的混合物为混合物1和混合物3，其中混合物3为最下2层，混合物1为上面4层。
67.实施例9：含羟基磷灰石的水凝胶(h-dn)的合成
68.该实施例与实施例1相同，不同之处在于：无步骤(3)、(4)，步骤(5)中2种含量的双键接枝的羟基磷灰石均加入步骤(2)所得溶液，得到混合物4和混合物6，步骤(6)打印的混合物是混合物1、混合物4和混合物6，其中混合物6为最下2层，混合物4为中间2层，混合物1为最上2层。
69.实施例10：含羟基磷灰石和核酸适配体的水凝胶(h69-dn)的合成
70.该实施例与实施例1相同，不同之处在于：无步骤(3)，步骤(6)打印的混合物是混合物1、混合物4和混合物5，其中混合物5为最下2层，混合物4为中间2层，混合物1为最上2层。
71.实施例11：含生化因子和羟基磷灰石的水凝胶(hs)的合成
72.该实施例与实施例1相同，不同之处在于：无步骤(4)，步骤(5)中双键接枝的羟基磷灰石仅加入步骤(2)所得溶液，步骤(6)打印的混合物是混合物2、混合物4和混合物6，其中混合物6为最下2层，混合物4为中间2层，混合物2为最上2层。
73.实施例12：含生化因子和核酸适配体的水凝胶(s69)的合成
74.该实施例与实施例1相同，不同之处在于：无步骤(4)，步骤(6)打印的混合物是混合物1、混合物2和混合物3，其中混合物3为最下2层，混合物1为中间2层，混合物2为最上2层。
75.实验例1：用于促进骨-软骨修复的复合水凝胶支架的力学及表征分析
76.本实施例将实施例1、实施例6-11中的hs69，dn，s-dn，69-dn，h-dn，h69-dn，hs，s69作为实施对象，用于以下实验。
77.(1)实验方法如下：
78.本实验通过通用材料测试机以10mm/min的速度，对形状为长方体，体积大小为80mm
×
25mm
×
1mm的上述实验组进行了拉伸性能的测试；对形状为圆柱体，体积大小为π
×
(5mm)2×
10mm的上述实验组进行了抗压强度的分析；并通过扫描电镜对hs69支架进行表征分析其分层结构。
79.(2)实验结果：
80.如图1所示3d打印hs69支架照片。从左到右分别为hs69水凝胶支架对应样品在脱离支撑和弯曲的状态，最下则为hs69支架的侧视图图像。
81.如图2所示hs69水凝胶有着明显的三层结构，图2a为hs69水凝胶支架表面孔隙，图
2e为hs69水凝胶横截面显示的3层梯度结构，图2b、f为hs69水凝胶支架最表面的一层，可见含生长因子的纳米球，图2c、g为hs69水凝胶支架的中间层，可见双键接枝的羟基磷灰石纤维的存在及孔隙的形成，图2d、h为hs69水凝胶支架的最下层，可见随着双键接枝的羟基磷灰石纤维的含量增大，孔隙率有所增加，这种更加规则化的排列更有利于hs69水凝胶支架抗压能力的增加。
82.如图3所示，含有羟基磷灰石的h-dn、h69-dn、hs和hs69组的抗压强度普遍高于其他组，最高可达6.5mpa，但其拉伸性能较差，仅可达0.4mpa。
83.实验例2、用于促进骨-软骨修复的复合水凝胶支架的骨软骨缺损的疗效
84.对本发明提供的促进骨软骨缺损原位诱导再生的3d打印分层、梯度、功能化仿生软骨水凝胶疗效评估。
85.受试对象：spf级雄兔，平均体重2kg，购于兰州大学生物医学实验中心，应用钻孔法建立兔骨软骨缺损模型，建模成功后在兔后腿关节处制备一个直径4.0mm，深度3.0mm的骨软骨缺损，并植入打印的支架。
86.实验分组：将建立的骨软骨缺损兔按方式分为(1)hs69；(2)dn；(3)s-dn；(4)69-dn；(5)h-dn；(6)h69-dn；(7)hs；(8)s69；(9)control等每组各三只。
87.方案：control组不予任何处理，组分别使用本发明实施例1～实施例8的3d打印水凝胶处理，周期为6周、12周。
88.疗效评价：分别于后6周、12周观察愈合情况。6周、12周后处死兔，取组织样本，后对样本进行micro-ct分析，后固定、脱钙、包埋、切片，行h&e、番红o/固绿染、阿利新蓝染、免疫荧光组化染，观察各组骨软骨组织缺损部位的愈合情况。
89.实验结果：
90.如图4所示，大体观hs69组的骨软骨缺损愈合程度明显优于另外八组，三维重建显示所有样本的表面都没有被磨损，二维重建图像显示6周时所有组缺损部位呈低密度影，12周时hs69组呈现完整的高密度影，说明hs69组的修复效果优于其他组。如图5所示，h&e染显示结果与大体观结果基本相同，6周所有组的纤维和未成熟组织为主要成分，显示了有限的修复。组织学上，12周组的缺损边缘为透明软骨，中心区域纤维组织较少，比6周组较好，这表明随着时间的推移，软骨样组织的成熟度明显增加。番红o/固绿染显示hs69组透明软骨样细胞在浅表区排列有序，并与表面平行。阿利新蓝染显示hs69组软骨细胞成熟，且软骨蛋白多糖增多。如图6所示，通过免疫荧光组化染评价骨软骨缺损修复效果，在6周时hs69组表现出acan、col2、col1、runx2表达上调，说明骨软骨修复正在进行，且在12周时，acan、col2、col1、runx2表达均高于其他组，说明骨软骨修复程度最高，骨和软骨细胞外基质合成增加，提示hs69对骨软骨缺损修复具有持久作用。
91.本发明公开了一种基于3d打印技术制备的分层、梯度、功能化仿生软骨水凝胶，并用于促进骨软骨缺损原位诱导再生，是海藻酸钠、丙烯酰胺、双键接枝的羟基磷灰石、载生化因子的缓释微球，核酸适配体混合溶液先通过3d打印和电子喷雾器预交联，然后再浸泡钙离子溶液交联形成的复合材料，并提供了其制备方法和应用。本发明的有益效果为：本发明采用3d打印技术制作的分层、梯度、功能化仿生软骨水凝胶，大大降低了传统支架在制备过程中模式单一，人工成本高等问题，具有经济高效、操作简单、模式灵活、个性化等优点。同时本发明基于3d打印制备的分层、梯度、功能化仿生软骨水凝胶，也解决了传统软骨制备
过程中步骤繁琐，水凝胶中的分散性差等问题，除此之外，合成的分层、梯度、功能化仿生软骨水凝胶具有良好的生物相容性，促进骨软骨缺损原位诱导再生等作用。故本发明常温下3d打印分层、梯度、功能化仿生软骨水凝胶对于仿生软骨支架水凝胶批量化、规模化生产提供了可能并探索了一套最简便、省时的工艺流程。
92.最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
技术特征：
1.一种用于促进骨-软骨修复的复合水凝胶支架，其特征在于，由下至上依次为软骨下骨层、钙化界面层和软骨层；所述的软骨下骨层为含有核酸适配体和羟基磷灰石的水凝胶；所述的钙化界面层为水凝胶；所述的软骨层为含有生化因子的水凝胶；所述的水凝胶由海藻酸钠、丙烯酰胺、过硫酸铵和n'n-亚甲基双丙烯酰胺制备得到。2.如权利要求1所述的复合水凝胶支架，其特征在于，所述的羟基磷灰石为接枝双键的羟基磷灰石纤维，终浓度为30％～80％；其中羟基磷灰石纤维接枝双键的过程如下：(1)配制体积比为9：1的乙醇溶液，并用醋酸缓冲液调节ph至4.0备用；(2)在步骤(1)所得溶液中加入体积分数为5％的硅烷偶联剂kh570，室温下降解30min；(3)在步骤(2)所得溶液中加入质量分数为40％的羟基磷灰石纤维，超声分散10min；(4)步骤(3)所得的溶液在65℃水浴搅拌2h后，用步骤(1)所得溶液洗涤后烘箱干燥过夜。3.如权利要求1所述的复合水凝胶支架，其特征在于，所述的生化因子为sdf-1、pdgf、mcp-1、il-8、mip、tgf-β超家族、igf、vegf、fgf、hgf、egf、prp、epo、功能性多肽、外泌体中的一种或几种，再将所述的生化因子载入到缓释微球中。4.如权利要求1所述的复合水凝胶支架，其特征在于，所述的海藻酸钠和丙烯酰胺的比例为1～10：2～20溶解，海藻酸钠终浓度为1.5％～15％，所述的过硫酸铵终浓度为0.4～4.0wt％，所述的n'n-亚甲基双丙烯酰胺浓度为丙烯酰胺的6～60
‰
。5.如权利要求1所述的复合水凝胶支架，其特征在于，所述的核酸适配体为hm69或apt19s。(我们使用的是核酸适配体hm69，购自金斯瑞，还可使用具有捕获细胞特性的apt19s等其他核酸适配体)。6.如权利要求1所述的复合水凝胶支架的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)制备软骨下骨层水凝胶：将海藻酸钠和丙烯酰胺按照比例溶解于去离子水中；加入过硫酸铵和n'n-亚甲基双丙烯酰胺，避光搅拌；再加入接枝双键的羟基磷灰石纤维，避光搅拌过夜；(2)制备钙化界面层水凝胶：将海藻酸钠和丙烯酰胺按照比例溶解于去离子水中；加入过硫酸铵和n'n-亚甲基双丙烯酰胺，避光搅拌；(3)制备软骨层水凝胶：将海藻酸钠和丙烯酰胺按照比例溶解于去离子水中；加入过硫酸铵和n'n-亚甲基双丙烯酰胺，避光搅拌；再加入载生化因子缓释微球，避光搅拌；(4)制备复合水凝胶支架：将步骤(1)、(2)和(3)制备得到的水凝胶按照顺序分别装入3个3d打印料筒中，3d打印机按照预定参数打印；(5)步骤(4)得到的复合水凝胶支架置于波长范围在10～380nm的uv灯下光照10～100min；浸泡于浓度为2～20mg/ml钙离子溶液中，过夜，即得。7.如权利要求6所述的复合水凝胶支架的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述的打印过程中使用电子喷雾装置进行初级网络交联。8.如权利要求6所述的复合水凝胶支架的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述的3d打印机为挤压式3d打印机。9.如权利要求1-5任一项所述的复合水凝胶支架在制备骨-软骨修复材料中的应用。
技术总结
本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种用于促进骨-软骨修复的复合水凝胶支架及其制备方法和应用，包括由下至上依次为软骨下骨层、钙化界面层和软骨层；软骨下骨层为含有核酸适配体和羟基磷灰石的水凝胶；钙化界面层为水凝胶；软骨层为含有生化因子的水凝胶；水凝胶由海藻酸钠、丙烯酰胺、过硫酸铵和'-亚甲基双丙烯酰胺制备得到，其中，丙烯酰胺提供初级网络支撑结构，海藻酸钠提供附着及终网络支撑结构，双键修饰羟基磷灰石纤维用以增加材料的物理性能及促进干细胞分化，核酸适配体用以募集干细胞，微球包裹的生化因子用以促进干细胞的分化、为干细胞迁移提供方向，具有良好的生物相容性，能够有效地促进骨软骨缺损原位诱导再生。导再生。导再生。
