一种豌豆III型抗性淀粉制备方法
一种豌豆iii型抗性淀粉制备方法
技术领域
1.本发明涉及食品加工领域，具体涉及一种豌豆iii型抗性淀粉制备方法。
背景技术：
2.目前随着抗性淀粉研究的深入，国外已有iii型抗性淀粉产品问世，如美国的hi-maize260玉米抗性淀粉产品和novelose抗性淀粉产品，美国的mgp公司推出非转基因小麦抗性淀fiberstar70tm，总膳食纤维含量最少为70%，可用于制备各种低碳水化合物高蛋白美味食品，英国的crystalean产品等。iii型抗性淀粉由于良好的热加工耐受性占据了抗性淀粉市场一半以上的市场份额，而我国的iii型抗性淀粉目前还没有正式的商品出现。
3.cn103918872a公开了大米抗性淀粉制备生产方法，首先对大米淀粉进行糊化、脱支、结晶处理，然后对提取的大米抗性淀粉进行干燥得到大米抗性淀粉，通过脱支处理提高大米淀粉中直链淀粉的含量：控制糊化后的大米淀粉浓度在20%～50%，脱支酶添加量为12～25u/g，脱支温度控制在45～55
°
c，脱支时间控制在12～20小时；脱支结束之后，在2～12℃条件下结晶，然后提取大米抗性淀粉，在50～70
°
c条件下干燥。上述方法效率低、成本高，得到的抗性淀粉耐热性差。
4.cn102894289a公开了一种耐蒸煮高抗性淀粉质构米的制备方法，是以大米淀粉或米粉和改性高直链玉米淀粉为原料，通过改良挤压法加工而成强化抗性淀粉的质构米。其组成为，按质量份计，每100份质量份中大米淀粉或米粉为50—70份，其余为改性高直链玉米淀粉30—50份，产品质构米干基中抗性淀粉的质量分数为10%-25%。采用的是挤压法，需要专门的设备，抗性淀粉含量较低。
5.cn104593452a公开一种利用微波技术制备抗性淀粉的方法，(1)将原淀粉配制为淀粉乳液，用微波对淀粉预糊化；(2)将预糊化物料于适当温度和压力下压热处理；物料冷却后，用耐高温α-淀粉酶和普鲁兰酶水解淀粉至链长为20-120dp；(3)将物料平铺于平板上，4℃存放3～5h后，用微波加热物料至30～50℃，冷却至室温，重复温度循环过程2-4次，至淀粉水分含量小于14％，粉碎后过筛，得抗性淀粉a；(4)向抗性淀粉a中加入水，热处理；调ph至1.5～2，振荡反应，调ph至7～8，加胰酶酶解，过滤，滤饼用气流干燥至水分含量为14％以下，粉碎后过100目筛，得高纯度抗性淀粉b。上述方法工艺复杂，得到的抗性淀粉耐热性比较差。
6.因此，本研究旨在采用酸解协同普鲁兰酶脱支的方法制备豌豆rs3，并结合退火和压热的物理改性手段提高豌豆rs3的耐高热稳定性和抗酶解性，使豌豆rs3在加工过程中保持高水平的加工耐受性和抗消化性。
7.采用酸解协同普鲁兰酶脱支并结合退火和压热的复合方法制备豌豆rs3，切实解决了通过普通酶法（脱支酶解处理）、物理法（湿热处理）、超声波法、微波法等制备rs3中出现抗性淀粉含量低、效率低、成本高、耐热性差的问题。
技术实现要素：
8.本发明公开了一种豌豆rs3（iii型抗性淀粉）制备方法，制备方法主要包括：酸解
→
糊化
→
脱支
→
老化
→
退火或压热。采用酸解协同普鲁兰酶脱支并结合退火和压热的复合改性方法制备豌豆rs3，切实解决了通过普通酶法（脱支酶解处理）、物理法（湿热处理）、超声波法、微波法等制备rs3中出现抗性淀粉含量低、效率低、成本高、耐热性差的问题。
9.本发明目的通过以下技术方案实现：本发明提供一种豌豆rs3制备方法，其特征在于：包括（1）酸解：取豌豆淀粉，加入hcl配置成淀粉乳，升温搅拌水解4-36h后，将酸解后的淀粉乳中和至中性；（2）糊化；将淀粉乳90-120℃剧烈搅拌20-40min，完成样品糊化；（3）脱支：糊化淀粉乳冷却保持至30-60℃，加入普鲁兰酶搅拌脱支反应10-36h，灭酶后得到脱支淀粉；（4）老化：脱支后的淀粉乳冷却至20-40℃老化12-36h，离心洗涤，将下层沉淀淀粉干燥、粉碎和过筛得到豌豆rs3；（5）退火或热压：退火步骤为：将豌豆rs3配置成40-70%水分含量的淀粉乳后密封水合5-24h，烘箱70-110℃加热2-36h，室温冷却后，将样品隔夜烘干得到退火的豌豆rs3；压热步骤为：将豌豆rs3配置成10-40%水分含量的淀粉乳后密封水合5-24h，然后110-130℃压热20-180min，室温下冷却停止压热，再将样品40-60℃隔夜烘干得到压热的豌豆rs3。
10.优选的，酸解步骤中：淀粉乳浓度为20-40%重量百分比，水解温度40-60℃，水解时间为15-25h。优选的，淀粉乳浓度为25-35%重量百分比，水解温度45-55℃，水解时间为18-22h。
11.优选的，糊化步骤中：用三水合乙酸钠和乙酸将酸解后的淀粉乳配置成ph 为3-5，质量浓度为20-30%重量百分比的淀粉乳，然后升温至110-130℃剧烈搅拌20-40min完成糊化。优选的，ph 为3.5-4.5，糊化温度为115-125℃，剧烈搅拌25-35min。
12.优选的，脱支步骤中，普鲁兰酶加入量为每50g豌豆淀粉加入4-8ml 1000 npun/g普鲁兰酶。优选的，糊化淀粉乳冷却保持至40-60℃，加入普鲁兰酶搅拌脱支反应18-22h，灭酶后得到脱支淀粉；优选的，升温至121℃灭酶杀菌30min得到脱支淀粉。
13.一个诺维信普鲁兰酶单位（pun）的定义是在以下的标准条件下每分钟水解普鲁兰糖释放出带有相当于1微摩尔分子量葡萄糖还原力的还原碳水化合物的酶的数量。
14.优选的，老化步骤中：脱支后的淀粉乳冷却保持至25-35℃老化20-28h。
15.优选的，退火步骤中：将豌豆rs3配置成40-70%水分含量的淀粉乳后密封水合8-16h，然后在烘箱80-100℃条件下加热12-36小时，加热结束后在室温下冷却4-5h停止退火，再将样品40-50℃隔夜烘干得到退火的豌豆rs3。优选的，密封水合10-14h，烘箱加热18-30小时。优选的，淀粉乳水分含量可以是50%-60%，40-55%。
16.优选的，压热步骤中：将豌豆rs3配置成10-40%水分含量的淀粉乳后密封水合8-16h，然后在110-130℃高压灭菌锅中压热0.5-2h，压热结束后在室温下冷却1-3h停止压热，再将样品40-50℃隔夜烘干得到压热的豌豆rs3。优选的，密封水合10-14h，在115-125℃高
压灭菌锅中压热0.5-1h。优选的，淀粉乳水分含量可以是20-35%，25-30%。
17.本发明的一个方面，还提供上述的制备方法制备获得的豌豆抗性淀粉。
18.本发明的另一个方面，上述制备工艺获得的豌豆抗性淀粉的应用。
19.本发明为了在高固含量(30%重量百分比的淀粉乳)下进行改性，首先对豌豆淀粉采用酸解稀化处理，以防止形成阻碍有效脱支反应的牢固凝胶，该处理有利于提高生产效率。
20.本发明中，密封水合步骤具有关键作用。首先，密封的目的是防止淀粉乳中的水分蒸发。水合（8-16h）的目的是使淀粉在水中充分浸润，置于高温环境后一方面可以防止水分迅速被蒸发脱离淀粉，另一方面可以促进淀粉链重排，改善淀粉结晶和非晶态薄片结构，从而提高淀粉颗粒的稳定性并使结晶区变得更加完美。
21.本发明采用低温高湿的退火处理（水分＞40%，90℃）和高温低湿的压热处理（水分＜40%，121℃）方式使豌豆rs3淀粉链重新排列结合成了更高结晶度的a型结晶结构，结晶区被更加完善，对热处理的抵抗能力和抗酶解消化能力大幅增强，从而拓宽了豌豆rs3在食品工业开发中的应用范围，可广泛用至高温条件下加工的产品—如挤压、罐头和蒸馏产品，来改善产品的质构特性和营养价值。
22.相对于普通膳食纤维，本发明的豌豆rs3外观洁白、组织细腻、无异味，具备更好的加工适应性。
23.本发明的豌豆rs3作为一种低热量、不被消化的淀粉应用到面粉或者大米中就能降低主食类食物的热量，提高人们的健康水平。
24.本发明的豌豆rs3因持水能力低，在低湿性的焙烤食品中不会与面筋争夺水分，可以使食品质构更加疏松、口感更佳酥。
25.本发明的豌豆rs3具有益生元的特性，在肠道中可以发挥抑制致病菌生长，保护肠道健康的作用。
附图说明
26.图1 原豌豆淀粉的扫描电镜图图2 酸解后豌豆淀粉的扫描电镜图图3酸解协同普鲁兰酶脱支处理后制备的豌豆rs3的扫描电镜图图4 退火后豌豆rs3的扫描电镜图图5 压热后豌豆rs3的扫描电镜图图6 豌豆rs3的结晶结构图7 豌豆rs3的膨胀度图8 豌豆rs3的糊化特性。
具体实施方式
27.下面结合实施例，对本发明作进一步地详细说明，但本发明实施方式并不仅限于此。
28.实施例1、豌豆iii型抗性淀粉制备方法（1）酸解
精确称取50g的干基豌豆淀粉于高温反应釜中，加入116.67ml hcl（0.8m，3%）配置成质量分数为30%（w/w）的淀粉乳，然后升温至50℃，搅拌水解20h后，将酸解后的淀粉乳用naoh（4.0m）中和至中性。
29.(2) 糊化用33.6mg的三水合乙酸钠和98.7μl乙酸（分析纯）将酸解后的淀粉乳配置成ph 为4.0，质量浓度为25%（w/w）的淀粉乳，然后升温至120℃在高温反应釜中剧烈搅拌30min完成样品糊化。
30.(3) 脱支糊化淀粉乳冷却保持至50℃后加入6.5ml的普鲁兰酶（1000 npun/g）搅拌脱支反应24h，再升温至121℃灭酶杀菌30min得到脱支淀粉。
31.(4) 老化脱支后的淀粉乳冷却保持至30℃老化24h，然后离心洗涤，将下层沉淀淀粉干燥、粉碎和过筛得到豌豆rs3。
32.（5）退火或热压退火步骤为：精确称量一定量的步骤（4）得到的豌豆rs3，将其配置成60%水分含量（淀粉按干基计）的淀粉乳后密封水合12h。然后在烘箱90℃条件下加热24小时，加热结束后在室温下冷却3h停止退火，再将样品45℃隔夜烘干得到退火的豌豆rs3。
33.压热步骤为：精确称量一定量的步骤（4）得到的豌豆rs3，将其配置成20%水分含量（淀粉按干基计）的淀粉乳后密封水合12h。然后在121℃高压灭菌锅中压热1h，压热结束后在室温下冷却2h停止压热，再将样品45℃隔夜烘干得到压热的豌豆rs3。
34.实施例2、观察豌豆iii型抗性淀粉的微观结构取实施例1不同步骤处理后得到的淀粉，使用扫描电镜观察：将淀粉样品均匀涂抹在吸附条带上，用洗耳球除去粘贴不牢固的大颗粒淀粉，然后进行喷金处理。扫描条件：电压100kv，加速电压20kv。通过放大
×
100、
×
400和
×
1000的倍数来观察样品表面颗粒。
35.如图1、2所示，原豌豆淀粉酸解前后并未发生明显的颗粒形貌变化，酸解后的豌豆淀粉颗粒表面有少量细小的凹坑，并伴随部分碎屑的产生。这可能是因为淀粉中的无定形区的淀粉结构比较疏松，被酸解所致。
36.如图1、3所示，相比与原豌豆淀粉，重结晶后的淀粉颗粒形貌完全被破坏，形成了由许多微晶结构组成的团聚体。这主要是因为原豌豆淀粉经过糊化脱支之后，淀粉乳体系中的直链淀粉链溢出，淀粉链之间定向排列、相互聚拢形成了大量双螺旋微晶结构。双螺旋微晶结构是淀粉链在氢键结合作用下，定向排列形成的一种抗酶解性结构。该结构有效的掩蔽了淀粉酶与淀粉之间的作用位点，使淀粉无法被酶解。因此，双螺旋微晶结构数目越多，豌豆rs3的抗消化性越强。
37.如图4、5所示，退火和压热处理使豌豆rs3团聚体的颗粒形貌被细化，其中被细化的微晶粒再次聚集，形成了新的团聚体。这可能是由于退火和压热处理时，淀粉发生了水化，增加了淀粉无定形区域中结合不牢固的葡聚糖链的流动性，使直链淀粉分子链之间结合的概率升高，形成了更多双螺旋微晶结构。
38.实施例3、豌豆iii型抗性淀粉的结晶结构测定豌豆rs3的结晶结构：采用x-射线衍射检测，首先将待测淀粉在温度为25℃，相对湿度100%的条件下平衡20h。实验参数：特征射线 cukα，电压40kv，电流44ma，扫描范围(1
°
~45
°
)，扫描速度为 2(
°
)/min。淀粉的相对结晶度使用mdi jade 6软件计算。
39.如图6所示，原豌豆淀粉经过酸解协同酶解脱支处理之后淀粉样品的结晶型由c型转变为b+v型，结晶度被提升至49.0%；退火和压热处理使豌豆rs3的结晶型由b+v型转变为a型，结晶度进一步分别被提升至57.4%和58.6%。豌豆淀粉结晶型和结晶度的变化主要是因为这一系列处理改变了原淀粉的颗粒结构，增强了淀粉链和分子键之间的相互作用，使淀粉颗粒结构更加紧密牢固所致。
40.实施例4、豌豆iii型抗性淀粉的膨胀特性测定豌豆rs3的膨胀特性：取0.1 g淀粉样品放置于离心管中，用纯水混合配置成1%的淀粉乳后旋涡2 min，然后将离心管放入80 ℃的水浴锅中加热30 min，每间隔5 min振荡1次，加热完毕后，将离心管在4500r/min的转速下离心10 min，离心结束后，将上清液轻轻倒置于坩埚中，在120 ℃条件下烘干至恒重称其质量为a，下层沉淀淀粉的质量为b，根据以下公式计算淀粉样品的溶解度和膨胀度。以下公式计算淀粉样品的溶解度和膨胀度。
41.式中：a—溶解于上清液中的淀粉质量；m—淀粉干基质量；b—下层沉淀淀粉质量。
42.如图7所示，处理后豌豆淀粉的膨胀度小于原淀粉，原因是酸解协同酶解脱支处理之后，淀粉乳体系中形成了大量结构排列紧密的双螺旋微晶体，使淀粉结晶度上升，导致其膨胀度降低。退火和压热处理使豌豆rs3伴随着结晶度的上升，淀粉的结晶结构更加完善，更能抑制了淀粉颗粒的膨胀，能够降低淀粉的糊化粘度，便于豌豆i rs3产业化生产。
43.实施例5、豌豆iii型抗性淀粉的糊化温度测定豌豆rs3的糊化温度：采用差示扫描量热仪测定淀粉的热性质。测试参数分别为：扫描温度 10~150℃，扫描速率 10℃/min。以空铝制样品盘为参比，载气为高纯氮气（纯度99.999%），流速 30 ml/min。
44.起始糊化温度to、峰值糊化温度tp和终止糊化温度tc由差示扫描量热仪分析获得，表征淀粉热稳定性，数值越大，热稳定性越强。
45.由表1可知，改性处理显著提高了原豌豆淀粉的糊化温度，使其表现出更强的耐热加工型。原因是处理后，淀粉内部直链淀粉之间发生交互作用和定向排列，形成一定数量的双螺旋微晶体，使淀粉的结晶度增加，内部结构更加紧密坚固，对热越稳定，糊化越困难。
46.表1 豌豆iii型抗性淀粉的热特性参数
注：同一列不同上标字母表示差异显著（p 《 0.05）。
47.实施例6、豌豆iii型抗性淀粉的粘度测定豌豆rs3的粘度：采用快速粘度分析仪perten-rva4800测定了淀粉样品的糊化特性，得到淀粉样品的起始糊化粘度、峰值黏度、最终黏度和糊化粘度生成曲线，如图8所示。
48.如图8所示，原豌豆淀粉经处理后，在50—140℃的升温加热过程中，淀粉的粘度几乎为零，分散液状态稳定。表明处理后的豌豆淀粉在热加工处理中具有很强的热稳定性。原因是处理后，豌豆淀粉形成了结晶度高，结构更加致密的重结晶聚集体，该结构的低持水性和耐热性使其无法膨胀产生粘度。
49.实施例7、豌豆iii型抗性淀粉的消化性采用englyst法 (englyst，kingman，& cummings，1992)测定淀粉样品的体外消化率。首先，精确称量600 mg干基淀粉样品在50 ml离心管中，加入15 ml蒸馏水在沸水浴中搅拌蒸煮10min，蒸煮结束后向淀粉样品中加入5 ml乙酸缓冲液、50 mg瓜尔胶，并在37 ℃水浴中平衡样品10-15min；然后加入新制备的α-淀粉酶(30u/mg)和淀粉葡萄糖苷酶(260u/ml)的混合酶，在37 ℃水浴中水解淀粉。用megazyme d-glucose assay kit测定酶解20和120 min后释放的葡萄糖量，并以此值计算快速消化淀粉(rds；20 min内消化)、慢消化淀粉(sds；消化20-120 min)和抗性淀粉(rs；120min内不消化)的方法。体外淀粉消化率测定每个样品做3个重复。本试验对所有淀粉样品采用沸水搅拌蒸煮10 min是通常用于准备食物的烹饪条件，加热过程会加速淀粉颗粒的解聚，使淀粉的可消化淀粉含量提高。因此，该处理更加考验抗性淀粉在实际加工过程中的高温耐受性。将小麦淀粉、红薯淀粉、玉米淀粉按照实施例1的抗性淀粉制备方法进行制备，制备工艺完全一致，作为对比例。表2为四种不同来源淀粉改性前后的体外消化率数据，从天然淀粉的rs含量来看，小麦淀粉（8.8%）＜红薯淀粉（9.1%）＜玉米淀粉（10.9%）＜豌豆淀粉（19.4%），其中天然豌豆淀粉的抗消化性显著高于其他三类淀粉（p＜0.05），表现出较强的抗消化功能特性。改性前后消化率见表2。
50.表2 天然淀粉改性前后的体外消化率
注：同一列不同上标字母表示差异显著（p 《 0.05）。
51.rds=快消化淀粉，sds=慢消化淀粉，rs=抗性淀粉天然淀粉经酸解协同普鲁兰酶脱支制备为rs3后，rs含量均有一定程度的提升，其中豌豆rs3（46.7%）和玉米rs3（40.2%）的rs含量显著高于小麦rs3（30.2%）和红薯rs3（26.7%）（p＜0.05）。各类rs3经过含水率60%的退火和含水率20%的压热处理之后，呈现出更强的抗消化性。退火处理使各类rs3的rs含量达到了41.2%~72.5%，压热处理使rs3的rs含量达到了39.8%~85.6%，其中均属豌豆rs3表现出最强的抗消化性，保持最低的消化率，说明豌豆淀粉更适合本技术的工艺，用于开发rs3。
52.表3 豌豆iii型抗性淀粉经不同退火和压热条件前后的体外消化率注：同表2。
53.退火和压热处理均在水热条件下进行，因此在特定温度下，退火和压热处理过程中的含水率是影响rs3结晶结构修复的关键因素。表3为豌豆rs3经不同含水率条件下退火和压热处理前后的体外消化率数据。值得注意的是，在退火处理组样品中，随着含水率从40%增加至70%， 退火豌豆rs3的rs含量表现出先增大后减小的趋势，并在含水率为60%的条件下确定了最低消化率，rs含量最高为72.5%，比未退火豌豆rs3的rs含量提高了25.8%。从压热处理组样品中发现，随着含水率从10%增加至40%， 压热豌豆rs3的rs含量也表现出先增大后减小的趋势，并在含水率为20%的条件下确定了最大抗性比例85.6%。
54.进一步的，对于豌豆rs3来说，退火和压热工艺是两种不同的热改性方法，对淀粉热稳定结构的修复机制不相同。但从上述结果可以看出，经含水率为60%的退火处理确定了豌豆rs3抗性比例的最大值，经含水率为20%的压热处理确定了豌豆rs3抗性比例的最大值。
单从对抗性淀粉的抗消化性的提升来看，压热处理比退火处理的效果好，而且耗时短，制备工艺更简单。
技术特征：
1.一种豌豆iii型抗性淀粉制备方法，其特征在于：包括（1）酸解：取豌豆淀粉，加入hcl配置成淀粉乳，升温搅拌水解4-36h后，将酸解后的淀粉乳中和至中性；（2）糊化；将淀粉乳90-120℃剧烈搅拌20-40min，完成样品糊化；（3）脱支：糊化淀粉乳冷却保持至30-60℃，加入普鲁兰酶搅拌脱支反应10-36h，灭酶后得到脱支淀粉；（4）老化：脱支后的淀粉乳冷却至20-40℃老化12-36h，离心洗涤，将下层沉淀淀粉干燥、粉碎和过筛得到豌豆rs3；（5）退火或压热：退火步骤为：将豌豆rs3配置成40-70%水分含量的淀粉乳后密封水合5-24h，烘箱70-110℃加热2-36h，室温冷却后，将样品隔夜烘干得到退火的豌豆rs3；压热步骤为：将豌豆rs3配置成10-40%水分含量的淀粉乳后密封水合5-24h，然后110-130℃压热20-180min，室温下冷却停止压热，再将样品40-60℃隔夜烘干得到压热的豌豆rs3。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：酸解步骤中：淀粉乳浓度为20-40%重量百分比，水解温度40-60℃，水解时间为15-25h。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：糊化步骤中：用三水合乙酸钠和乙酸将酸解后的淀粉乳配置成ph 为3-5，质量浓度为20-30%重量百分比的淀粉乳，然后升温至110-130℃剧烈搅拌20-40min完成糊化。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：脱支步骤中，普鲁兰酶加入量为每50g豌豆淀粉加入4-8ml 1000 npun/g普鲁兰酶。5.如权利要求1或4所述的制备方法，其特征在于，脱支步骤中，脱支反应15-28h。6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，老化步骤中：脱支后的淀粉乳冷却保持至25-35℃老化20-28h。7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：退火步骤中：将豌豆rs3配置成40-70%水分含量的淀粉乳后密封水合8-16h，然后在烘箱80-100℃条件下加热12-36小时，加热结束后在室温下冷却4-5h停止退火，再将样品40-50℃隔夜烘干得到退火的豌豆rs3。8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：压热步骤中：豌豆rs3配置成10-40%水分含量的淀粉乳后密封水合8-16h，然后在110-130℃高压灭菌锅中压热0.5-2h，压热结束后在室温下冷却1-3h停止压热，再将样品40-50℃隔夜烘干得到压热的豌豆rs3。9.如权利要求1-8任一所述的制备方法制备获得的豌豆抗性淀粉。10.如权利要求9所述的豌豆抗性淀粉的应用。
技术总结
本发明公开了一种豌豆RS3(III型抗性淀粉)制备方法，制备方法主要包括：酸解
