一种PCVⅡ型Cap蛋白纯化方法与流程
一种pcvⅱ型cap蛋白纯化方法
技术领域
1.本发明涉及生物医药领域，尤其是猪圆环病毒疫苗(porcine circovirus，pcv)中pcvⅱ型cap蛋白纯化方法。
背景技术：
2.猪圆环病毒疫苗(porcine circovirus，pcv)有两个血清型pcv-1和pcv-2，其中pcv-1为非致病性的病毒，pcv-2为致病性的病毒，是断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome,pmws)的主要病原。在真核表达中，应用较广的是通过将pcv-2的orf2基因(cap蛋白)插入到昆虫杆状病毒，用昆虫细胞培养，获得重组的pcv-2的cap蛋白，制备亚单位疫苗真核表达生产方式得到不含标签的蛋白，根据蛋白的等电点(pi)在不同ph条件下所带电荷种类不同，采用阳离子树脂通过配基所带相反电荷进行异性电荷相吸。昆虫杆状病毒表达系统使用的培养基等原材料成本非常昂贵，为降低纯化工艺中的损失，回收率成为纯化工艺要求最主要的指标。
技术实现要素：
3.为了克服以上问题，本技术提供一种工艺简单、成本低、回收率高的pcv2-cap蛋白纯化方法。
4.一种pcv2-cap蛋白纯化方法，包括如下步骤：
5.1)细胞液的处理
6.将细胞液冻融1-3次，对冻融后的细胞液进行细胞碎片去除；
7.2)蛋白的吸附纯化
8.选择汇琼离sp-hpr对pcv2-cap蛋白、洗脱液一：称取十二水合磷酸氢二钠13g、二水合磷酸二氢钠0.247g、氯化钠29.25g，溶于1l ddh2o中，ph值为7.5～7.6进行吸附纯化。
9.其中，
10.步骤2)蛋白的吸附纯化具体流程如下：
11.填料平衡：取填料装柱，用约一个柱体积的ph值为6.6～6.8的缓冲液平衡柱子，控制流速125-135ml/min；
12.上样：将细胞蛋白液ph值调整至6.6～6.8，上柱控制流速125-135ml/min，直至细胞液全部泵完；上样完成后用约1.5倍柱体积上样缓冲液平衡柱子，洗脱料液和杂蛋白，调节柱体内的ph；
13.洗脱：使用洗脱液一对蛋白进行洗脱并收集，测试不同的洗脱液对蛋白回收率的影响；将洗脱液泵入柱子，控制流速125-135ml/min；当蛋白检测仪上的数字升至90后开始收获，当蛋白检测仪数值再次降至90时停止收获；洗脱后用平衡缓冲液补充至所需体积，补充至所需体积后的蛋白含量理论值为500μg/ml，蛋白收率为70％-75％。
14.步骤1)中细胞液处理中，采用2次冻融。使用过滤或离心的方法去除细胞碎片；使用过滤的方法，使用0.45μm+0.22μm过滤器过滤除去细胞碎片；使用离心的方法，是将细胞
液以5000rpm的转速离心30min处理，离心后收集上清液。
15.蛋白的纯度检验：对纯化前和纯化后取样的蛋白液，进行12％ sds-page凝胶检测，电泳完毕后染、洗脱、拍照。拍照后使用bandscan 5.0软件进行蛋白纯度测定。
16.本发明建立了一种pcv2-cap蛋白的纯化方法，并对纯化过程进行了适当优化，使用冻融后过滤的方法对细胞液进行前处理，使用汇琼离sp-hpr填料对蛋白进行吸附纯化，选取一种合适的洗脱液洗脱蛋白，提高回收率。实验结果显示该方法可明显提高目的蛋白的纯度，并显著提高目的蛋白的浓度。
附图说明
17.图1实施例中三个样品的纯化前和纯化后的蛋白电泳
具体实施方式
18.1材料
19.1.1填料阳离子交换树脂汇琼离sp-hpr、阳离子交换树脂汇琼离mmc-hpr购自ge公司。
20.1.2试剂本实验所用试剂均为分析纯产品
21.1.3配制试剂：
22.洗脱液一：称取十二水合磷酸氢二钠13g、二水合磷酸二氢钠0.247g、氯化钠29.25g，溶于1l ddh2o中，ph值为7.5～7.6。
23.洗脱液二：称取十二水合磷酸氢二钠13g、二水合磷酸二氢钠0.247g、氯化钠59.5g，溶于1l ddh2o中，ph值为7.8～7.9。
24.1.3仪器材料纯化柱、蛋白检测仪、蠕动泵
25.2方法
26.2.1细胞液的处理
27.2.1.1细胞破碎方法将收获的细胞液取出四份，记为1、2、3、4号样品，其中1号样品不做处理，2号样品冻融1次，3号样品冻融2次，4号样品冻融3次。使用重组pcv2-cap蛋白含量elisa检测方法检测四个样品中的蛋白含量，观察冻融次数对细胞液中蛋白含量的影响。
28.2.1.2细胞碎片去除方法根据2.1.1种的结果，选择冻融两次后的细胞液进行细胞碎片去除。分别使用过滤或离心的方法去除细胞碎片。使用过滤的方法，使用0.45μm+0.22μm过滤器过滤除去细胞碎片。使用离心的方法，是将细胞液以5000rpm的转速离心30min处理，离心后收集上清液。处理完成后，使用重组pcv2-cap蛋白含量elisa检测方法检测两种方法处理后的蛋白含量，观察过滤和离心对细胞液中蛋白含量的影响。
29.2.2蛋白的吸附纯化本方法是使用阳离子交换树脂对目的蛋白进行吸附再洗脱的方式进行的，选择汇琼离sp-hpr和汇琼离mmc-hpr对pcv2-cap蛋白进行吸附纯化，测试填料的选择对蛋白回收率的影响。
30.填料平衡：取两种填料装柱，用约一个柱体积的ph值为6.6～6.8的缓冲液平衡柱子，控制流速125-135ml/min。
31.上样：将细胞蛋白液ph值调整至6.6～6.8，上柱控制流速125-135ml/min，直至细胞液全部泵完。上样完成后用约1.5倍柱体积上样缓冲液平衡柱子，洗脱料液和杂蛋白，调
节柱体内的ph。
32.洗脱：使用洗脱液一和洗脱液二对蛋白进行洗脱并收集，测试不同的洗脱液对蛋白回收率的影响。将洗脱液泵入柱子，控制流速125-135ml/min。当蛋白检测仪上的数字升至90后开始收获，当蛋白检测仪数值再次降至90时停止收获。洗脱后用平衡缓冲液补充至所需体积，补充至所需体积后的蛋白含量理论值为500μg/ml，蛋白收率为70％-75％。对收获得到的蛋白使用重组pcv2-cap蛋白含量elisa检测方法进行检测，并计算蛋白回收率。
33.2.3蛋白的纯度检验对纯化前和纯化后取样的蛋白液，进行12％ sds-page凝胶检测，电泳完毕后染、洗脱、拍照。拍照后使用bandscan 5.0软件进行蛋白纯度测定。
34.3结果
35.3.1冻融及冻融次数对细胞液中蛋白含量的影响
36.将收获的细胞液取出四份，记为1、2、3、4号样品，其中1号样品不做处理，2号样品冻融1次，3号样品冻融2次，4号样品冻融3次。使用重组pcv2-cap蛋白含量elisa检测方法检测四个样品中的蛋白含量。依同样的实验方法，取不同的细胞液，重复三次实验，结果见表一。结果显示，不冻融的样品蛋白含量较低，冻融1次、2次和3次的结果相差不大，根据该结果，在实验过程中选择冻融1～3次均可。
37.表一冻融及冻融次数对细胞液中蛋白含量的影响
[0038][0039][0040]
3.2过滤和离心对细胞液中蛋白含量的影响
[0041]
将冻融两次后的细胞液使用过滤或离心的方法去除细胞碎片。使用过滤的方法，使用0.45μm+0.22μm过滤器过滤除去细胞碎片。使用离心的方法，是将细胞液以5000rpm的转速离心处理，离心后收集上清液。处理完成后，使用重组pcv2-cap蛋白含量elisa检测方法检测两种方法处理后的蛋白含量。依同样的实验方法，使用不同的细胞液，重复三次实验，结果见表二。结果显示，过滤或离心的方法对细胞液中的蛋白含量影响不大，结合实验室的实际情况，选择过滤的方式除去细胞碎片。
[0042]
表二过滤和离心对细胞液中蛋白含量的影响
[0043]
[0044]
3.3填料对蛋白回收率的影响
[0045]
取两种填料汇琼离sp-hpr和汇琼离mmc-hpr装柱，缓冲液平衡柱子，控制流速。取1000ml细胞蛋白液上柱，控制流速，直至细胞液全部泵完。上样完成后用上样缓冲液平衡柱子，使用洗脱液一对蛋白进行洗脱并收集，用缓冲液将洗脱的蛋白液补充至200ml。对收获得到的蛋白使用重组pcv2-cap蛋白含量elisa检测方法进行检测，并计算蛋白回收率。依同样的实验方法，使用不同的细胞液，重复三次实验，结果见表三。结果显示，使用汇琼离sp-hpr填料的回收率明显高于汇琼离mmc-hpr填料。
[0046]
表三填料对蛋白回收率的影响
[0047][0048][0049]
3.4洗脱液对蛋白回收率的影响
[0050]
使用填料汇琼离sp-hpr对细胞液进行吸附纯化，细胞液上样完成后，用约1.5倍柱体积上样缓冲液平衡柱子，使用洗脱液一和洗脱液二对蛋白进行洗脱并收集，用缓冲液将洗脱的蛋白液补充至所需体积。对收获得到的蛋白使用重组pcv2-cap蛋白含量elisa检测方法进行检测，并计算蛋白回收率，测试洗脱液对蛋白回收率的影响。依同样的实验方法，使用不同的细胞液，重复三次实验，结果见表三。结果显示，使用洗脱液一的回收率明显高于洗脱液二。
[0051]
表四洗脱液对蛋白回收率的影响
[0052][0053]
3.5蛋白的纯度检验
[0054]
对纯化前和纯化后取样的蛋白液，进行12％ sds-page凝胶检测，电泳完毕后染、洗脱、拍照，如图1所示，pcv2-cap蛋白在28kda处出现明显条带。使用bandscan 5.0软件进行蛋白纯度分析，结果显示，纯化前的样品中含有较多的杂蛋白，纯化后目的蛋白的纯度有明显提升。由此可知，该工艺可提高目的蛋白的纯度。
pbst洗涤5遍，在吸水纸上扣干反应板。将显液a液和b液等量混合配制显底物,加入反应板,每孔100μl,37℃避光孵育10分钟。反应板每孔中加入50μl终止液,即刻(10min内)置于酶标仪中，测定450nm处的光吸收值,并保存数据。
[0071]
2.3数据处理
[0072]
使用relpot4.0软件对酶标仪测定的数据进行分析，得到分析结果,以a表示。
[0073]
样品的蛋白含量＝a(分析结果)*n(样品的稀释倍数)。
技术特征：
1.一种pcv2-cap蛋白纯化方法，包括如下步骤：1)细胞液的处理将细胞液冻融1-3次，对冻融后的细胞液进行细胞碎片去除；2)蛋白的吸附纯化选择汇琼离sp-hpr对pcv2-cap蛋白、洗脱液一：称取十二水合磷酸氢二钠13g、二水合磷酸二氢钠0.247g、氯化钠29.25g，溶于1l ddh2o中，ph值为7.5～7.6进行吸附纯化。2.根据权利要求1所述的pcv2-cap蛋白纯化方法，其特征在于：步骤2)蛋白的吸附纯化具体流程如下：填料平衡：取填料装柱，用约一个柱体积的ph值为6.6～6.8的缓冲液平衡柱子，控制流速125-135ml/min；上样：将细胞蛋白液ph值调整至6.6～6.8，上柱控制流速125-135ml/min，直至细胞液全部泵完；上样完成后用约1.5倍柱体积上样缓冲液平衡柱子，洗脱料液和杂蛋白，调节柱体内的ph；洗脱：使用洗脱液一对蛋白进行洗脱并收集，测试不同的洗脱液对蛋白回收率的影响；将洗脱液泵入柱子，控制流速125-135ml/min；当蛋白检测仪上的数字升至90后开始收获，当蛋白检测仪数值再次降至90时停止收获；洗脱后用平衡缓冲液补充至所需体积，补充至所需体积后的蛋白含量理论值为500μg/ml，蛋白收率为70％-75％。3.根据权利要求1或2所述的pcv2-cap蛋白纯化方法，其特征在于：细胞液处理中，采用2次冻融。4.根据权利要求1或2所述的pcv2-cap蛋白纯化方法，其特征在于：细胞液处理中，使用过滤或离心的方法去除细胞碎片；使用过滤的方法，使用0.45μm+0.22μm过滤器过滤除去细胞碎片；使用离心的方法，是将细胞液以5000rpm的转速离心30min处理，离心后收集上清液。
技术总结
本发明涉及生物医药领域，尤其是猪圆环病毒疫苗(porcine circovirus，PCV)中PCVⅡ型Cap蛋白纯化方法。本发明建立了一种PCV2-cap蛋白的纯化方法，并对纯化过程进行了适当优化，使用冻融后过滤的方法对细胞液进行前处理，使用汇琼离SP-HPR填料对蛋白进行吸附纯化，选取一种合适的洗脱液洗脱蛋白，提高回收率。实验结果显示该方法可明显提高目的蛋白的纯度，并显著提高目的蛋白的浓度。并显著提高目的蛋白的浓度。并显著提高目的蛋白的浓度。
