金钗石斛多糖在制备防治皮肤光老化药物或日化用品中的应用
1.本发明涉及中药材的提取物的应用技术领域，具体涉及一种金钗石斛多糖在制备防治皮肤光老化药物或日化用品中的应用。
背景技术：
2.皮肤衰老通常分为内源性老化和外源性老化，诸如紫外线(ultraviolet，uv)辐射、电磁波辐射、大气污染及不良生活习惯等均是外源性衰老的诱因。而uv辐射是导致皮肤老化的主要因素。所以外源性老化又称为光老化，光老化和皮肤癌是长期紫外线辐射皮肤产生慢性损伤导致的结果。
3.长、中波紫外线均可刺激皮肤损伤。长波紫外线(uva，400nm
–
315nm，3.10
–
3.94ev)具有的穿透力最强，臭氧层虽然隔绝了大部分的uv辐射，但直达地面辐射仍以uva为主，占比98％以上，其能直接穿透表皮而直达真皮层。uva损伤真皮层内的成纤维细胞时，造成急性dna损伤、活性氧自由基清除酶系统活力下降、蛋白质非正常修饰及生物膜脂质过氧化等一系列恶性影响。
4.金钗石斛(dendrobium nobile lindl.)在《中国药典(2020年版)》中为药用石斛的重要来源。近年来，金钗石斛在化妆品中应用日益增多，主要集中在保湿、抗氧化、美白等方面。研究表明石斛有效成分包括生物碱、多糖、微量元素和氨基酸等成分。自然堂、植物医生等国内著名化妆品公司已推出一系列含有石斛提取成分的护肤品。石斛阿尔兹海默症、高脂血症、糖尿病等老年性疾病的研究较多，多聚集在石斛多酚、生物碱、多糖、黄酮等成分的药理药效研究。而目前并没有金钗石斛抗皮肤光老化的相关研究及产品。
技术实现要素：
5.本发明针对现有技术的不足，发现金钗石斛多糖在防治紫外线uva多次辐照导致的人皮肤光老化中具有明显的保护作用。
6.本发明的目的之一是提供金钗石斛多糖作为活性成分在制备防治皮肤光老化药物应用，所述的光老化是紫外线uva辐射导致的光老化损伤。
7.进一步的，皮肤光老化为多次紫外线uva辐照所导致的光损伤，包括人真皮层成纤维细胞活性氧(ros)增加、衰老相关β-半乳糖苷酶(sa-β-gal)染阳性率增加、细胞增殖缓慢和寿命降低、sod酶活性降低、cat酶活性降低或者gsh-px的酶活性降低中的一种或者多种。
8.进一步的，所述金钗石斛多糖的提取按照水提醇沉法提取。包括以下步骤：将金钗石斛药材粉末加入80％乙醇中浸泡30～50min，脱去脂质、极性小分子等；用4～8倍体积的纯水回流提取2～3次，每次1～3h；合并滤液，放冷至室温，先用无菌纱布初滤，滤液离心，再抽滤得滤液；滤液加入3～8倍体积的无水乙醇，4℃冷藏过夜；冷藏后弃去上层大部分溶液，取下层沉淀及少部分溶液离心，再弃上清保留沉淀；沉淀用乙醇，离心后取沉淀恒温干燥得
金钗石斛多糖。
9.本发明的目的之二是提供金钗石斛多糖作为活性成分在制备日化用品中的应用。
10.进一步的，所述的光老化是紫外线uva辐射导致的光老化损伤。
11.进一步的，皮肤光老化为多次紫外线uva辐照所导致的光损伤，包括人真皮层成纤维细胞活性氧(ros)增加、衰老相关β-半乳糖苷酶(sa-β-gal)染阳性率增加、细胞增殖缓慢和寿命降低、sod酶活性降低、cat酶活性降低或者gsh-px的酶活性降低中的一种或者多种。
12.进一步的，所述日化用品的种类包括香皂、面膜或者面霜。
13.长期慢性辐射如紫外线可以引起皮肤组织的氧化应激反应和dna损伤，而对于这些损伤，目前没有特别有效的手段进行保护、。而本发明通过现代药理学实验证明，金钗石斛多糖对长波紫外线诱导皮肤成纤维细胞光老化具有明显的拮抗作用，提示预防性给药可防治皮肤辐射导致的光老化损伤。金钗石斛多糖可以有效保护皮肤长期慢性辐射导致的皮肤光老化损伤，为以后制作以金钗石斛多糖为主要成分的抗皮肤辐射光老化损伤的药物以及以金钗石斛多糖为主要成分的药物在预防、紫外线皮肤损伤、光老化造成的皮肤损伤的临床应用提供了重要的科学依据。
附图说明
14.图1为金钗石斛多糖(dnlp)预处理可预防uva损伤的人皮肤成纤维细胞活力示意图；
15.图2为金钗石斛多糖(dnlp)降低光损伤人皮肤成纤维细胞中的ros和mda的含量示意图；
16.图3为金钗石斛多糖(dnlp)预处理提高uva损伤人皮肤成纤维细胞中sod、cat、 gdh-px的活力示意图；
17.图4为金钗石斛多糖(dnlp)抑制uva慢性辐射导致的人皮肤成纤维细胞衰老示意图。
具体实施方式
18.下面通过具体实施方式进一步详细说明：
19.1.水提醇沉法提取金钗石斛多糖
20.(1)精确称定金钗石斛药材粉末(过100目筛)30g；(2)加入80％乙醇200ml浸泡30min，脱去脂质、极性小分子等；(3)5倍体积的纯水回流提取3次，每次2h；(4)合并滤液，放冷至室温，先用无菌纱布(5层)初滤，滤液4000g离心10min，再抽滤得滤液；(5)滤液加入5倍体积的无水乙醇，慢加快搅，4℃冷藏过夜；(6)冷藏后弃去上层大部分溶液，取下层沉淀及少部分溶液4000g离心20min，再弃上清保留沉淀；(7)沉淀用乙醇洗2次，离心后取沉淀恒温干燥得金钗石斛多糖(dendrobium nobile lindl. polysaccharides,dnlp)。
21.苯酚-硫酸法测定多糖纯度：96孔板加入梯度浓度的葡萄糖溶液40μl作为标准品，然后加入5％苯酚20μl、浓硫酸100μl，摇匀后室温静置30min，酶标仪490nm测od值。以标准品的浓度为横坐标，以od值为纵坐标绘制标准曲线，经标准曲线计算dnlp的多糖纯度。
22.dnlp样品可溶于温水，精密称取dnlp 0.00540g溶于1ml 37℃预热的不含丙酮酸
钠的基础培养基，0.45μm微孔滤膜过滤除菌，即得5.4mg/ml的dnlp药品母液，用于后续药效活性研究，4℃保存，现配现用。
23.2.实验
24.2.1cck-8法检测金钗石斛多糖(dnlp)对uva光损伤后细胞活力的影响
25.将hff-1细胞以2
×
103个/孔接种于96孔板中，在细胞培养箱中用不含丙酮酸钠的 15％fbs完全培养基培养24h，弃去原培养基，加基础培养基(不含丙酮酸钠)同步化6h。共设七组，各组均设3个平行。dnlp加药组设五个剂量组(dnlp：1.62mg/ml；dnlp： 0.54mg/ml；dnlp：0.18mg/ml；dnlp：0.06mg/ml；dnlp：0.02mg/ml)药物预处理24h。弃去原培养基，加pbs后，再以uva 12j/cm2辐射加药组和模型组，正常对照组不做辐射。辐射后各实验组加入新的5％fbs、含药或不含药的完全培养基(不含丙酮酸钠)， co2孵箱继续培养24h后，采用cck-8法，全波长酶标仪测定各组od值。
26.对照组大鼠皮肤涂布溶剂，并对该处腿部皮肤进行x射线照射，辐射剂量为8g探究 dnlp预处理对uva损伤模型中hff-1细胞活力的影响，依据前述方法分组，cck-8法检测细胞活力。统计结果如图1所示，与正常对照组相比，模型组细胞增殖活力下降(1.000
±
0.000vs 0.5998
±
0.02546，p《0.001)。与模型组相比，加药组随着dnlp给药浓度的增高，细胞的增殖活力是显著提升的，结果有显著性差异(0.5998
±
0.02546vs 0.7613
±
0.02078、 0.8036
±
0.02060，p《0.05；0.5998
±
0.02546vs 0.8395
±
0.01319、0.9250
±
0.04212、0.9298
±
0.02757， p《0.001)。在dnlp给药浓度为0.54mg/ml时增殖活力为最高，此后药物浓度增加再无显著性增强。
27.2.2荧光探针dcfh-da法检测金钗石斛多糖(dnlp)对uva损伤人皮肤成纤维细胞中ros水平的影响
28.将hff-1细胞以2
×
106个/皿接种于2r＝10cm的培养皿中，在细胞培养箱中用不含丙酮酸钠的15％fbs完全培养基培养24h，弃去原培养基，加基础培养基(不含丙酮酸钠)同步化6h。dnlp加药组设高中低三个剂量组(dnlp：0.54mg/ml；dnlp：0.18mg/ml； dnlp：0.06mg/ml)药物预处理24h。装载探针完成后弃去基础培养基，加pbs后，再以 uva 12j/cm2辐射加药组和模型组，正常对照组不做辐射，各组均设3个平行。培养30min 后，采用dcfh-da法，流式细胞仪检测活性氧含量水平。
29.依据上述方法分组，模型建立，流式细胞仪检测各实验组的细胞ros水平，结果如图2所示。图2中a显示流式细胞仪输出的峰值曲线结果，与正常对照组比较，可见模型组吸收峰右移。与模型组比较，加药组吸收峰左移。b门x-mean结果统计如图2中b显示，统计结果显示模型组ros高表达，有显著性差异(1.000
±
0.000vs 1.995
±
0.05288，p《0.001)。dnlp 药物预处理组与模型组比较，ros水平是降低的，且高剂量实验组降低ros水平最为显著，低剂量组和中剂量组降低ros水平的能力相似，以上结果均有显著性差异(1.995
±
0.05288vs 1.359
±
0.05288、1.352
±
0.03177、1.121
±
0.02802，p《0.001)。
30.2.3金钗石斛多糖(dnlp)对uva损伤人皮肤成纤维细胞中mda、sod、cat、gsh-px的影响
31.按照试剂盒说明书，采用硫代酸(tba)比法测定细胞丙二醛(mda)水平，氯化硝基四氮唑蓝(nitrotetrazolium blue chloride,nbt)核黄素微板法检测细胞超氧化物歧化酶(sod)酶活性，分光光度法检测细胞过氧化氢酶(cat)酶活性，1.4.8 5,5'-二硫
代双(2-硝基苯甲酸)(5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid),dtnb)比法检测细胞谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)酶活性。
32.mda是脂质过氧化的产物，常用来反应脂质氧化水平。活性氧自由基作用于脂质不饱和脂肪酸生成过氧化脂质，因此一定程度上也反映了积累过量的ros产生的损伤水平。依据前述方法进行分组，实验结果统计如图2中c所示，与正常对照组相比，模型组经过高剂量 uva辐射后mda水平明显增高(12.74
±
0.2986vs 18.89
±
0.7006，p《0.01)。相比模型组， dnlp加药的低、中、高剂量组细胞mda表达水平是显著下降的(18.89
±
0.7006vs 15.08
±
0.9544、13.69
±
0.4389、13.32
±
0.6889，p《0.05)。
33.sod是ros清除酶系统中最关键的生物酶，sod是人体内o2·-的清除剂，能把有害的 o2·-转化为h2o2。因此依据前述方法分组，考察高剂量uva辐射对hff-1中sod酶活性的影响，探究dnlp预处理对uva损伤hff-1模型的细胞sod酶活性产生的影响。结果如图3中a所示，与正常对照组相比，模型组经过高剂量uva辐射后sod酶活性水平明显降低(46.19
±
1.333vs 18.03
±
3.168，p《0.001)。相比模型组，dnlp加药的低、中剂量组细胞sod 酶活性水平是有明显恢复的(18.03
±
3.168vs 36.74
±
3.201、38.16
±
2.499，p《0.05)，尤以高剂量组sod酶活性水平的恢复最为显著(18.03
±
3.168vs 44.46
±
1.570，p《0.001)。
34.cat广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是最主要的h2o2清除酶，在ros 清除酶系统的主要生物酶之一。依据前述方法分组，考察高剂量uva辐射对hff-1中cat 酶活性的影响，探究dnlp预处理对uva损伤模型hff-1细胞中cat酶活性产生的影响。结果如图3中b所示，与正常对照组相比，模型组经过高剂量uva辐射后cat酶活性水平明显降低(0.02420
±
0.001616vs 0.01326
±
0.001467，p《0.01)。相比模型组，dnlp加药的中、高剂量组细胞cat酶活性水平是有明显恢复的(0.01326
±
0.001467vs 0.02356
±
0.002263、0.02319
±
0.001269，p《0.01)，尤以低剂量组cat酶活性水平的恢复最为显著(0.01326
±
0.001467vs 0.02639
±
0.0007443，p《0.001)。以上差异均有统计学意义。
35.gsh-px也是人体内分解h2o2的生物酶。gsh-px特异性催化还原型gsh对h2o2的还原反应，与cat具有协同作用。依据前述方法分组，考察高剂量uva辐射对hff-1中gsh-px酶活性的影响，探究dnlp预处理对uva损伤模型hff-1细胞中gsh-px酶活性产生的影响。结果如图3中c所示，与正常对照组相比，模型组经过高剂量uva辐射后gsh-px酶活性水平明显降低(1.126
±
0.01858vs 0.5591
±
0.06328，p《0.001)。相比模型组，dnlp加药的低、中、高剂量组细胞gsh-px酶活性水平是有明显恢复的(0.5591
±
0.06328vs 1.406
±
0.03250、 2.450
±
0.05306、2.319
±
0.02715，p《0.001)。以上差异均有统计学意义。
36.2.4sa-β-gal衰老染法评价金钗石斛多糖(dnlp)对uva损伤人皮肤成纤维细胞的保护作用
37.将hff-1细胞以2
×
106个/皿接种于2r＝10cm的培养皿中，在细胞培养箱中用不含丙酮酸钠的15％fbs完全培养基培养24h，弃去原培养基，加基础培养基(不含丙酮酸钠)同步化6h。共设五组，各组均设3个平行。dnlp加药组设高中低三个剂量组(dnlp：0.54 mg/ml；dnlp：0.18mg/ml；dnlp：0.06mg/ml)。加药组药物预处理24h，弃去原培养基，加pbs后，再以uva 12j/cm2辐射加药组和模型组，每隔24h进行一次辐射，共辐射5次，每次辐射后加入含5％fbs、含药或不含药的完全培养基(不含丙酮酸钠)，正常对照组不做辐射。最后一次辐射后各组在co2孵箱继续培养24h后，检测指标。
38.检测步骤：(1)吸除细胞培养液，用pbs洗涤2次，加入适量能完全覆盖细胞的β
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半乳糖苷酶染固定液，25℃下固定15min。吸除细胞固定液，用pbs洗涤细胞3次，每次3min。每孔加入2毫升染工作液。染工作液的配制方法参考说明书。(2)37℃孵育过夜，应用封板膜或保鲜膜封住6孔板降低染工作液的蒸发。(5)普通光学显微镜下拍照并用image j分析。
39.依据前述方法分组，考察多次高剂量uva辐射对hff-1中sa-β-gal活性的影响，dnlp 预处理对uva损伤hff-1细胞光老化模型中sa-β-gal活性产生的影响。结果如图4所示，与正常对照组相比，模型组经过高剂量uva辐射后sa-β-gal活性水平明显升高(1.856
±
0.1463vs 19.43
±
2.549，p《0.001)。相比模型组，dnlp加药的低剂量组细胞sa-β-gal 活性是明显水平降低的(19.43
±
2.549vs 7.355
±
0.3205、5.494
±
0.07419，p《0.01)，尤以中、高剂量组的sa-β-gal活性水平降低最为显著(19.43
±
2.549vs 3.277
±
0.3869，p《0.001)。
40.以上结果均用spss 17.0分析，所有结果均用均数
±
平均值的标准误差(
±
sem)表示。组间均采用单因素方差分析，用lsd检验，p《0.05，差异有统计学意义。
41.以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本技术要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
技术特征：
1.金钗石斛多糖作为活性成分在制备防治皮肤光老化药物应用，其特征在于，所述的光老化是紫外线uva辐射导致的光老化损伤。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：皮肤光老化为多次紫外线uva辐照所导致的光损伤，包括人真皮层成纤维细胞活性氧(ros)增加、衰老相关β-半乳糖苷酶(sa-β-gal)染阳性率增加、细胞增殖缓慢和寿命降低、sod酶活性降低、cat酶活性降低或者gsh-px的酶活性降低中的一种或者多种。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述金钗石斛多糖的提取按照水提醇沉法提取。4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：药物的剂型包括外用涂抹制剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、滴丸剂、混悬剂、糖浆剂、肠溶制剂、喷雾剂、膏剂、凝胶剂、透皮吸收剂或者乳剂。5.金钗石斛多糖作为活性成分在制备日化用品中的应用，其特征在于，所述的光老化是紫外线uva辐射导致的光老化损伤。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：皮肤光老化为多次紫外线uva辐照所导致的光损伤，包括人真皮层成纤维细胞活性氧(ros)增加、衰老相关β-半乳糖苷酶(sa-β-gal)染阳性率增加、细胞增殖缓慢和寿命降低、sod酶活性降低、cat酶活性降低或者gsh-px的酶活性降低中的一种或者多种。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述日化用品的种类包括香皂、面膜或者面霜。
技术总结
本申请公开了中药材的提取物的应用技术领域中金钗石斛多糖在制备预防或皮肤紫外线辐射损伤导致皮肤光老化药物或日化用品中的应用。其中，光老化损伤是紫外线UVA辐射导致的光老化。通过现代药理学实验证明，金钗石斛多糖对长波紫外线诱导皮肤成纤维细胞光老化具有明显的拮抗作用，提示预防性给药可防治皮肤辐射导致的光老化损伤。皮肤辐射导致的光老化损伤。皮肤辐射导致的光老化损伤。
