一种聚多巴胺配位纳米粒子的制备方法及其应用
1.本发明属于纳米材料及其制备领域，更具体地，涉及一种负载dox的聚多巴胺配位纳米粒子的制备方法及其应用。
背景技术：
2.光热疗法是一种新型肿瘤疗法。临床上通过给予患者光热剂，在外界近红外光(nir)的辐照下，光热剂将光能转化为热能，促进肿瘤细胞高温消融凋亡。作为一种低侵入式疗法，光热疗法具有低创伤性，高空间性与时间选择性等优点，已经引起广泛的兴趣。
3.超氧化物歧化酶(sod)与过氧化物酶(pod)是细胞中调节细胞微环境中氧化-还原平衡的两种酶系。其中，sod可催化超氧阴离子(
·o2-)，生成h2o2和o2；而pod则通过催化底物h2o2反应，产生羟基自由基(
·
oh)，并借以氧化细胞内的其他物质。相对于正常细胞的中性环境，肿瘤微环境的ph在6.5左右，同时具有更高的h2o2和活性氧(ros)含量。利用肿瘤微环境的特点，向细胞内引入具有类sod和类pod活性的材料进行级联催化反应，可使肿瘤微环境内产生大量生物毒性的
·
oh，破坏生物大分子，同时使得肿瘤细胞氧化还原失衡，引起肿瘤细胞凋亡。
4.目前，聚多巴胺类材料因其良好的生物相容性和其优秀的光热性质，受到广泛的关注和研究应用(chem.sci.,2020,11,12269)。在本发明中，我们以生物相容性良好的聚多巴胺为载体，在其结构上配位fe
3+
离子和化疗药物dox，以配位作用与π-π共轭堆积作用为主要驱动力自组装形成fedd纳米粒子，用于级联催化-光热-化疗的肿瘤联合疗法。一方面，多巴胺作为神经递质，生物相容性好，在肿瘤中对正常细胞毒性小；另一方面，材料的类pod和类sod的级联催化作用，联合光热疗法和化疗药物dox，可高效诱导肿瘤细胞凋亡，实现肿瘤的高效。
技术实现要素：
5.本发明的目的是提供一种用于癌症联合疗法的负载dox的聚多巴胺配位纳米粒子，用于三疗法协同肿瘤。即以da为单体，与fe
2+
/fe
3+
进行配位的同时，da发生自聚包裹化疗药物dox，实现肿瘤的级联催化疗法-光热疗法-化疗三合一协同。
6.该聚多巴胺配位纳米粒子具有如下特征：
7.(1)具有均一的尺寸，其中fed粒径约为195.2nm，fedd粒径约为227.6nm；
8.(2)有良好的生物相容性；
9.(3)有良好的体外细胞效果；
10.(4)在肿瘤酸性微环境下，可将肿瘤细胞内的
·o2－
和h2o2催化产生过量的
·
oh，诱导肿瘤细胞凋亡；
11.(5)具有光热转化能力，在近红外光辐照下可消融肿瘤细胞，并促进酶级联反应速率；
12.本发明以生物体内的神经递质分子多巴胺为单体，在自聚合产生聚多巴胺的同
时，在材料内包裹有fe
3+
与化疗药物dox，合成了同时具有纳米酶特性和光热特性的肿瘤纳米粒子fed和fedd，具有均一的粒径、良好的分散性和生物相容性。在多巴胺与fe
3+
配位作用，及化疗药物dox与多巴胺的苯环π-π堆积的自组装驱动力作用下，可在水溶液中以一锅法简单合成纳米材料，合成方法绿无毒，健康环保。相比于常规的纳米材料：一方面，fed和fedd合成简便安全，生物相容性好，降低了由单纯无机材料引起的细胞毒性；另一方面，fedd所涉及的是级联催化疗法、光热疗法及化疗药物三种模式的协同，在肿瘤弱酸微环境的驱动和近红外光辐照下，产生高温和过量的
·
oh，同时促进材料中dox的释放。三种疗法互相促进，极大地提高了材料在肿瘤细胞中的效率，仅200μg/ml便可造成90％以上的肿瘤细胞死亡。
附图说明
13.图1：本发明fed及fedd的粒径分布图
14.图2：本发明fed透射电镜图(标尺：500nm)
15.图3：本发明fedd透射电镜图(标尺：500nm)
16.图4：本发明fedd催化h2o
2-tmb显反应检测类pod活性
17.图5：本发明fedd抑制邻苯三酚自氧化检测类sod活性
18.图6：本发明fedd在近红外光辐照下升温效果
19.图7：本发明纳米材料的细胞毒性图
20.图8：本发明纳米材料的细胞图
具体实施方式
21.下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。如所用溶液的浓度、体积等可根据需要调节。
22.实施例1
23.(1)将14.5mg的da溶解于2ml，1mg/ml的fecl3·
6h2o水溶液中，以超纯水补充体积至42ml，在室温下搅拌1h。
24.(2)向上述反应体系内加入6.45ml，22.5mg/mltris水溶液调节ph，继续在室温下反应24h。
25.(3)收集反应液，离心并以超纯水洗涤2遍，即得fed纳米粒子，纳米粒子以水溶液方式保存于4℃。
26.实施例2
27.(1)将7.2mg的da溶解于1ml，1mg/ml的fecl3·
6h2o水溶液中，以超纯水补充体积至42ml，在室温下搅拌1h。
28.(2)1h后，向反应体系内加入6.45ml，22.5mg/mltris水溶液调节ph，同时加入1.5mg dox盐酸盐，继续在室温下反应12h。
29.(3)收集反应液，离心并以超纯水洗涤2遍，即得fedd纳米粒子，纳米粒子以水溶液方式保存于4℃。
30.实施例3
31.(1)-(3)同实施例2步骤(1)-(3)。
32.(4)向fedd的hac-naac缓冲溶液(ph4.5)(200μg/ml)中加入h2o2和tmb的dmso溶液，使其总体积为3ml，浓度分别达到1mm和200μg/ml，并开始计时。以紫外分光光度计测量混合体系于0，4，8，12，16min的350～800nm波长的吸收曲线。
33.结果显示，在fedd存在的条件下，混合体系位于370nm和652nm的吸收峰随反应时间延长不断增加。这是因为h2o2在过氧化物酶催化作用下，会产生tmb氧化物，并在370nm和652nm处产生吸收。由此可见，fedd具有类pod活性，在弱酸性的肿瘤微环境下催化h2o2分解，产生过量
·
oh并诱导肿瘤细胞凋亡的作用。
34.实施例4
35.(1)-(3)同实施例2步骤(1)-(3)。
36.(4)在96孔板中加入0,50,100,150,200μg/mlfedd的tris-hcl溶液(50mm，ph8.2)各160μl。向各孔加入40μl邻苯三酚的50mm盐酸溶液，同时开始计时，以酶标仪检测0～10min内各体系325nm处的吸光度变化。
37.邻苯三酚是一种在中碱性环境中自发氧化的物质，其氧化产物中间体在325nm处有吸光度。吸光度越深，说明自氧化程度越完全，而具有类sod特性的材料能显著抑制邻苯三酚的自氧化过程。因此，向自氧化体系内加入具有类sod活性的物质，体系内325nm的吸光度增长速度将会减缓。实验结果显示：随着溶液内fedd材料的浓度增加，10min内体系在325nm的吸光度增长逐渐降低，这说明fedd可以有效抑制邻苯三酚的自氧化过程，具有类sod活性，在细胞中可将超氧阴离子歧化为h2o2和o2，在类pod活性的作用下起到增强
·
oh产率，促进化学动力学效果的作用。
38.实施例5
39.(1)-(3)同实施例2步骤(1)-(3)。
40.(4)向光热实验的专用反应容器内分别加入浓度为0，12.5，25，50，100，200μg/ml的fedd水溶液1ml，并以808nm近红外光(1.5w/cm2)辐照15min，用热电偶监测这段时间内溶液的升温情况。
41.结果表明：随着近红外光辐照，溶液在15min内不断升温。随着溶液内fedd浓度的增加，溶液的升温速率和最高温度也随之增长。当fedd浓度为200μg/ml时，溶液在15min内升温46.2℃，而不含有fedd的对照组仅升温1.8℃。由此可见，fedd具有出的光热转化能力，在nir辐照下可迅速产生大量热量，达到消融肿瘤细胞并加速酶促反应的效果。
42.实施例6
43.(1)-(3)同实施例2步骤(1)-(3)。
44.(4)在细胞毒性实验中，将4t1细胞以1
×
104个/孔的密度接种在96孔板中，在孵育24h后，弃去培养基，分别更换为含有0，12.5，25，50，100，200μg/mlfedd的培养基，并继续孵育24h。通过mtt法确定与不同浓度fedd共孵育时，各组的细胞活力。
45.结果表明：与不含fedd的对照组相比，各组的细胞活力值不存在显著性差异，即使fedd的浓度达到了200μg/ml，细胞仍具有89.34％的活力值。由此可见fedd对正常细胞没有显著的毒性，具有良好的生物相容性。
46.实施例7
47.(1)-(3)同实施例2步骤(1)-(3)。
48.(4)在细胞实验中，将4t1细胞以1
×
104个/孔的密度接种在96孔板中，孵育
24h，之后更换培养基，与不同组共培养24h。
49.其中，fed/fedd的浓度为0～200μg/ml(材料梯度同实施例6)，而dox的浓度等于对应浓度下fedd的包封浓度。对于添加h2o2的实验组，h2o2的浓度均为100μm，并用盐酸调节培养基ph至6.8。对于nir组，在更换培养基共孵育12h后，以808nm激光辐照每孔3min，激光功率为1.5w/cm2。在共孵育12h后，以mtt试剂盒法测定各组的细胞活力。
50.结果显示：在以上细胞实验中，仅单一使用fed或fedd时，效果很弱，因为ph7.4下(正常细胞环境)，fed和fedd的类pod活性较弱，几乎不能产生
·
oh，并且fedd包封的dox的缓释也较慢。而随着h2o2的加入及ph降低至6.8(肿瘤细胞环境)，材料的级联催化功能开始发挥效果，使细胞活力逐渐下降，且fedd+h2o2+nir组的效果远高于对应浓度下的游离dox组，在fedd共孵育浓度达到200μg/ml时，细胞活力仅8.97％，这进一步验证了fedd三种疗法的协同功能。实验结果证实了fedd在肿瘤细胞微环境中可将
·o2-和h2o2转化为过量的
·
oh，诱导肿瘤细胞凋亡。而nir的辐照不仅能使肿瘤细胞消融，还兼具加速级联催化反应和dox缓释的功能。最终数据验证了fedd高效的抗肿瘤能力。
技术特征：
1.一种聚多巴胺配位纳米粒子的制备方法，其特征在于，多巴胺即da单体与fecl3溶液中的铁离子进行配位的同时，利用三羟甲基氨基甲烷即tris缓冲溶液调节至弱碱性，使da能够自氧化聚合形成聚多巴胺，最终自组装形成聚多巴胺配位纳米粒子fed。2.根据权利要求1所述聚多巴胺配位纳米粒子的制备方法，其特征在于，将14.5mg da
·
hcl加入至1mg/ml，1.0或2.0ml fecl3·
6h2o的水溶液中，补充超纯水至体积为42ml，搅拌1h；加入22.5mg/ml，6.45ml的tris水溶液，继续搅拌24h；将所得溶液10000rpm，10min离心清洗2次。3.一种负载dox的聚多巴胺配位纳米粒子的制备方法，其特征在于，在权利要求1的合成体系中还加入dox，通过dox与铁离子配位，自组装形成负载dox的聚多巴胺配位纳米粒子fedd。4.根据权利要求3所述负载dox的聚多巴胺配位纳米粒子的制备方法，其特征在于，将14.5mg da
·
hcl加入至1mg/ml，1.0ml fecl3·
6h2o的水溶液中，补充超纯水至体积为42ml，搅拌1h；加入22.5mg/ml，6.45ml的tris水溶液，加入1.0mg或1.5mg的dox
·
hcl继续搅拌12h；将所得溶液10000rpm，10min离心清洗2次。5.由权利要求1～4任一项所述的制备方法制得的聚多巴胺配位纳米粒子或负载dox的聚多巴胺配位纳米粒子。6.采用权利要求1～4任一项所述的制备方法制得的聚多巴胺配位纳米粒子或负载dox的聚多巴胺配位纳米粒子作为肿瘤的药物的应用。
技术总结
本发明公开了一种聚多巴胺配位纳米粒子的制备方法及其应用。通过多巴胺单体自氧化聚合，同时与Fe
