一种用于检测数字聚合酶链反应中的反应体积偏差的方法与流程
一种用于检测数字聚合酶链反应中的反应体积偏差的方法
1.相关申请的交叉引用本技术要求2020年4月30日提交的美国申请序列号63/018183的权益和优先权。所提及的申请的公开内容以引用方式并入本文。
技术领域
2.本公开涉及一种用于检测数字聚合酶链反应(dpcr)中的反应体积偏差的方法，并且涉及一种考虑了反应体积偏差的用于确定样品中的目标核酸的量或浓度的dpcr方法。
背景技术：
3.针对许多生物学目的、生物化学目的、诊断目的或目的，有必要准确地和精确地确定样品中的核酸的量或浓度。数字pcr为核酸的绝对定量和稀有等位基因检测提供了对常规实时定量pcr的另选方法。数字pcr的工作方式是将核酸样品分区到许多单独的、平行的pcr反应中；其中一些反应包含靶分子（阳性），而另一些则不包含靶分子（阴性）。在pcr分析之后，阴性反应的分数用于生成样品中的靶分子数量的绝对计数。dpcr优于实时pcr的主要优点之一是其卓越的定量准确性。该优点依赖于dpcr的固有特性，因为量化只需要正确计数阳性分区（或反应体积）和了解理论分区体积（计数数量对pcr效率不是很敏感）。不需要量化标准。这消除了由标准本身引起的潜在量化误差。
4.现有技术提供了在逐滴测定中识别不正确的阳性计数或阴性计数以及用于校准或归一化信号的方法(us 2013/0302792 a1)。这种归一化会改善阳性计数与阴性计数之间的分离。因此，归一化降低了假阳性计数或假阴性计数的风险。最终目标是通过对针对核酸获得的信号进行校正来提高核酸浓度确定的准确性和精确性。
5.然而，现有技术方法没有考虑由于这样的情况而导致的pcr中的误差，其中dpcr分区中的真实体积与预期或期望的体积不同。
6.因此，需要考虑了反应体积偏差的通过dpcr对目标核酸进行定量的方法。
技术实现要素：
7.本公开提供了一种用于检测dpcr测定中的反应体积偏差的方法，其中dpcr测定用于量化分区阵列中的目标核酸的量或浓度。所述方法包括以下步骤：(a) 使用利用核函数进行的卷积来跨所述阵列内的(x, y)坐标组合光信号，其中每个分区被分配卷积值；以及(b) 通过将每个分区的所述卷积值与阈值卷积值进行比较来识别有效分区和无效分区。
8.此外，所述方法还可包括(c)使在步骤(b)中收集的数据经历一个或多个附加步骤，所述一个或多个附加步骤包括：聚类操作和形态学图像处理操作。此类形态学图像处理操作可包括膨胀和/或腐蚀，而聚类可包括有效修整和/或无效修整。
9.本公开还设想了一种用于确定样品中的目标核酸的量或浓度的方法，所述方法包
括以下步骤：(a)提供疑似包含所述目标核酸的样品；(b)在包括分区阵列的dpcr板中利用所述样品执行dpcr；(c)识别所述分区阵列中的一个或多个有效分区；以及(d)将所述目标核酸的所述量或浓度计算为每有效分区体积的在步骤(b)中确定的核酸数。此外，所述方法还可包括：确定在步骤(c)中识别的所述一个或多个有效分区中的目标核酸的拷贝数nc，并且将nc除以所述有效分区体积。
10.在特定实施例中，本公开提供了：一种实验室仪器，其适于执行本文所述的方法的步骤；以及一种包含指令的计算机程序产品，所述指令致使实验室仪器执行所述方法的所述步骤；以及一种计算机可读介质，所述计算机可读介质具有存储在其上的本文所述的计算机程序产品。
附图说明
11.图1a至图1b示意性地示出了本文所述的用于检测dpcr测定中的反应体积偏差的方法。图1a示出了用于在核酸扩增后分析dpcr板的方法，并且图1b示出了从dpcr板的制备到使用本文所述的方法进行分析的完整方法。
12.图2为如本文所述的实验室仪器的示意图。
具体实施方式
13.如上详述，可靠地确定核酸的量或浓度的方法在若干工业应用中（例如在医疗领域中）具有特别的相关性。此类应用可能需要精确地和准确地确定样品（例如从患者或产品获得的样品）中的核酸的量或浓度。这可能是感兴趣的，例如，在对疾病严重程度的诊断中，在环境技术中，或作为确定产品质量的一种手段，例如，以便对污染物或杂质进行定义。
14.数字pcr是对常规聚合酶链反应方法的生物技术改进，其可用于对核酸（包括dna、cdna、rna或它们的混合物）进行直接定量以及任选地以克隆方式扩增核酸。dpcr与传统pcr（例如qpcr）之间的主要区别在于测量核酸量的方法，其中前一种方法是比pcr更精确和更准确的方法，但经验不足的使用者在操作中也更容易出错。dpcr的较小动态范围可能需要稀释样品。dpcr也在样品内实施单一反应，然而样品被分离到大量分区或分区中，并且该反应在每个分区或分区中单独进行。这种分离能够实现对核酸更可靠的收集以及对核酸量更灵敏的测量。此外，该方法允许准确量化。
15.对dpcr装置和方法的详细描述可见于例如美国专利申请号20080160525；vogelstein, 等人, proc. natl. acad. sci. usa, 第 96 卷, 9236-9241, 1999 年 8 月；mccaughan, 等人, j. pathol. 2010; 220: 297-306；mao, 等人, am. j. transl.res. 2019; 11(12): 7209-7222；美国专利号 10,564,102；美国专利公开号20180045641a1；欧洲专利号3299471b1；美国专利公开号20180147574a1；以及美国专利公开号20180087090a1中。这些出版物中的每一个的公开内容都通过引用其整体并入本文。
16.在一个具体实施例中，dpcr样品在包括多个分区（另选地也被称为反应体积或反应孔）的阵列中被分离或分区，使得样品内的单独的核酸分子被定位并集中在该阵列内的许多分离的区域内。对样品的分区允许人们通过假设每个分区内的目标分子计数遵循一个一致的泊松分布来估计核酸的数量。在pcr扩增后，每个分区被识别为阴性反应或阳性反应（分别为“0个”分子或者“1个或多个”分子）。可通过对阳性分区和阴性分区的数量进行计
数，然后使用最大似然估计来估计潜在的泊松分布，从而量化靶分子。在常规定量pcr中，定量结果可能取决于pcr过程的扩增效率。然而，dpcr不依赖于扩增循环的数量来确定初始样品量，从而消除了对不确定指数数据的依赖来量化靶核酸，并且因此提供了绝对量化。
17.由于样品在阵列中被分区，因此分区过程可能导致被部分填充或未被填充的分区，即反应体积偏差，并且被部分填充或未被填充的分区另选地被称为空区或填充空区。来自空区的荧光信号可能难以与从包含低靶分子或不包含靶分子的以其他方式被填充的分区观察到的信号区分开来。此外，在无效分区中可能会观察到亮点，这可能会被误认为来自被填充分区的阳性信号。
18.这些问题可使用图1a中示意性示出的本公开的方法来解决。简而言之，通过分析dpcr板的其中在所有通道上信号一致为低的区域，可识别和区分信号数据中的空区。对这些低信号区域的分析包括：a) 特征计算101，方法是使用利用核函数进行的卷积来跨阵列内的(x, y)坐标组合光信号，从而为每个分区分配卷积值；b) 对有效分区或无效分区的识别102，方法是将每个分区的卷积值与阈值卷积值进行比较；c) 任选地可执行附加清理步骤103，其包括使在步骤(b)中收集的数据经历一个或多个附加步骤，该一个或多个附加步骤包括：聚类操作和形态学图像处理操作。
19.该方法的每个步骤在下面更详细地描述并在图1b中示出，其中具体参考示例性dpcr板。
20.简而言之，在一个具体实施例中，dpcr板可包括标准微孔板形式（sbs形式，图中未示出）内的1个至8个反应混合物（样品）。dpcr板内的1个至8个样品位置中的每一个样品位置都可包括例如在板的位置a1处的入口端口（在位置a1与位置a12之间的微结构化部分）以及在位置a12处的出口端口。一旦将一定体积的流体样品添加到入口端口中的每个入口端口，就将分区流体添加到每个入口。这可使用单通道或8通道移液器或者通过使用自动分配站来手动完成。分离或分区流体为疏水性液体，其相对于反应混合物（例如长链氟化烃或硅油）不混溶且不反应。对包含反应混合物的单独分区的分离（或分区）可被动地完成，或者通过在入口端口处施加超压或通过在出口端口处施加负压来完成。监测传感器可用于确保当分离完成（即，分离流体已到达出口端口）时过程停止。样品制备步骤如图1b 104所示。
21.分区后，dpcr板经历热循环过程105，随后进行图像分析以检测与阵列中的每个单独分区相关联的荧光信号。收集来自初步图像分析步骤的信号数据106。表1汇总了本文所述方法中使用的数据输入：表1
。
22.检测反应体积偏差中的第一步是特征计算107。特征计算的目标是以这样的方式组合信号，使得无效分区与有效分区之间的分离更加明显。信号首先跨通道被组合，然后利用基于(x, y)坐标的核被卷积。信号利用核被卷积以使图像精细化或“平滑”。在一个实施例中，可单独对通道进行卷积，或者可对所有通道上的经归一化信号的总和进行卷积。
23.在具体实施例中，信号被求和以便当分区在所有通道中而不是仅在一个通道中昏暗时突出显示。为了确保所有分区的贡献相同，信号值在每个通道内都被归一化。在一个实施例中，在计算中仅使用具有大部分正信号的那些通道。通道通过usechannel标记（即，标记
分区 = 1（有效））被选择以供使用。信号的总和计算如下：signalchannel = 荧光(通道)
分区
卷积用于在昏暗区域和昏暗分区之间进行区分。卷积包括几个步骤：首先，建立距离函数和核函数。可使用标准l2距离和自定义指数核：可使用标准l2距离和自定义指数核：为了便于表示，z表示给定分区的(x, y)坐标，并且z的卷积被表示为：
请注意，在其中{isvalidpartition(z') ^ dist(z, z') 《= 半径}为空集的情况下，该值没有被很好地定义。在该情况下，结果被设定为不可能的默认值，例如-1。通常，该方法的重点是针对有效分区的卷积，因此可接受使用诸如这样的无效默认值。
24.为了初始区分无效分区和有效分区，针对卷积值设定阈值108。具有小于阈值的卷积值的任何分区都被标记为无效，并且具有超过阈值的卷积值的任何分区都保持有效。用于确定阈值的方法包括：分析dpcr板中的候选参考区域以选择代表该板的被填充部分的区域，然后基于该区域中的卷积值来设定阈值。
25.存在可在dpcr板上绘制的许多潜在参考区域。分析每一个潜在参考区域会很慢，因此选择子集，在该示例中为6个参考区域。候选参考区域的理想数量可因板的大小和分区密度而异。出于说明的目的，在代表性dpcr板中使用六个区域：（maxx和maxy为分区的最大x坐标和最大y坐标）对于对于。
26.请注意，对于i = 0的情况而言，y上的下边界从0移动到11，以避免使用位于板入口处的区域。最后两个参考区域是水平的而不是竖直的：对于对于对于每个参考区域而言，针对该区域计算有效卷积的平均值（值不等于默认的-1）。将具有第二高平均卷积的区域作为参考。在该具体实施例中，由于某些图像伪影可能放大一些区域中的卷积这一事实，选择第二高而不是第一高。第二亮的区域不太可能出现这些问题，但其很可能包括被完全填充的分区。
27.为了设定阈值，确定针对被填充分区的卷积的预期偏差。首先，使用绝对中位差(mad)：默认卷积值从该表达式中被排除，从而产生以下标准阈值：接下来，评估针对另选阈值的需求。当mad非常小时，例如当λ非常高或非常低时，标准阈值可能不适合。虽然当λ非常低时可用的可能补救措施是有限的，但是当λ非常高时，可使用简单的解决方案来恢复适当的阈值。在这种情况下，如果mean(ref) 》 highconvolutionthreshold且mad(ref) 《 lowvariancethreshold，则使用另选阈值。
28.在阈值被设定的情况下，如果卷积值小于阈值，则分区被归类为无效，并且如果卷积值达到或超过阈值，则分区被认为有效，109。
29.如果信号有噪声和/或以其他方式有效分区为昏暗或无效分区包含大量信号，则可能期望采用最终清理步骤。清理步骤可包括以下步骤中的一个或多个步骤：无效修整110、膨胀111和有效修整112。
30.(i) 无效修整可通过使用路径连通进行聚类来修整空区。简而言之，给定分区的邻居包括与该分区共享壁的那些分区。例如，如果装置中的分区在形状上为正方形、矩形或六边形，则给定分区的邻居分别为与该分区共享壁的4个或6个分区。在该示例中，可形成将一个分区连接到下一个分区的路径，方法是从一个分区开始并移动到其邻居中的一个邻居，然后移动到该新分区的邻居中的一个邻居，依此类推。如果两个无效分区之间存在仅通过无效分区的路径，则该两个分区是路径连接的。无效分区可通过路径连通被聚类，方法是形成所有彼此路径连接的分区的组。具有小于voidnoise的大小的过小的簇被重新归类为有效。
31.(ii) 膨胀在错误的空区被去除后，剩余的空区被膨胀以确保任何边界空区都被去除。可使用任何合适的笔刷（例如，具有cleanupradius的半径的“菱形”笔刷）进行膨胀，即，对于具有坐标z的任何有效分区而言，当且仅当存在无效分区z'时，其中，该分区才被重新归类为无效。
32.(iii) 有效修整在最后一步中，通过去除小的组来修整有效分区。如本文所述，针对无效修整但针对有效分区执行该步骤。首先，通过路径连通对有效分区进行聚类，然后将具有小于goodnoise的大小的聚类重新归类为无效。
33.一旦空区被适当识别，则针对这些分区的标记改变为无效。
34.算法的输出汇总在表2中：表2.
。
35.一旦使用本文所述的方法识别了无效分区，则dpcr系统可量化阵列中的有效分区中的目标核酸的量或浓度，而不考虑从无效分区收集的信号数据。在具体实施例中，一个或多个有效分区中的目标核酸的浓度计算为每个有效分区体积的核酸分子数。
36.因此，该浓度可通过将靶分子计数（也称为拷贝数）nc除以采样的液体体积来计算。拷贝数nc导出如下：首先，dpcr系统针对靶分子识别哪些有效分区为阳性和阴性，并针对每个得出总数。
37.例如，在具有2000个阴性有效分区和8000个阳性有效分区的dpcr板中，则最大似然估计用于计算泊松分布中的潜在参数λ。分区为阴性的概率的估计值可计算如下：p(阴性) = 阴性数/总数。
38.例如，在上述示例性dpcr板中：p(阴性) = 2000/(2000 + 8000) = 0.2。
39.如果在对分区中的分子数建模的情况下x为泊松随机变量，则p(阴性) = p(x=0) = exp(-λ)用于估计λ，其是泊松分布中的唯一参数。将该原理应用于示例性dpcr板：exp(-λ) = p(阴性) = 0.2，即，λ =
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log(0.2) = 1.61（四舍五入）。
40.λ是重要的值，因为它也是泊松分布的预期值或平均值。换句话说，λ为基于泊松估计的每个分区的平均靶分子数。λ估计值用于确定nc：n
c = λ * 被填充分区数。
41.被填充分区的数量为非无效分区的数量：有效+非空区无效。对于示例性dpcr板而言，假设有1000个无效且非空区的附加分区，则被填充分区数 = 2000 + 8000 + 1000 = 11000，并且拷贝数为nc= 1.61 * 11000 = 17710。
42.浓度计算包括附加校正因子。如果样品在用于dpcr中之前已经过处理，例如稀释，则处理和稀释步骤应包括在计算中，以便获得所分析样品中的目标核酸的量或浓度。因此，在示例性dpcr板中，假设一个分区的体积为1 ml，并且在dpcr前将样品稀释至十分之一浓度，则扩增前的浓度为：
nc/(分区体积 * 被填充分区数) = 17710/(11000 * 0.001l) =每升1610个拷贝。
43.因此，在稀释前，每升有10*1610 = 16100个拷贝。
44.本文所述的方法用于使用dpcr分析来确定样品中的核酸的量或浓度。本上下文中的样品为疑似包含待检测或测量及量化的一种或多种核酸的一定量的材料。如本文所用，该术语包括但不限于样本（例如，活体组织切片或医学样本）、细胞或组织培养物、血液、血清、血浆、针吸物、尿液、精子、精液、精浆、前列腺液、排泄物、泪液、唾液、汗液、活体组织切片、腹水、脑脊液、胸膜液、羊水、腹膜液、间质液、痰液、乳汁、淋巴液、支气管等灌洗样品或组织提取物样品。样品来源可以为如来自鲜活的、冷冻的和/或保存的器官或组织样品或活体组织切片或抽吸物的实体组织；或来自受试者的妊娠或发育中的任何时间的细胞。样品可包含本质上不与样品来源自然混合的化合物，诸如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养物、抗生素等。
45.如上文详述，样品包含其量或浓度待在本公开的方法中被确定的目标核酸。核酸是对于所有已知的生命形式而言所必需的生物聚合物。因此，核酸可用作针对特定生物体的指示物，但例如在突变或自然发生的变体的情况下也可用作针对疾病的指示物。目标核酸可选自由dna、cdna、rna及其混合物组成的组，或者是任何其他类型的核酸。核酸可包含非核酸成分。它可以是天然存在的、经化学合成的或经生物技术工程化的。具体而言，核酸选自由dna、cdna、rna及其混合物组成的组。
46.核酸可指示微生物（例如病原体），并可用于诊断疾病，例如感染。感染可能由细菌、病毒、真菌和寄生虫或含有核酸的其他物体引起。病原体可以是外源性的（从环境或动物来源或从其他人获得）或内源性的（从正常菌获得）。可基于体征和症状来选择样品，样品应代表疾病过程，并应在施用抗微生物剂之前被收集。未经处理的样品中的核酸量可指示疾病的严重程度。
47.另选地，核酸可指示遗传疾患。遗传疾患是由基因组中的一种或多种异常引起的遗传问题，尤其是从出生时就存在的病症（先天性）。大多数遗传疾患非常罕见，并且每数千或数百万人中才有一个人受到影响。遗传疾患可能是或可能不是可遗传的，即，从父母的基因遗传下来。在非可遗传的遗传疾患中，缺陷可能是由dna的新的突变或改变引起的。在这种情况下，缺陷只有当其在生殖系中出现时才可遗传。相同的疾病，诸如一些形式的癌症，在一些人中可能由遗传的遗传病症引起，在其他人中由新突变引起，并且在另外的其他人中主要由环境原因引起。显然，具有突变的核酸的量可指示疾病状态。
48.在具体实施例中，样品为取自怀孕的哺乳动物的生物流体，其包含核酸（例如，rna或dna）的母体来源和胎儿来源。在该具体实施例中，可使用来自母体样品的核酸来检测因胎儿非整倍性导致的染体剂量。除根据经验确定来自特定染体的核酸的频率之外，母体样品中的胎儿核酸的比例也可用于基于染体剂量来确定胎儿非整倍性的风险，因为它会影响在风险计算方面具有统计学意义的变异水平。在计算一个或多个胎儿染体中的非整倍性风险时利用此类信息允许得到反映样品之间的生物学差异的更准确的结果。母体样品中的胎儿dna的比例用作风险计算的一部分，因为胎儿比例提供了有关染体剂量的预期统计学存在情况的重要信息。与预期统计学存在情况的差异可指示胎儿非整倍性，特别是胎儿三体性或特定染体的单体性。
49.在本公开的方法中，确定了核酸的量或浓度。物质的量是标准定义的量。国际单位制(si)将物质的量定义为与存在的基本单元的数量成正比，其中以阿伏伽德罗常数的倒数作为比例常数（以mol为单位）。针对物质的量的si单位为摩尔。摩尔被定义为包含与12克同位素碳-12中存在的原子相等数量的基本单元的物质的量。因此，样品的物质的量计算为样品质量除以物质的摩尔质量。在本上下文中，“量”通常是指目标核酸序列的拷贝数。
50.在dpcr中，分区可以为微阵列或纳米阵列的小型化室，微流体装置的室，芯片上、毛细管中、核酸结合表面上或珠子上（尤其是微阵列中或芯片上）的微孔或纳米孔。本文所述的方法特别适用于与基于阵列的系统一起使用，包括但不限于商业化的数字pcr平台，诸如来自fluidigm的基于微孔芯片的biomark
®ꢀ
dpcr以及来自lifetechnologies的基于通孔的quantstudio 12k flex dpcr和3d dpcr。基于微流体芯片的dpcr可具有多达每个面板数百个分区。quantstudio 12k dpcr在openarray
®
板上执行数字pcr分析，该板包含每个子阵列64个分区以及总共48个子阵列，相当于每个阵列总共3072个分区。
51.通常，可通过使用更大数量的分区来提高通过dpcr进行的确定的准确度以及更重要地精确度。人们可使用大约100个至200个、200个至300个、300个至400个、700个或更多个分区，其用于通过pcr来确定所讨论的量或浓度。在特定实施例中，dpcr在至少100个分区，特别是至少1,000个分区，尤其是至少5,000个分区中等同地实施。在具体实施例中，dpcr在至少10,000个分区，特别是至少50,000个分区，尤其是至少100,000个分区中等同地实施。
52.例如，dpcr在具有至少100个至100,000个之间的分区（例如，至少1,000个至100,000个之间的反应位点，或至少10,000个至100,000个之间的反应位点）的阵列中等同地实施。
53.本文所述的方法在被配置为进行数字核酸扩增反应的实验室仪器或系统中执行。如本文所用，术语“核酸扩增反应”涉及分子生物学中用于将靶dna片段（分析物）的单个拷贝或几个拷贝扩增至可检测量的dna片段拷贝的方法或反应，其包括与聚合酶的温度依赖性反应的重复循环。每个循环可至少包括变性阶段（例如95℃持续30秒）、退火阶段（例如65℃持续30秒）和延伸阶段（例如72℃持续2分钟）。dpcr板可与热电元件热接触，以将样品架加热和/或冷却至不同阶段的预定温度。通常，核酸扩增反应包括20次至40次重复循环，并且在核酸扩增反应完成后，通过检测器测量从dpcr板中的反应体积发出的光的信号强度。基于测量到的信号光强度，可确定样品中核酸的存在。
54.用于进行核酸扩增反应的实验室仪器是本领域公知的，并且可包括以下组件中的一个或多个组件（代表性实验室仪器200在图2中示意性地示出）：i. 样品制备模块201，其可以为实验室仪器或单独系统的组件，包括移液装置，该移液装置用于将样品和/或试剂移液到dpcr板202中，并将样品分区到dpcr板中的阵列203中的一个或多个反应体积中；ii. dpcr板支撑/处理模块204，其将实验室仪器内的dpcr板从一个模块运送到另一个模块；iii. 热循环模块205，其包括用于在扩增反应期间加热和/或冷却dpcr板的热电元件；iv. 检测模块206，其包括光源和光检测器，该光源被配置为朝dpcr板（或其子区段）发射光，该光检测器被配置为测量从dpcr板（或其子区段）发射的光的信号光强度；以及
v. 控制装置207，例如，包括处理器208的任何物理或虚拟处理装置，其被配置为以这样的方式控制实验室仪器及其组件，使得通过实验室仪器进行样品分析步骤。
55.样品制备模块可被容纳在实验室仪器的壳体内，或者它可以是未被容纳在实验室仪器壳体内的单独的、独立的装置。在其中样品制备模块为单独的装置的实施例中，在样品制备模块中制备dpcr板，然后将该板运送（自动地或手动地）到实验室仪器内的dpcr板支撑/处理模块204。
56.任选地，控制装置可接收来自数据管理单元的有关需要对特定样品执行哪些步骤的信息。例如，控制装置的处理器可以体现为可编程逻辑控制器，该可编程逻辑控制器适于执行计算机可读程序，该计算机可读程序设有执行实验室仪器的操作的指令。如本文所述，一种操作是进行用于检测dpcr系统中的反应体积偏差的方法。
57.上述实验室仪器的一个或多个组件示出在例如美国专利申请号20080160525；美国专利号10,564,102；美国专利公开号20180045641a1；欧洲专利号3299471b1；美国专利公开号20180147574a1；以及美国专利公开号20180087090a1中。这些出版物中的每一个的公开内容都通过引用其整体并入本文。
58.此外，本公开设想了一种包括指令的计算机程序产品，该指令致使本文所述的实验室仪器执行如本文所述的检测dpcr板中的反应体积偏差的方法的步骤。此外，本公开还提供了一种计算机可读介质，该计算机可读介质具有存储在其上的计算机程序产品，该计算机程序产品包含指令，该指令致使如本文所述的实验室仪器执行如本文所述的检测反应体积偏差的方法的步骤。
59.本说明书描述的主题和操作的实施例可以在数字电子电路，或在计算机软件、固件或硬件中实现，包括本说明书公开的结构及其类似结构，或它们中的一个或多个组合。本说明书所述主题的实施例可作为一个或多个计算机程序来实现，即作为一个或多个计算机程序指令模块来实现，为由数据处理设备执行，或控制数据处理设备的操作，所述一个或多个计算机程序指令模块可在计算机存储介质上编码。模块可包括由处理器执行的逻辑。本文所使用的“逻辑”是指具有任何形式的可影响处理器操作的指令信号和/或数据的信息。软件是逻辑的一个实例。
60.计算机存储介质可以是或可包含在计算机可读存储设备、计算机可读存储基片、随机或串行存取存储器阵列或设备，或它们的一个或多个组合中。此外，尽管计算机存储介质不是传播信号，但它可以是在人工生成的传播信号中编码的计算机程序指令的源或目的。所述计算机存储介质也可以是或可包含在一个或多个单独的物理组件或介质（如多个cd、磁盘或其他存储设备）中。本说明书中所述的操作可以以由数据处理设备对存储在一个或多个计算机可读存储设备上或从其他来源接收的数据进行的操作来实现。
61.术语“编程处理器”涵盖处理数据的各种设备、装置和机器，例如包括可编程微处理器、计算机、芯片上系统、或上述的多个或组合。所述设备可以包括特殊用途的逻辑电路，如fpga（现场可编程门阵列）或asic（特定用途集成电路）。除硬件外，所述设备还可以包括为所述有关计算机程序创建执行环境的代码，例如，构成处理器固件、协议栈、数据库管理系统、操作系统、跨平台运行时环境、虚拟机或它们的一个或多个组合的代码。所述设备和执行环境可以实现各种不同的计算模型基础架构，例如，网络服务、分布式计算和网格计算基础架构。
(编辑), molecular biology and biotechnology: a comprehensive desk reference, vch publishers, inc. 出版, 1995 (isbn 1-56081-569-8)中。
68.本公开不限于本文所述的特定方法学、方案和试剂，因为它们可以变化。尽管在本公开的实践中可使用与本文所述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料，但本文描述了特定的方法和材料。此外，本文所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，并不旨在限制本公开的范围。
69.如在本文和所附权利要求书中所用，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代物，除非上下文另外明确规定。类似地，词语“包括”、“包含”和“涵盖”应被解释为包容性而非排他性。同样，除非上下文另有明确指示，否则词语“或”旨在包括“和”。术语“多个”是指两个或更多个。
70.前面的描述旨在示出本公开的各种实施例。因此，所讨论的具体修改不应被解释为对本公开的范围的限制。对于本领域技术人员将显而易见的是，在不脱离本公开的范围的情况下，可做出各种等同形式、改变和修改，并且因此应当理解，此类等同实施例应被包括在本文中。
71.本文引用了各种出版物，其公开内容以引用其整体的方式被并入。
技术特征：
1.一种用于检测数字聚合酶链反应(dpcr)测定中的反应体积偏差的方法，其中所述dpcr测定包括量化分区的阵列中的目标核酸的量或浓度，所述方法包括：(a) 使用利用核函数进行的卷积来跨所述阵列内的(x, y)坐标组合光信号，其中每个分区被分配卷积值；(b) 通过将每个分区的所述卷积值与阈值卷积值进行比较来识别有效分区和无效分区；并且可选地，(c) 使在步骤(b)中收集的数据经历一个或多个附加步骤，所述一个或多个附加步骤包括：聚类操作和形态学图像处理操作。2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括：使在步骤(b)中收集的数据经历形态学图像处理操作，包括膨胀、腐蚀以及它们的组合。3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括：使在步骤(b)中收集的数据经历包括有效修整和/或无效修整的聚类。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中无效分区具有低于所述阈值卷积值的卷积值，并且有效分区具有高于所述阈值卷积值的卷积值。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述阵列包括多个通道，并且步骤(a)进一步包括：通过usechannel标记来确定在所述方法中要使用所述多个通道中的哪个通道或哪些通道，。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(a)进一步包括应用距离函数的核函数，其包括：。7.根据权利要求6所述的方法，其中z表示第一分区的(x, y)坐标的集合，并且z的卷积为：。8.根据权利要求7所述的方法，其中如果为空集，则针对所述空集的输出被设定为在所述卷积的范围之外的默认值。9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述卷积阈值基于所述阵列的所选择的参考区域内的卷积值的集合。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述所选择的参考区域选自竖直参考区域i、水平参考区域j以及它们的组合，其中max x和max y为所述竖直参考区域和/或所述水平参考区域中的分区的最大x坐标和最大y坐标，(a) 所述竖直参考区域i被表示为；(b) 所述水平参考区域j被表示为，并且对于每个竖直参考区域和/或每个水平参考区域而言，所述方法进一步包括：计算所述竖直参考区域和/或所述水平参考区域的有效卷积值的平均值，并且将具有第二高平均卷积值的所述竖直参考区域和/或所述水平参考区域识别为所述所选择的参考区域。11.根据权利要求10所述的方法，其进一步包括：计算绝对中位差(mad)，所述mad被表达为()，并且排除默认卷积值以产生标准阈值：。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述方法进一步包括：如果mean(ref) > highconvolutionthreshold且mad(ref) < lowvariancethreshold，则使用替代的阈值，其中所述替代的阈值为：其中thresholdadjustmentfrac为用作所述替代的阈值的平均值的分数。13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中聚类包括路径连通，所述路径连通包括：(a) 对所述阵列中通过连续路径全都成对地彼此连接的分区进行分组，其中所述分组为簇，(b) 识别具有小于无效噪声阈值的大小的一个或多个簇，以及(c)将在步骤(b)中识别的簇指定为有效。14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括膨胀以去除边界空区。15.根据权利要求14所述的方法，其中对于具有坐标z的有效分区而言，如果存在具有的无效分区z'，则所述有效分区被指定为无效分区。16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中聚类包括路径连通，所述路径连通包括：(a) 对所述阵列中通过连续路径全都成对地彼此连接的分区进行分组，其中所述分组为簇，(b) 识别具有小于有效噪声阈值的大小的一个或多个簇，以及(c)将在步骤(b)中识别的簇指定为无效。17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括标记被识别为无效的分区。
18.一种用于确定样品中的目标核酸的量或浓度的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供疑似包含所述目标核酸的样品；(b)在包括分区的阵列的dpcr板中利用所述样品执行dpcr；(c)识别所述分区的阵列中的一个或多个有效分区；以及(d)将所述目标核酸的所述量或浓度计算为每有效分区体积的在步骤(b)中确定的核酸数。19.根据权利要求18所述的方法，其中所述方法进一步包括：确定在步骤(c)中识别的所述一个或多个有效分区中的目标核酸的拷贝数n
c
，并且将n
c
除以所述有效分区体积。20.一种实验室仪器，其适于执行根据前述权利要求中任一项所述的方法的步骤。21.一种包括指令的计算机程序产品，所述指令致使实验室仪器执行根据权利要求1-19中任一项所述的方法的步骤。
技术总结
本公开涉及一种用于检测数字聚合酶链反应(dPCR)中的反应体积偏差的方法，并且涉及一种用于利用dPCR确定样品中的目标核酸的量或浓度的方法。所述方法使用利用核函数进行的卷积来分析光学图像，其中每个分区被分配与阈值卷积值进行比较的卷积值。卷积值进行比较的卷积值。卷积值进行比较的卷积值。
